一种新的内源性钠泵抑制因子前海葱苷原A样物质在牛体内 …

为了建立一种蟾蜍二烯羟酸内酯（ｂｕｆａｄｉｅｎｏｌｉｄｅｓ）前海葱苷原Ａ免疫方法，并对哺乳动物体内的前海葱苷原Ａ样物质进行检测，我们制备了兔和羊前海葱苷原Ａ抗体。利用ＥＬＩＳＡ法检测了一种新的内源性钠泵抑制因子前海葱苷原Ａ样物质在牛在肾上腺、丘脑、心脏、肾脏、肝脏、小脑、骨骼肌和血液中的分布。研究发现这种前海葱苷原Ａ样物质在肾上腺及下丘脑的含量高于其它腺体组织，其具有抑制人红细胞＾８６Ｒｂ摄取的特     

兔肠道大豆异黄酮还原菌株的分离鉴定及其转化特性

【目的】从兔新鲜粪样中分离对大豆异黄酮黄豆苷原和染料木素具有转化作用的特定细菌菌株。【方法】在厌氧工作站内对獭兔新鲜粪样进行梯度稀释后涂板,挑取单菌落与底物黄豆苷原和染料木素分别厌氧混合培养,用高效液相色谱检测底物被转化情况。【结果】分离得到一株对大豆异黄酮黄豆苷原和染料木素均具有转化作用的革兰氏阳性严格厌氧细菌菌株AUH-JLR41(KJ188150)。根据产物的高效液相保留时间、紫外吸收图谱和质谱分析结果,将菌株AUH-JLR41代谢底物黄豆苷原和染料木素生成的产物分别鉴定为二氢黄豆苷原和二氢染料木素。经手性高效液相系统检测,产物二氢黄豆苷原和二氢染料木素均呈现两个等面积物质峰,表明这两个产物的对映体过量率均为0。通过转化动态研究发现,菌株AUH-JLR41分别在底物黄豆苷原和染料木素加入48 h和72 h后将底物全部转化为产物,该菌株能转化底物黄豆苷原和染料木素的最大浓度均为0.6 mmol/L。经BLAST比对,菌株AUH-JLR41的16S r RNA基因序列与斯奈克氏菌属菌株Slackia equolifaciens DZE(EU377663)的相似性高达99.6%。【结论】兔肠道分离的斯奈克氏菌属菌株Slackia sp.AUH-JLR41在厌氧条件下能将大豆异黄酮黄豆苷原和染料木素分别还原为二氢黄豆苷原和二氢染料木素。     

新型α-半乳糖苷酶多克隆抗体的制备及特异性鉴定

目的：制备高效价、高特异性的新型α-半乳糖苷酶的兔多抗,并鉴定该抗体的特异性。方法：用脆弱类杆菌来源的基因重组α-半乳糖苷酶（纯度大于90％）免疫新西兰大白兔,获得α-半乳糖苷酶的兔抗血清,并经HiTrap rProteinA柱纯化获得高纯度的抗体;用间接ELISA法检测抗体效价,Western印迹评价抗体的特异性。结果：通过免疫法得到了α-半乳糖苷酶的兔多克隆抗体血清,抗体效价达1：1×10^6,经rProteinA柱纯化后获得了高效价、高纯度的抗体,Western印迹显示该抗体特异性地与新型α-半乳糖苷酶结合。结论：获得了新型α-半乳糖苷酶的高效价、高特异性的兔多克隆抗体,可用于血型转变过程中残留α-半乳糖苷酶含量的特异性检测。     

功能性抗HBsAg人—鼠嵌合抗体在昆虫细胞中的高效表达

经同源重组我们构建了同时含抗乙肝病毒表面抗原嵌合抗体重、轻链基因的双重组 ＢａｃＨＬ４．２。利用双重感染和双重组病毒感染秋粘虫Ｓｆ９细胞,ＳＤＳ－ＰＡＧＥ结果说明嵌合抗体重、轻链同时在胞内得到了表达。Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ分析表明两种情况均能在胞内组装成Ｈ２Ｌ２完整免疫球蛋白分子。ＥＬＩＳＡ和功能性免疫迷检测证明重组嵌合抗体与父本鼠源单抗ＯＨ３一样能特异性识别具有天然构象的ＨＢｓＡｇ,而不识别经     

