噬菌体展示技术及其在药物开发中的应用

噬菌体表面展示技术(Phage D isplay T echn iques,PDT)是二十世纪八十年代逐步建立并发展起来的一项新技术。它以噬菌体或噬粒为载体,使外源肽或蛋白基因与噬菌体表面特定蛋白基因在其表面进行融合表达,进而通过亲和富集法筛选表达有特异肽或蛋白质的噬菌体,它实现了基因型和表型的一对一转换,提供了高效率的筛选系统,噬菌体展示技术是真正第一个用于体外高通量筛选的技术方法。利用噬菌体表面展示技术可以构建抗体库、随机肽库、蛋白质突变体库和cDNA文库,从而广泛用于单克隆抗体的筛选、先导化合物的筛选、疫苗的研制,改造和提高蛋白类药物、酶和抗体的生物学和免疫学属性,尤其是在抗原表位分析、受体与配体结合位点确定等分子间识别机制的研究方面,具有广阔的应用前景。     

人源性肺癌噬菌体展示抗体库的构建

目的应用噬菌体展示技术,构建天然人源抗肺癌噬菌体抗体组合文库,筛选能与肺癌细胞特异结合的抗体。方法用RNA提取试剂盒提取淋巴细胞RNA,以Oligo DT为引物反转录合成cDNA,以半套式PCR扩增轻链和重链可变区抗体基因并重组到原核表达载体中,通过噬菌体外壳蛋白形成融合蛋白,形成噬菌体抗体组合文库。结果电泳显示扩增的mRNA有清晰的28s、18s和5.8s的条带,600~700bp片段者为重组克隆;噬菌体展示抗体库大小在108~107之间;优化电转化条件,最终得到库容为1.2×108cfu,双链重组率为41%的抗体库。结论成功构建人源抗肺癌噬菌体展示文库,为下一步筛选具有肺癌细胞特异亲和力的人源性单克隆抗体奠定了基础。     

应用核糖体展示技术高效筛选人源抗IgE单链抗体

本研究从哮喘患者外周血分离淋巴细胞、提取总mRNA,采用RT-PCR技术分别构建重链可变区VH(variable region of heavy chain)和轻链可变区VL(variable region of light chain)cDNA库,然后通过连接肽(Gly4Ser)3和特定引物将VH和VL cDNA基因组装成人源单链抗体(scFv)核糖体展示模板基因库。应用兔网织红细胞核糖体展示技术,单引物原位反转录技术,经3轮展示富集并回收针对人源IgE蛋白(免疫球蛋白E)的目的单链抗体基因;回收的抗体基因经双酶切后与pET22b(+)载体连接,转化至E.coli Rosseta(DE3)宿主细胞,应用菌落PCR结合Dot blotting技术快速鉴定阳性克隆,抗原ELISA法进一步鉴定阳性克隆。VH和VL基因库得到正确的构建,长度分别为400和710 bp,库容为1013。核糖体展示模板构建正确,长度为1 100 bp。该基因库经过3轮针对IgE蛋白的核糖体展示,目的基因得到了有效富集和回收。经过高效克隆、表达和鉴定,确定1株针对人IgE蛋白显示最强亲和力的阳性克隆菌pET-IgE-6。经测序和序列分析证实该单链抗体为人源抗体,序列未见国内外报道。结果表明,采用患者外周血构建人源抗体基因库,结合核糖体展示技术,可以成功获得高亲和力的人源单链抗体分子。该技术路线为快速获得具有药用价值的人源抗体提供了参考。     

电离辐照损伤对小鼠脾脏组织核糖体信号通路的影响

目的从比较蛋白质组学的角度,分析电离辐照损伤组小鼠与正常组小鼠脾脏组织差异蛋白质的表达情况,对差异蛋白所涉及的信号通路进行分析,从而阐明电离辐照对小鼠脾脏组织的损伤机制。方法采用5 Gy ~(60)Coγ射线照射小鼠,构建小鼠电离辐照损伤模型,提取电离辐照组小鼠和正常组小鼠的脾脏组织,利用ITRAQ联合LC-MS/MS技术,筛选出两组小鼠脾脏组织的差异蛋白质。结果 KEGG Pathway富集分析共鉴定到17条生物信号通路(P <0. 05),其中富集在核糖体信号通路的差异蛋白质有37个,其中有36个差异蛋白质表达下调,1个差异蛋白质表达上调。这些通路涉及核糖体蛋白、60S核糖体蛋白、40S核糖体蛋白等的多个亚基蛋白,这些蛋白主要参与蛋白质的翻译及核糖体的结构组成等生物过程。结论电离辐照导致小鼠脾脏组织核糖体信号通路所涉及的37个差异蛋白中,有36个差异蛋白表达下调,1个差异蛋白表达上调,导致脾脏组织蛋白质合成障碍是电离辐照损伤的重要机制。     

全人源抗体基因库的构建及抗表皮生长因子受体单链抗体的筛选

目的 从肿瘤患者外周血中构建全人源单链可变区抗体基因库,并采用真核核糖体展示技术高效筛选全人源抗表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)单链抗体.方法 采用PCR技术从52例晚期肿瘤患者外周血中构建大容量的全人源抗体基因库.针对EGFR抗原靶标,应用真核核糖体展示技术对该基因库进行高效富集筛选.通过大肠埃希菌表达体系对回收的基因库进行克隆、表达,并鉴定抗体活性.结果 构建的全人源抗体基因库库容估算为4.3×1013分子.对该基因库进行3轮富集筛选后,获得EGFR富集的单链抗体基因库.对回收基因库进行克隆、表达,并随机鉴定了49个克隆,获得结合力为108～107mol/L的2株全人源抗EGFR单链抗体.结论 利用肿瘤患者外周血,结合核糖体展示技术可以较快获得具有医用价值的全人源单链抗体.     

