枯草杆菌重组修复试验在环境致突变剂研究中的应用

为了有效地检出环境中的致突变剂和致癌剂,作者建立了枯草杆菌重组修复试验方法。方法原理是据根遗传性DNA重组修复能力缺陷型菌株M_(45)在受到DNA损伤剂作用时较野生型菌株H_(17)易受抑制和死亡。因此通过检测被检化学物对两菌株抑菌效应的差别,就能判明是否有DNA损伤。重组修复试验的阳性结果只表示DNA损伤,要结合其他的生物检测方法,以确定DNA损伤剂的致突变特性。     

彗星试验对4种化学物质诱导人淋巴细胞DNA损伤的检测

目的验证彗星试验可否用于检测不同类型化学诱变剂诱发的DNA损伤。方法人淋巴细胞经4-硝基喹啉氧化物(4-NQO,拟紫外线诱变剂)、甲基甲烷磺酸酯(MMS,烷化剂)、博来霉素(BLM,拟X射线诱变剂)和丝裂霉素C(MMC,DNA交联损伤剂)染毒3h,再培养0h或21h,然后用彗星试验检测这4种化合物所诱发的DNA单链断裂(SSB)。结果彗星试验能立即检出4-NQO、MMS和BLM诱发的SSB,并具有剂量-效应关系(P<0.01),在21hDNA损伤程度减轻(与0h比较,P<0.01)。MMC诱发的DNA损伤在染毒后21h才被检出,并有剂量-效应关系(P<0.01)。结论虽然这4种化学诱变剂的作用机制不同,但彗星试验仍能检测出他们诱发人淋巴细胞DNA损伤的效应。     

DNA氧化损伤标志物8-羟基脱氧鸟苷及其检测

活性氧基团引起的氧化损伤在许多慢性疾病中起着重要作用，8-羟基脱氧鸟苷(8-hydroxy-2’-de-axyguanine,8-OHdG)是DNA氧化损伤的修饰产物之一，可以通过高灵敏度，高选择性的检测手段来检测，目前已成为DNA氧化损伤中最常采用的生物标志物(Biomarker)。本文主要介绍其来源、检测方法及在医学上的应用。     

彗星试验和γH2AX分析技术在辐射所致DNA损伤检测中的应用

放射技术的广泛应用和核能事业的发展,使辐射成为当前环境中不可忽视的物理危害因素,而2011年日本核能泄露事件使之再次成为社会关注的焦点.现有研究发现一定剂量的辐射会导致生物体DNA损伤,因此,DNA损伤效应的检测正成为目前辐射安全性评价的重要指标之一,对人类疾病与伤害的防治具有重要意义.DNA损伤常规理化检测方法包括密度梯度离心、高压液相层析、聚合酶链反应、荧光原位杂交等.在辐射致DNA损伤检测中最常采用的方法是彗星试验(comet assay),同时,γH2AX分析技术以其强特异性和高敏感性,也逐渐在该领域获得应用.近十余年,国内外应用γH2AX分析技术检测辐射致DNA损伤的文献达两百余篇,其中国内文献近30余篇,涉及彗星试验的文献则更多.本文主要就以上2种方法在辐射致DNA损伤检测中的应用进行简要分析与评价.     