锯缘青蟹主要过敏原的纯化与鉴定

以锯缘青蟹为研究对象,从免疫鉴定、分离纯化、抗体制备和免疫学分析等方面对其主要过敏原进行研究。首先利用过敏者血清的免疫印迹法,确定锯缘青蟹的主要过敏原为分子量约38kD的蛋白。然后通过制备丙酮粉、等电点沉淀、硫酸铵沉淀及加热处理对分子量为38kD的主要过敏蛋白进行了高度纯化。该蛋白的pI约为4.5,与虾的原肌球蛋白Pena1性质相近,证实了锯缘青蟹的主要过敏原为原肌球蛋白。通过免疫新西兰大白兔,制备了原肌球蛋白的抗血清,采用Protein A Sepharose亲和层析柱对动物抗体进行了纯化。该抗血清效价高,经4×105倍稀释后仍能与抗原进行反应。该抗体与甲壳类动物及软体动物的原肌球蛋白具有较强的免疫交叉反应,可用于食品过敏原检测。       

内源性洋地黄样物质

近年来发现人和动物体内存在一种内源性洋地黄样物质,该物质对Na-K-ATP 酶能竞争抑制[~3H]-哇巴因与Na-K-ATP 酶的结合,能与地高辛抗体产生交叉结合反应。它具有利尿、排钠、强心和收缩血管等作用。该物质可能产生于下丘脑,高钠摄入和血容量扩张为其释放的有效刺激。内源性洋地黄样物质的性质和作用,与排钠激素、内源性钠泵抑制因子以及血管敏化因子等相似,可能是同一种或同一类物质。内源性洋地黄样物质参与高血压发病机理。     

PLA2R-IgG间接荧光定量免疫层析分析的构建与应用

目的 血清抗磷脂酶A2受体抗体IgG (PLA2R-IgG)水平是诊断和治疗特发性膜性肾病（IMN）的重要依据,而目前国内外常规检测手段主要是酶免法。为提升检测的便捷性,同时满足灵敏、宽量程分析需求,本研究构建了一种新的PLA2R-IgG检测技术。方法 采用包裹铕元素的微球示踪,对反应步骤进行选择,对微球制备液的p H、微球-抗体反应比例和反应时间优化,本文基于间接法构建了PLA2R-IgG的荧光定量免疫层析检测方法,并进行了初步临床评价。结果 本方法的灵敏度达0.7 RU/ml,标准曲线方程为y=0.771x-1.437,相关系数0.995,线性测量范围为0.7～1 500 RU/ml,回收率为86.27%～98.98%,平均批内变异系数为8.13%,交叉反应率均小于0.1%,试剂37℃储存10 d稳定。本方法与市售酶免试剂盒相关性为0.953,阴阳性判断一致,对IMN的检出率为76.9%。结论 采用两步法反应的PLA2R-IgG间接荧光定量免疫层析分析,快速、灵敏、准确,具有临床实用性。     

重组人FS315C末端蛋白表达及其抗体制备

构建FS315C末端肽原核表达载体pGEX-FS315C,表达重组人卵泡抑素315(FS315)C末端肽,制备抗FS315C末端抗体。实验结果显示,重组pGEX-FS315C表达质粒在E.coli BL21中高表达GST-FS315C融合蛋白,采用亲和层析与电泳纯化GST-FS315C免疫家兔,获得抗FS315C末端抗体,Western blot检测显示该抗体只与FS315结合,而与FS288无交叉反应。ELISA检测显示抗FS315C末端抗体与FS315特异结合,而与FS288、inhibin及activin A等蛋白均无交叉反应。利用该抗体进行的免疫组化染色显示巨噬细胞FS表达阳性,与以往报道一致。实验采用重组GST-FS315C免疫家兔,成功地制备了抗FS315C末端特异抗体。     

