神经细胞特异性真核表达载体TUBA1α-EGFP的构建及鉴定

目的 探讨构建具有神经细胞表达特异性的TUBA1α-EGFP真核表达载体,为进一步研究神经元细胞的发生与转化奠定基础.方法 采用PCR技术克隆出长分别为1.121 kb与0.72 kb的TUBA1α启动子及EGFP基因部分序列,利用Gateway 克隆技术构建pLV.EX2 d.null-TUBA1α>EGFP质粒.最后对产生的重组子进行琼脂糖凝胶电泳和测序鉴定.结果 经琼脂糖凝胶电泳鉴定,所克隆的1.121 kb与0.72 kb的TUBA1 α启动子及EGFP基因片段成功地连接到pLV.Des2 d.null载体上,DNA测序证实插入到载体中的片段为目的 片段.结论 成功构建了神经细胞特异性真核表达载体TUBA1 α-EGFP.     

恶性疟原虫MSA2编码基因分枝杆菌穿梭质粒的构建及序列测定

目的　构建恶性疟原虫 FCC- 1/ HN株 MSA2编码基因分枝杆菌穿梭质粒重组子 p BCG5 .6 / MSA2 ,并进行序列测定。　方法　根据恶性疟原虫 MSA2编码基因的两侧序列设计引物 ,采用 PCR技术扩增出 MSA2编码基因全长片段 ,经低熔点琼脂糖挖块法回收纯化后 ,插入分枝杆菌穿梭质粒 p BCG5 .6 / MSA2 ,并转化大肠杆菌 DH5 α,快速酚法初筛阳性重组子 ,阳性克隆以 PCR法与限制性酶切分析鉴定后 ,双脱氧链终止法双向进行序列测定。　结果　从恶性疟原虫基因组中扩增出约 82 0 bp的基因片段 ,所构建 p BCG5 .6 / MSA2重组体阳性克隆经双酶切和 PCR鉴定与预期结果一致 ,测序结果确证了插入片段的正确性。　结论　成功构建了恶性疟原虫 MSA2编码基因分枝杆菌穿梭表达质粒 ,为恶性疟 BCG疫苗的研制奠定了基础。     

人Midkine基因启动子片段的克隆

目的克隆人Midkine（MK）启动子基因2 335bp片段.方法自健康人血中提取人类基因组DNA作为模板,聚合酶链式反应（PCR）技术克隆人MK启动子基因2 335bp片段.琼脂糖凝胶电泳初步鉴定PCR产物,切取目的条带纯化并将其克隆入p GEM T载体中.选取阳性克隆进行DNA测序.结果电泳结果显示PCR产物包含有大小约为2 300 bp和1 400 bp的条带各1条;较大片段的测序结果显示,其与Genbank中的人MK启动子片段吻合.结论本研究成功克隆了人MK启动子基因2 335 bp片段.     

弓形虫表面抗原P22编码基因片段的克隆及序列测定

目的克隆弓形虫表面抗原P22编码基因片段并进行序列测定。方法设计合成1对引物,采用PCR法扩增出P22目的基因片段,以低熔点琼脂糖回收纯化,并以限制性内切酶BamHI和KpnI双酶切后,插入质粒载体p5．6的多克隆位点,构建重组体p5．6／P22,并转化大肠杆菌DH5α,快速酸法初筛阳性重组子,并以PCR法与限制性酶切分析对阳性克隆进一步鉴定。被鉴定的重组子以双脱氧链终止法进行序列测定。结果从弓形虫核酸提取物中扩增出约593bpDNA条带,与预期扩增片段大小相符,空白对照无特异性扩增条带;所构建p5．6／P22重组体阳性克隆经双酶切与PCR鉴定与预期结果一致;序列测定的结果确证了插入片段的正确性。结论体外成功扩增、克隆了弓形虫表面抗原P22编码基因片段,并经序列分析所验证,为弓形虫P22表面抗原的表达以及弓形虫疫苗的制备作好铺垫。     