基于GADD153启动子的环境致癌物快速筛选系统研究

[目的]构建快速检测环境中痕量致癌物DNA损伤效应的重组人肝细胞株。[方法]构建含生长抑制与DNA损伤基因153(GADD153)启动子和萤光素酶报告基因的重组稳定转染人肝肿瘤HepG2细胞;发光检测不同致癌物对稳定转染细胞的DNA损伤效应;同时RT-PCR检测内源性GADD153mRNA的表达;彗星试验(Cometassay)检测DNA的损伤效应。[结果]稳定转染GADD153-LUC细胞株可检出多环芳烃、芳香胺、重金属、农药等已知环境致癌物以及实际水样中的含量。检测结果与彗星试验结果相比,大多数检测下限均低于彗星试验的检测限,其中对苯并芘、氯化镉和2-氨基芴的检测灵敏度分别高于彗星试验1000、300和100倍;对Aems试验不敏感的重金属、四氯化碳、氟化钠等重组细胞株具有较高的检测灵敏性。10μmol/L的氯化镉可诱导内源性GADD153mRNA和萤光素酶活性表达增加,相关分析表明两者具有良好的相关性(r2=0.9539)。[结论]重组细胞株GADD153-LUC细胞可快速检测环境中痕量污染物的DNA损伤效应。     

ERCC2/XPD基因缺失对短波紫外线所致CHO细胞DNA损伤修复的影响

目的探讨核苷酸切除修复交叉互补基因2(excision repair cross complementation group 2/Xeroderma pigmentosum D,ERCC2/XPD)在短波紫外线(UVC)所致细胞DNA损伤与修复过程中的作用。方法采用中国仓鼠卵巢细胞系(CHO)野生型AA8及ERCC2蛋白表达缺失型UV5构建细胞对照模型。MTT法比较两种细胞经UVC处理后细胞抑制率的差别;彗星试验与Rad51免疫荧光试验检测经不同照射强度的UVC处理后修复1、3、6和24 h,不同细胞对UVC所致DNA损伤修复能力的差异。结果与野生型AA8相比,UV5对UVC所致DNA损伤更加敏感,细胞存活率降低(P0.05)。彗星试验和Rad51免疫荧光试验结果显示,UV5细胞DNA损伤程度较AA8严重,并且修复UVC所致DNA损伤的能力降低(P0.05)。结论 ERCC2/XPD基因缺失细胞DNA损伤修复能力下降,说明ERCC2/XPD修复酶在UVC所致DNA损伤的切除修复过程中发挥重要作用。     

甲醛、三氯化铝、三氯乙烯混合物对吸入染毒小鼠的DNA损伤

[目的] 研究甲醛、三氯化铝、三氯乙烯(质量比为6：11：33)混合物对小鼠外周血DNA损伤程度及修复情况。[方法] 混合物静式吸入染毒，采用单细胞凝胶电泳方法检测不同剂量(4．12、8．25、16．5g／m^3)下不同染毒天数(4、9、11d)小鼠外周血白细胞DNA的损伤情况；检测一次染毒后(33g／m^3)不同时间小鼠外周血白细胞DNA的损伤情况。[结果] 染毒后小鼠外周血白细胞：DNA出现损伤，且损伤程度与染毒次数、染毒剂量具有一定相关性；一次染毒后短期内小鼠即呈现严重的外周血白细胞DNA损伤，72h后基本恢复正常水平。[结论] 甲醛、三氯化铝、三氯乙烯(质量比为6：11：33)混合物可诱发DNA损伤。     

单细胞凝胶电泳技术及其应用进展

单细胞凝胶电泳又称彗星试验 ,是一种在单细胞水平上检测DNA单、双链断裂和碱性不稳定位点的方法 ,具有敏感、稳定、快速的优点。近些年来 ,该方法广泛应用于DNA修复、遗传毒理、环境监测和细胞凋亡的研究。本文就彗星试验结合荧光原位杂交、检测DNA碱基氧化损伤、以及在染色、玻片储存和彗星图像分析方面的进展进行了综述     

饮水型砷暴露人群淋巴细胞DNA损伤影响因素分析

目的探讨饮水型砷暴露地区人体外周血淋巴细胞DNA的损伤。方法应用彗星试验,检测54例地砷病区有皮损患者(病例组)和51名无皮损者(对照组)外周血淋巴细胞DNA损伤水平。采集研究对象的尿液检测尿砷水平。调查研究对象年龄、性别、吸烟、饮酒、农药接触史等。结果病例组和对照组彗星尾长分别为(12.34±5.22),(7.35±3.67)μm,差异有统计学意义(P0.05);2组尿砷分别为(1.61±0.41),(1.52±0.55)ng/1 000 g肌酐,差异无统计学意义(P0.05);Logistic回归分析结果显示,吸烟和饮水年限为DNA损伤的危险因素。未发现饮酒对淋巴细胞DNA的损伤有影响。结论吸烟和饮水年限是DNA损伤的危险因素,彗星试验可作为砷污染地区人群健康监测的早期指标。     