抗肺炎支原体卵黄抗体的制备及其免疫特性

目的制备抗肺炎支原体卵黄抗体,并研究其免疫特异性。方法以超声粉碎法制备肺炎支原体抗原;以ELISA法测定卵黄抗体的效价及免疫特异性;以水稀释法联合疏水层析的方法分离纯化卵黄抗体;应用SDS-PAGE法测定分子量及鉴定抗体纯度;改良Lowry法测定蛋白含量。结果低、高剂量组均诱导母鸡产生有效免疫应答,高剂量组免疫效价高于低剂量组。高剂量组于初免疫后约50d抗体效价达高峰,持续约2个月;而低剂量组在初免疫后约60d抗体效价达高峰,持续约1个月。之后效价逐渐下降,在免疫约120d,高剂量组由13log2下降到10log2;而低剂量组则由11log2下降到7log2。以水稀释法联合疏水层析法制备了电泳纯抗肺炎支原体IgY,分子量约178KD,平均每1ml卵黄液可获得较纯抗体6.4mg。制备的IgY与肺炎支原体具有较高特异性,与解脲支原体和人型支原体无明显交叉反应,与生殖支原体有轻度的交叉反应。结论本研究初步制备了抗肺炎支原体卵黄抗体,为肺炎支原体的防治与检测提供新的途径。     

快速检测成人腹泻轮状病毒(ADRV)抗原和抗体的研究

本文报道应用反相间接血凝和间接血凝试验技术快速检测ADRV抗原和抗体,一般在60分钟左右作出诊断。用ELISA方法和协同凝集试验作对照,结果一致。本实验与其它肠道病毒不发生交叉凝集反应,与菌痢、肠炎病人粪便和正常人粪便标本也不发生非特异性反应。实验准确可靠。本实验用间接血凝试验技术快速检测了ADRV抗体,观察了流行性腹泻病人血清中ADRV抗体持续时间。发现流行性腹泻患者发病后ADRV抗体存在半年以上,八个月有不同程度的下降,流行地区的健康人的ADRV抗体水平占33％左右,非流行地区正常人的ADRV抗体占11.3％左右。并用血凝抑制试验检测ADRV抗体,与小儿轮状病毒抗体无交叉反应。本试验对流行性腹泻的流行病学研究和临床诊断具有实用意义。     

植物28kD蛋白的纯化及部分性质研究

经丙酮粉、硫酸铵分级沉淀和阴离子交换层析等方法,首次从玉米花粉细胞质粗提物中纯化了一种具有ＡＴＰａｓｅ活性的可溶性蛋白。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ测得分子量为２８ｋＤ,ＩＥＦ－ＰＡＧＥ测得等电点为８．３。免疫印迹鉴定结果表明该酶蛋白与抗牛脑动蛋白或动力蛋白的抗体无免疫交叉反应。最大紫外吸收波长为２７８ｎｍ,并作了ＣＤ谱分析。底物特异性研究表明：ＡＴＰａｓｅ水解活性最高。药理学研究表明：该酶蛋白可被矾酸钠强烈抑制,但对ＮＥＭ基本不敏感,氟化钠可使酶活力丧失５０％左右,寡霉素、硝酸钾及乌本苷对酶活力没有抑制作用．     

拟南芥甘露糖苷酶Ⅰ和人 N-乙酰葡萄糖胺转移酶Ⅰ的原核表达及其多克隆抗体制备

目的：在大肠杆菌中分别重组表达拟南芥甘露糖苷酶Ⅰ（ATMDSI）和人N-乙酰葡萄糖胺转移酶I（HsGnTI）,制备其多克隆抗体,为基因表达鉴定提供检测抗体。方法：用PCR方法克隆ATMDSI、HsGnTI基因片段,连接至pBV220表达载体后转化大肠杆菌DH5α,获得表达菌株,通过42℃升温诱导表达,制备纯化ATMDSI和HsGnTI;纯化的蛋白以80μs／ks的剂量免疫大耳白兔,经3次免疫后,采集血清制各其相应的多克隆抗体;采用Western印迹检测多克隆抗体的特异性。结果：获得ATMDSI和HsGnTI基因片段,并构建了其相应的原核表达载体pBV220-ATMDSI、pBV220-HsGnTI,在大肠杆菌中表达了重组ATMDSI和HsGnTI,SDS-PAGE分析显示其相对分子质量分别为45．3×10^3和46．9×10^3,与理论值一致;用纯化的蛋白免疫大耳白兔后制备了抗ATMDSI、HsGnTI多克隆抗体,Western印迹结果证明该抗体具有较高的特异性。结论：获得了特异性较高的抗ATMDSI、HsGnTI多克隆抗体血清,为甘露糖苷酶Ⅰ和N-乙酰葡萄糖胺转移酶Ⅰ的研究提供了检测抗体。     