人子宫颈癌基因HCCR-2反义真核表达载体的构建及鉴定

目的克隆人子宫癌基因HCCR-2并构建其反义真核表达载体。方法从人肝癌细胞株HepG2提取RNA，利用RT-PCR方法，克隆出一包括HCCR-2编码区的长约1kb的片段，并将其与T载体连接，测序证实无误后，用SalⅠ、SacⅡ双酶切重组T载体，然后将该片段反向插入真核表达载体pIRES2-EGFP的多克隆位点，最后对重组真核表达载体进行双酶切鉴定。结果RT-PCR扩增出一长约1kb的HCCR-2片段，琼脂糖凝胶电泳显示目的片段成功反向连接到pIRES2-EGFP载体上。结论成功克隆了HCCR-2基因并构建了其反义真核表达载体pIRES2-EGFP/HCCR-2（-）。     

恶性疟原虫MSA2编码基因分枝杆菌穿梭质粒的构建及序列测定

目的 构建恶性疟原虫FCC－1／HN株MSA2编码基因分枝杆菌穿梭质粒重粒子pBCG5.6/MSA2,并进行序列测定。方法 根据恶性疟原虫MSA2编码基因的两侧序列设计引物，采用PCR技术扩增出MSA2编码全长片段，经低熔点脂脂糖挖块法回收纯化后，插入分枝杆菌穿梭质粒pBCG5.6/MSA2，并转化大肠杆菌DH5α，快速酚法初筛阳性重组子，阳性克隆以PCR法与限制性酶切分析鉴定后，双脱氧链终止法双向进行序列测定。结果 从恶性疟原虫基因组中扩增出约820bp的基因片段，所构建pBCG5.6/MSA2重组体阳性克隆经双酶切和PCR鉴定与预期结果一致，测序结果确证了插入片段的正确性。结论 成功构建了恶性疟原虫MSA2编码基因分枝杆菌穿梭表达质粒，为恶性疟BCG疫苗的研制奠定了基础。     

T载体的构建及日本血吸虫肌动蛋白基因PCR产物的快速克隆

目的构建快速高效克隆PCR产物的克隆载体(T载体),并对日本血吸虫肌动蛋白全长编码基因PCR产物进行快速克隆.方法日本血吸虫肌蛋白全长编码基因的扩增采用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法.质粒pGEM5Zf ( )经限制性内切酶EcoR V 酶切,在仅含有脱氧胸苷三磷酸(dTTP)的PCR缓冲液中于70 ℃作用2 h,在每个片段的3'端加上一个脱氧胸苷(dT)碱基,构建成T载体.根据PCR扩增产物3'端存在一个非模板依赖的脱氧腺苷(dA)原理,将扩增产物直接克隆入T载体并测序.结果阳性克隆经琼脂糖凝胶电泳、限制性酶切分析、PCR及DNA序列测定等均证实克隆获得成功,且效率很高.与曼氏血吸虫肌动蛋白比较,核苷酸和推断的氨基酸的同源性分别是92.5%和99.7%.结论构建的pGEM5Zf-T载体对日本血吸虫肌动蛋白编码基因的PCR产物直接克隆既经济、简便,又快速、高效,所构建的T载体由于在插入位点两侧具有pUC/M13测序引物序列,可直接测定重组质粒中插入片段的核苷酸序列.所获得的日本血吸虫(大陆株)肌动蛋白编码基因与曼氏血吸虫有极高的同源性.     

弓形虫GRA8基因真核表达重组质粒的构建、鉴定及测序

目的 构建弓形虫RH株pcDNA3，1( )-GRA8真核表达重组质粒，为进一步DNA免疫做准备。方法 用聚合酶链反应(PCR)从弓形虫RH株的基因组DNA中扩增编码致密颗粒蛋白(GRA8)的基因片段，纯化后重组入pUC-19克隆载体，再经含IPTG，XGal氨苄培养基蓝白筛选，挑选白色克隆酶切，低溶点琼脂糖纯化，回收目的基因亚克隆入pcDNA3．1( )，经氨苄培养基过夜培养挑选6个克隆提纯酶切，PCR鉴定和测序。结果 从RH株基因组DNA中扩增出特异的GRA8基因片段，克隆成功pcDNA3．1( )-GRA8重组质粒。测序表明GRA8这部分基因与GENEBANK相应基因序列完全一致。结论 本结果为研究抗弓形虫核酸疫苗打下基础。     