鱼外周血彗星试验及其在多溴联苯醚污染水体中的运用

目的通过鱼外周血彗星试验方法的摸索,为地面水污染遗传毒性效应检测提供生物学试验手段。方法红鲫鱼环磷酰胺腹腔注射染毒,设1个对照组(磷酸盐缓冲液,PBS)和5个剂量组(环磷酰胺剂量分别为:12.50、25.00、50.00、100.00、200.00 mg/kg),分别在0、2、24、72 h尾静脉采血,彗星试验检测DNA损伤效应。分别于丰水期和枯水期,在轻污染区A、中污染区B、重污染区C采样,分别获取3尾该地鲫鱼,并以3尾实验室内驯养4周的鲫鱼作为阴性对照,进行鱼肉多溴联苯醚(PBDEs)定量分析及鱼外周血彗星试验。结果在给药后2 h时间点,即能在各剂量组引起DNA损伤效应,最大的DNA损伤效应(15.42±1.30)%出现在50.00 mg/kg剂量组、24 h时间点。重污染区C的鱼外周血细胞DNA损伤程度在丰水期和枯水期皆为最高,且显著高于对照组,差异有统计学意义(P0.01)。污染区B在丰水期与对照组相比,差异有统计学意义(P0.05)。鱼肉中PBDEs含量与预判断的污染程度相关。结论鱼外周血彗星试验是较为方便、直观、敏感的DNA损伤试验,可用于对多种污染物污染的水体进行生物学评价。     

氯乙烯致大鼠DNA损伤与肝代谢酶活性动态变化的研究

[目的]研究氯乙烯(VC)对大鼠肝细胞和外周血淋巴细胞DNA的损伤作用，及对VC代谢酶[谷胱甘肽硫转移酶(GST)、细胞色素P4502E1(CYP2E1)、乙醇脱氢酶(ADH)和乙醛脱氢酶(ALDH)]活性的影响；探索VC所致损伤的早期敏感检测指标。[方法]大鼠染毒12周，分别在第3、6、9和12周处死动物，DNA损伤采用单细胞凝胶电泳(彗星试验)法，代谢酶活性测定采用分光光度法。[结果]彗星细胞数目随染毒剂量和染毒时间的增加而增加，肝细胞DNA损伤细胞百分率第12周中剂量组和高剂量组分别为12.38％和17.88％，外周血淋巴细胞DNA损伤细胞百分率第3周高剂量组为7．33％，第12周中剂量组和高剂量组分别为16．25％和28、25％，均显著高于相应对照组，彗星细胞发生率与VC染毒剂量间存在显著相关关系。ALDH和CYP2E1活性随染毒时间和染毒剂量的增加发生改变，差异具显著性。肝细胞DNA损伤与CYP2EI活性相关。[结论]VC可导致肝细胞和外周血淋巴细胞DNA发生损伤，且存在剂量．反应和时间一效应关系；VC致肝细胞DNA损伤与CYP2E1代谢酶活性相关。彗星细胞率可作为VC所致肝脏损伤的早期检测指标。     

DNA损伤检测—单细胞凝胶电泳技术的研究

单细胞凝胶电泳(SCGE)又称为彗星实验,是一种可以在单个细胞水平上检测DNA断裂的技术。近年来该技术被广泛应用于特定的DNA损伤、DNA特异性染色、DNA修复、遗传毒理、环境生物监测等方面的研究。在前人的基础上对该实验方法做了进一步的研究和改进,使改进后的方法更加快速简捷、经济可行。     