双歧杆菌抗体制备方法的探讨

本文对双歧杆菌抗体的制备方法进行了探讨,并建立了检测双歧杆菌抗体的ＥＬＩＳＡ方法。结果表明,采用完整菌体、粉碎菌体、脂磷壁酸粗提物,获得的抗体效价均很低。先用活的卡介苗对动物进行多克隆刺激,再用活的双歧杆菌加福氏不完全佐剂获得的双歧杆菌抗体效价达１：２５６０,该抗体对双歧杆菌属的菌种能起免疫反应,与所试的其它种属细菌无交叉反应。此外,将免疫过双歧杆菌的小鼠用福氏不完全佐剂和ＳＰ２／Ｏ骨髓瘤细胞诱生腹水,从腹水中测得双歧杆菌抗体效价为１：１０００。此过程类似于单克隆抗体的生产过程,可用于制备大量的双歧杆菌多克隆抗体。     

兼性肠球菌Enterococcus hirae AUH-HM195对黄豆苷原的开环转化

摘要：【目的】从褐马鸡粪样中分离对大豆异黄酮黄豆苷原具有转化作用的功能微生物菌株。【方法】在厌氧工作站内对褐马鸡新鲜粪样进行梯度稀释后涂板,从板上挑取单菌落与底物黄豆苷原厌氧混合培养,用高效液相色谱检测底物被转化情况。【结果】分离出一株对黄豆苷原具开环转化作用的革兰氏阳性兼性好氧菌株AUH-HM195（EU919863）,经BLAST比对,该菌株的16S rDNA基因全序与肠球菌属菌株Enterococcus hirae (DSM20160) 的相似性为100%。根据保留时间、代谢产物最大紫外吸图谱以及核     

清洁级实验动物四种病毒抗体玻片酶免疫检测试剂盒的研制

本文报道对清洁级实验动物应排除的四种病毒（淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒、小鼠脱脚病病毒、鼠肝炎病毒和仙台病毒）抗体玻片酶免疫（ＥＩＡ）检测试剂盒的研制。四种病毒感染的细胞和对照细胞经冷丙酮固定于载玻片上制成特异性抗原和对照抗原,此四种病毒的抗血清各１０份和ＳＰＦ小鼠血清２０份分别与四种病毒的特异性抗原和对照抗原进行ＥＩＡ交叉试验,结果显示,抗原只与其相应抗血清发生特异性显色反应,与非特异性小鼠血清和ＳＰＦ小鼠血清不显色。与ＨＩ或ＥＬＩＳＡ方法比较,通过对１１２份普通小鼠血清进行测试,结果表明,ＥＩＡ对仙台病毒抗体的检出率（１９．６％）显著高于（＜０．００５）ＨＩ（６．３％）,对小鼠脱脚病病毒抗体的检出率（２３．３％）与ＨＩ（２１．４％）无显著性差异（Ｐ＞０．０５）。ＥＩＡ对淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒和鼠肝炎病毒抗体的检出率分别为１．８％和７１．２％,ＥＬＩＳＡ对两种病毒抗体的检出率分别为１．８％和６７．６％,两种方法对两种病毒抗体的检出率无显著性差异（Ｐ＞０．０５）。重复性试验表明两批四种病毒抗体试剂盒对１０８份小鼠血清两次测定的符合率为９６～１００％。四种病毒的ＥＩＡ抗原在－１８℃保存１２个月或在２－８℃保存３     

大鼠胰腺嗜铬颗粒素A分布的免疫组织化学研究

本研究用ＡＢＣ免疫组织化学方法,在Ｂｏｕｉｎ液固定的常规石蜡切片上,观察了啥铬颗粒素Ａ在大鼠胰腺内分泌细胞内的定位和分布,并用相邻切片双标记法,观察了它与胰高血糖素、胰岛素、生长抑素的共存关系。结果发现,大鼠胰腺嗜铬颗粒素Ａ样免疫反应细胞主要分布于胰岛的周边部,胰腺外分泌部的导管和腺泡等处均未见ＣｇＡ祥物质存在。用相邻薄切片免疫显色技术证明,大鼠胰腺中ＣｇＡ样物质与胰高血糖素共存。结果提示,ＣｇＡ可能是胰腺内分泌细胞的一个新的标志物,在胰腺功能调节上发挥着重要作用。     