基于特异性结合多肽ZS-1的肺癌新肿瘤标志物的筛选

目的：利用本实验室已获得的与肺癌特异性结合的十二肽ZS-1（EHMALTYPFRPP）从人类肺癌cDNA文库中筛选出肺癌相关标志物,并进行初步确认,为肺癌的临床早期诊断和靶向治疗奠定基础。方法：本实验以ZS-1为探针,通过将偶联生物素的多肽ZS-1固化在亲和素处理的酶标板,筛选人类肺癌cDNA噬菌体展示文库,经过三轮减性筛选后,挑取与ZS-1特异性结合的噬菌体单克隆、扩增、纯化,再通过PCR技术扩增、产物纯化后,进行DNA测序,测序结果经过生物信息学分析,随后采用组织芯片技术对相关生物大分子进行了检测。结果：通过生物信息学分析首次发现与ZS-1结合的肺癌细胞膜受体蛋白为KIAA1199,随后以KIAA199抗体检测人肺癌组织芯片证实,KIAA1199的阳性检出率为32.8%。结论：从人类肺癌cDNA噬菌体展示文库中筛选出潜在的肺癌肿瘤标志物KIAA1199,为肺癌的早期诊治奠定基础。     

噬菌体展示库筛选冠状病毒刺突蛋白抗体

目的 筛选特异性结合冠状病毒刺突蛋白（简称S蛋白）抗原的特异性抗体。方法 根据冠状病毒S蛋白家族数据库,合成保守序列,分子克隆连接到pet-22原核表达载体,纯化蛋白免疫小鼠产生相应的多克隆抗体,利用噬菌体展示技术提取免疫后小鼠脾脏制备噬菌体抗体scfv展示库,经过高通量筛选得到对S蛋白抗原具有高亲和力和强特异性的抗体片段。结果 通过合成的冠状病毒S蛋白糖蛋白亚基CoV＿Spike＿S1-S2＿S2制备了抗体scfv噬菌体展示库,筛选出能与冠状病毒S蛋白特异性结合的单克隆抗体scfv片段。结论 构建的小鼠抗Cov-Spike的抗体scfv库可筛选到特异性结合冠状病毒S蛋白抗原的特异性抗体,为进一步筛选、鉴定具有潜在防治冠状病毒感染的抗体系列药物提供了可行的方法。     

连翘核糖体蛋白FsRS15基因的克隆与序列分析

<正>连翘[Forsythia suspensa(Thunb.)Vahl]为木犀科连翘属植物,属常用大宗药材,主产于山西、陕西、河南和安徽等地。连翘的根皮和果实均可入药,常用部位为果实。核糖体是细胞内参与蛋白质合成的重要细胞器,在植物中,核糖体蛋白基因的突变影响胚的生存和植物发育[1,2]。     

噬菌体展示技术及其在药物筛选中的应用

噬菌体展示文库是目前广泛应用于生物医学领域的较为重要的分子工具，近年来相关研究进展迅速，目前该技术以具有库容量大、结合特异性强等特点而成为药物筛选的实用性工具。本文以噬菌体展示技术的原理为出发点，对噬菌体载体的分子生物学、噬菌体展示文库的构建和筛选及其在药物筛选中的应用进行了综述。     

噬菌体展示筛选人源细胞黏附分子L1结构域抗体及其体外实验研究

目的使用噬菌体展示技术筛选人源细胞黏附分子L1结构域抗体并体外观察其对神经来源细胞信号通路及细胞聚集的影响。方法以L1纤黏连蛋白FN2-3区肽段为抗原,利用噬菌体抗体库(DAb library)筛选并纯化相应人源结构域抗体,并通过酶联免疫吸附法(ELISA)及免疫荧光观察抗体与抗原结合特性。给予神经来源SK-N-SH细胞抗体,使用蛋白质印迹(Western blot)观察24 h时其对L1下游信号通路Erk及Akt1激活的影响。使用结晶紫进行细胞染色观察抗体对细胞聚集的影响。结果成功筛选出与L1FN2-3区肽段结合的结构域抗体H2-1,与SK-N-SH细胞内源性L1结合良好。与溶剂对照组相比,该抗体可有效促进SK-NSH细胞中L1下游信号分子Erk1/2及Akt1磷酸化激活(分别为P<0.01和P<0.05),并可促进神经突生长及神经细胞聚集。结论 L1激动型结构域抗体可激活L1相关信号分子,促进神经突生长等作用,具有进一步实验治疗脊髓损伤等神经系统创伤性疾病的研究价值。