铜绿假单胞菌外毒素A全长基因的扩增与克隆

目的　从绿脓杆菌中提取染色体DNA ,PCR扩增及克隆外毒素A全长基因 ,为实现外毒素A的高效表达奠定基础。方法　从绿脓杆菌培养物中提取染色体DNA ,PCR扩增外毒素A全长基因 ,A -T克隆入本室自行构建的pSK -T载体中 ,对重组质粒进行酶切与测序鉴定。结果与结论　成功地从高GC含量的绿脓杆菌染色体DNA中扩增到长片段的外毒素A全基因并进行了克隆与鉴定。     

5种多房棘球绦虫续绦期幼虫的制备RNA方法比较及长片段DNART-PCR扩增方法研究

目的探讨从多房棘球绦虫续绦期幼虫制备RNA的最佳方法,研究逆转录PCR扩增DNA长片段目的基因的方法。方法应用改良的琼脂糖核酸电泳方法和RT-PCR技术比较观察了5种商品化RNA/mRNA提取试剂/试剂盒用于提取多房棘球绦虫续绦期幼虫RNA的效果;用琼脂糖凝胶电泳方法观察比较了不同的DNA聚合酶用于RT-PCR扩增长片段EMⅡ/3(1.72kb)和EM10(1.76kb)的效果。结果总RNA提取试剂盒(RNeasyTotalRNAKit)提取的多房棘球绦虫续绦期幼虫RNA电泳显示出清晰的28S、18SrRNA条带和弥散于0.8kb至20kb之间未降解的mRNA,是唯一能逆转录扩增出单一目的条带的核酸提取物。TaqDNA聚合酶与高保真DNA聚合酶Pfu的混合制剂TaqPlus应用于RT-PCR可扩增出大量1720bp和1760bp单一目的基因。结论总RNA提取试剂盒(RNeasyTotalRNAKit)对多房棘球绦虫续绦期幼虫RNA的提取效果最好;TaqPlus适合用于RT-PCR扩增长片段目的基因。     

苏云金杆菌cryIVD基因的克隆及序列分析

目的 克隆苏云金杆菌（B.t.i)cryIVD基因并测定其序列。方法 根据B.t.i cryIVD已知序列，设计合成了1对引物，应用PCR技术扩增cryIVD基因，克隆入pUC18载体，阳性克隆的重组质粒经酶切，电泳鉴定后进行序列测定。结果 PCR扩增得到特异的2.0kb基因片段。重组质粒经酶切后得到预期大小的基因片段。序列分析证明目的基因被完整且正向克隆。结论 B.t.icryIVD基因被成功克隆。     

胃癌MG-7抗原模拟表位与HSP70融合基因的构建及表达

目的构建和表达胃癌MG7模拟表位与人热休克蛋白70(HSP70)的融合基因.方法采用加端PCR的方法,将MG7模拟表位(GC23)的编码序列融合到HSP基因的3′端;PCR获得的融合基因片段经TA克隆法克隆到pUCm-T载体上,并进行DNA测序;将融合基因片段从pUCm-T载体上酶切后,亚克隆到表达载体PET-21a(+)上;将重组质粒PET-21a(+)/GC23-hsp转化大肠杆菌,经IPTG诱导后,收集细菌,菌体裂解后进行SDS-PAGE及Western blot检测结果应用PCR方法扩增出约2.0kb的目的片段,序列测定结果证实,模拟表位GC23序列成功地融合到HSP70基因的3′端,GC23及HSP70基因序列均正确;经EcoRⅠ+XhoⅠ酶切及PCR鉴定证实,融合基因成功地克隆到原核表达载体PET-21a(+)上;转入重组质粒的大肠杆菌经IPTG诱导后,进行SSS-PAGE发现在Mr为72000处有表达量明显增多的蛋白条带,Western blot证实,Mr72000处的条带为目的条带.结论成功构建并表达了MG7模拟表位与HSP70的融合基因.     