用ELISA一步法检测白色念珠菌

用白色念珠菌临床分离株免疫家兔并经纯化获得特异性抗体,建立了检测临床标本中白色念珠菌抗原的ＥＬＩＳＡ一步法,此法的敏感性为９９％,特异性为９８３％,与其它念珠菌和临床常见细菌均无交叉反应,整个反应只需１小时即可完成,可望成为一种取代培养法的快速诊断方法     

草鱼催乳素抗血清的制备与鉴定

应用从草鱼垂体中分离纯化的催乳素免疫兔子制备了特异抗血清。用常规酶联免疫吸附测定法检测表明该抗血清与马哈鱼生长激素及促性腺激素完全没有交叉反应，而与草鱼生长湟级向弱交叉反应。免疫细胞化学染色表明该抗血清主要与草鱼垂体前叶催乳素细胞发生结合反应，与垂体间叶细胞有微弱染色反应，但与神经垂体琢垂体后叶细胞则完全没有免疫结合反应。     

繁茂膜海绵硅聚合酶抗体制备及其在造骨细胞鉴别中的应用

为准确鉴别海绵造骨细胞,分别提取了繁茂膜海绵、多皱软海绵和澳大利亚厚皮海绵的硅聚合酶,以繁茂膜海绵硅聚合酶为抗原制备抗体,效价为1∶9600。SDSPAGE显示三种海绵硅聚合酶的亚基分布在28kD左右;建立竞争抑制性检测方法并结合WesternBlotting检测,显示该抗体可与繁茂膜海绵硅聚合酶特异性结合,且与另外两种海绵硅聚合酶几乎无交叉反应。利用该抗体对繁茂膜海绵组织和体外培养细胞进行免疫组织化学染色,均可显示造骨细胞的分布。结果提示硅聚合酶抗体可以特异性与繁茂膜海绵造骨细胞内的硅聚合酶结合,因此,该抗体可以用于造骨细胞的鉴别。     

模拟表位结合夹心化学发光法检测抗A和抗B效价

目的:获得A/B血型抗原的模拟多肽,并将其与夹心化学发光免疫分析(chemiluminescence immunoassay, CLIA)相结合,以开发更有效的方法来测量A/B抗体的效价。方法:分别用NaM87-1F6和HEB-29对噬菌体12肽库进行三轮淘选。对经酶联免疫吸附实验(ELISA)确定的阳性菌斑进行测序分析,根据其氨基酸组成合成模拟多肽,并通过竞争性ELISA、凝集抑制等方法检测其抗原性。随后将获得的模拟多肽与CLIA结合,检测A、B抗体效价,制作标准曲线以及与现有的微柱凝胶法(CAT)进行相关性对比。结果:经过三轮淘选和相关鉴定后得到13个与抗A抗体和19个与抗B抗体特异性相互作用的噬菌体克隆,其中分别有9个(MTRIQLRMMRLH)和12个(PQMSRHRMRMLP)展示相同的氨基酸序列,据此合成的多肽分别命名为MTR和PQM。竞争性ELISA结果表明,MTR能够特异性拮抗A抗体和A抗原的替代多肽的免疫结合;PQM能够特异性拮抗B抗体和B抗原的替代多肽的免疫结合。凝集抑制实验表明MTR/PQM可以特异性抑制A/B型红细胞与抗A/B之间的相互作用。结合模拟肽的夹心CLIA具有较宽的线性范围(2-2048)和良好的线性相关系数(对于A抗体R~2=0.9566,对于B抗体R~2=0.9762)。基于CLIA方法和CAT测得的抗体滴度结果高度相关(P0.001)。结论:MTR和PQM有良好的A或B抗原性,具有成为其人工替代品的潜能。模拟多肽与夹心CLIA相结合能够实现对A、B抗体滴度的定量检测,且其结果准确可靠。