四氯对苯醌对DNA损伤的电化学发光法检测研究

目的建立快速、灵敏检测四氯对苯醌(TCBQ)对DNA损伤的电化学发光法(ECL)。方法将带正电荷的聚二甲基二烯丙基氯化铵(PDDA)和带负电荷的小牛胸腺双链DNA(ds-DNA)层层自组装在玻碳电极(GCE)表面,制成DNA传感器,采用具有灵敏电化学发光特性的金属配合物二联吡啶二吡啶并[3,2-a:2’,3’-c]吩嗪钌([Ru(bpy)2(dppz)]2+,简称为Ru-dppz)作为DNA探针分子。当DNA受损伤后,嵌入双链DNA膜中的Ru-dppz减少,ECL信号减弱,由此可以检测DNA受损程度。结果未受损受的DNA具有完整的双螺旋结构,可以产生非常强的ECL信号。DDA/DNA修饰膜在100μmol/L TCBQ溶液或100μmol/L TCBQ-2.0 mmol/L H2O2溶液中温育一段时间后,ECL信号明显减弱。结论该方法能快速、灵敏检测由TCBQ单独与DNA形成共价键所造成的DNA损伤,及TCBQ与H2O2反应生成的羟基自由基(·OH)对DNA造成的氧化性损伤。     

8-羟基脱氧鸟苷在氧化应激与儿童相关疾病的研究

8-羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)是DNA氧化损伤产物之一。8-OHdG水平可反映机体氧化损伤程度,是目前国际上公认的评价DNA氧化损伤和氧化应激(OS)状态的新型指标和生物标志物。笔者拟就8-OHdG的主要检测方法及其在OS与儿童相关疾病的最新研究进展进行阐述,旨在为临床对该类疾病的诊断与治疗提供参考依据。     

急性白血病化疗后凋亡慧星的检测及意义

碱性单细胞凝胶电泳,又称慧星试验(Comet assay)是近年来发展起来的一种简便、快速、敏感性很高的检测单细胞DNA断裂损伤的方法。将少量细胞悬浮于载玻片上的一薄层凝胶内,裂解后在碱性条件下电泳,损伤的DNA从核中溢出,经溴乙锭染色后,在荧光显微镜下可见慧星状图案,移出核外的受损DNA形成慧星尾部,未损伤的DNA仍在核中保持球形构成慧星头部。细胞凋亡时,DNA在质膜损伤前断裂,这种断裂很容易被这种方法显示,称之为“凋亡慧星”,凋亡慧星的数量代表凋亡细胞的数量。体外实验证明,几乎所有的化疗药物都可以诱导细胞凋亡,快速而敏感的早期检测细胞凋亡的慧星试验是评价化疗药物敏感性和早期判断白血病化疗疗效的很好指标。     

微囊藻毒素-LR的DNA损伤作用研究

目的探讨微囊藻毒素LR(MCLR)在不引起细胞毒性剂量情况下,能否引起细胞的DNA损伤,同时比较了MCLR对人肝细胞株(HL7702)和KB细胞(人口腔表皮癌细胞)的作用情况。方法利用四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色(MTT)法测定细胞毒性,彗星试验检测细胞的DNA损伤。结果当MCLR在剂量为10～100μgL时,对这两种细胞活性无显著性影响,而HL7702细胞在30μgL时出现DNA损伤,且随着毒素剂量的增加,其DNA损伤更加明显。但在同等实验剂量下,未能见到KB细胞的DNA损伤。结论MCLR具有潜在的遗传毒性;且它导致的DNA损伤有具有胆汁酸转运系统的肝细胞系中表现出得更为显著。     

单细胞凝胶电泳实验技术经验之谈

单细胞凝胶电泳新技术，又名慧星试验（cometassay），是近年来发展起来的一种检测单个哺乳类细胞DNA断裂及鉴定化学物致突变性的方法，应用范围起来越广。对DNA损伤的敏感可检出0.1DNA断裂/109dalton。并可检测细胞凋亡（apoposi。）中的DNA断裂过程（致癌）。此方法简便，无需复杂的仪器设备。从采样到分析结果只需数小时，整个过程可在一个工作日内完成。它适应于有核细胞的检测，该方法是在核沉淀（nucleoidsedi－mentation）和光环测试（halassay）等检测技术的基础上演化而来，它不仅突破了传统短期测试方法的局限，而且由于碱性…     

彗星试验银染法的优化及验证

在彗星试验中寻找一种最佳染色效果的银染法 ,拟取代溴化乙啶 (EB)染色。对选出的银染法从固定、染色、显色、脱色、染色温度等各个方面进行多次试验 ,达到最佳染色效果后 ,将优化的银染法用于检测两类化合物 -重铬酸钾 (K2 Cr2 O7)和 1,2—二氯乙烷 (1,2—dichloroethane,DCE)对两种类型细胞—小鼠脾细胞、人外周血淋巴细胞的DNA损伤作用 ,并与EB染色比较灵敏度。结果显示优化后的银染法是在彗星试验中成功建立的非荧光染色法 ,该法染色清晰、持久、背景颜色浅、染色对比度好、染色效果满意 ,方法操作简便、价廉 ;该法可检测出化合物对细胞的DNA损伤作用 ,与EB染色有相同阳性检出阈 ,可染出EB染色无法染上的DNA小片段。所以在彗星试验中该银染法可以取代EB染色     

饮水氯化消毒副产物--3-氯-4-二氯甲基-5-羟基-2(5氢)-呋喃酮的DNA损伤作用研究

目的 研究饮水氯化消毒副产物——3—氯—4—二氯甲基—5—羟基—2(5氢)—呋喃酮(MX)的DNA损伤作用。方法 以人肝肿瘤细胞株HepG2为靶细胞，MX设10、30、100、300μmol／L(终浓度)4个剂量，以二甲基亚砜为溶剂对照，H2O2为阳性对照，应用单细胞凝胶电泳试验(彗星试验)研究MX对HepG2的DNA损伤作用。结果 MX在30、100、300μmol／L3个剂量均可引起HepG2 DNA链断裂，DNA迁移长度随MX浓度的增加而增加，且与溶剂对照相比差异均有显著性。结论 饮水氯化消毒副产物——MX对HepG2有明显的DNA损伤作用。     

燃汽油机动车尾气致核酸分子氧化损伤效应研究

目的：通过研究燃汽油机动车尾气成分，及其对DNA分子的氧化损伤，在分子生物学水平上探讨燃汽油机动车尾气污染物的遗传毒性效应与机制。方法：以DNA加合物8-羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)作为DNA氧化损伤的生物学标志物，用高压液相色谱-电化学检测(HPLC-EC)法对污染物染毒后的DNA中8-OHdG进行定量检测，通过气质联用法(GC-MS)进行有机成分分析和原子吸收法(AAS)对其进行无机元素分析，并从化学组成成分的角度探讨DNA氧化损伤的分子机理。结果：在燃汽油机动车尾气的颗粒物和挥发性有机物中分别检出有机污染物85种和46种，无机元素7种和5种。燃汽油机动车尾气颗粒物和挥发性有机物均可在体外直接诱导DNA氧化损伤，尾气颗粒物还可诱导大鼠肺组织DNA氧化损伤，并呈现一定的剂量—反应关系。结论：污染物直接以及间接的氧化作用，源于含有醌类、多酚等具有自氧化作用的化合物，不需要任何生物活化系统，在体外就可产生大量的活性氧自由基，并在金属离子的催化作用下进攻DNA的碱基形成8-OHdG，产生遗传毒性效应，而8-OHdG是DNA氧化损伤的较好的效应标志物。