PCR法扩增NOGO基因RNA干涉小发夹和体外效应研究

目的 通过PCR方法获得带有U6启动子的NOGO基因RNA干涉小发夹.方法 设计特异性引物,人工合成U6启动子的上游引物和带有NOGO-66反相互补序列的下游引物.PCR扩增带有U6启动子的小发夹,PCR产物与载体连接.酶切产物以1%琼脂糖凝胶进行电泳分析,释放出430bp基因片段的质粒初步确定为阳性重组质粒,并测序.结果 成功地扩增了靶向NOGO基因RNAi的带有U6启动子的小发夹.结论 PCR方法可快速简单、廉价地获得shRNA.     

间日疟原虫环子孢子蛋白基因片段的体外扩增、鉴定与克隆

目的：体外扩增、鉴定并克隆间日疟原虫环子孢子蛋白（CSP）基因约772hP的基因片段,包容CSP基因的Ⅰ区、中央9肽重复区、重复后可变区及Ⅱ区。方法：采用PCR法扩增出CSP目的基因片段,以低熔点琼脂糖回收纯化,并以限制性内切酶BstNI酶切鉴定后,采用T载体连接方案,插入中间载体PUC19的多克隆位点,构建重组体PUC19／CSP,并转化大肠杆菌JM107,蓝白菌斑初筛阳性重组子,并以PCR法与限制性酶切分析对阳性克隆进一步鉴定。结果：从间日疟患者血样核酸提取物中扩增出约772hPDNA条带,而正常人血与空白对照无特异性扩增条带,经酶切鉴定证实为CSP基因片段;所构建的PUC／CSP重组体阳性克隆经双酶切与PCR鉴定与预期结果一致。结论：体外成功扩增并克隆间日疟原虫CSP基因片段,为下一步的基因序列分析及CS诊断抗原的制备打下基础。     

细粒棘球蚴95(Eg95)抗原基因的克隆及真核表达质粒的构建

目的　克隆Eg95抗原基因 ,构建携带目的基因的真核表达载体 ,为细粒棘球蚴DNA疫苗的研究提供材料。方法　应用PCR方法从细粒棘球蚴cDNA文库中克隆获得Eg95抗原基因 ,将其克隆至 pUCm -T载体 ,测序确定其正确性。利用定向克隆技术将Eg95抗原基因片段克隆至真核表达质粒pcDNA3上 ,根据选择标记的氨苄抗性基因筛选到阳性克隆 ,通过酶切分析和PCR鉴定筛选出阳性克隆 ,测序确定序列。结果　测序表明所选 pcDNA3-Eg95阳性克隆均为正确连接Eg95抗原基因的重组质粒 ,可以作为DNA疫苗作进一步的研究。结论　成功构建真核细胞表达载体 pcDNA3-Eg95。     

编码日本血吸虫大陆株磷酸丙糖异构酶(TPI)抗原基因的克隆与测序

目的 :获得编码日本血吸虫大陆株磷酸丙糖异构酶 ( Sjc TPI)的 c DNA基因片段 ,对其克隆与测序。方法 :以日本血吸虫大陆株成虫总 RNA为模板 ,经过逆转录 -聚合酶链 (式 )反应( RT- PCR)获得编码 Sjc TPI抗原的 c DNA片段 ,并克隆于载体 M13mp18、M13mp19,双脱氧链末端终止法测 DNA序列。结果 :体外 PCR扩增获得了编码 Sjc TPI的 0 .75kb c DNA片段 ,6个重组克隆子经酶切鉴定均有 0 .75kb片段的插入。测得编码 Sjc TPI的 DNA序列。结论 :用自行设计的引物成功地扩增了编码日本血吸虫大陆株 TPI抗原的基因片段并进行了克隆、测序 ,为制备重组 TPI进行疫苗试验打下基础。     

人ACAT1基因P1启动子的克隆及意义

目的克隆人酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶1(ACAT 1)基因P 1启动子。方法应用PCR方法从人单核细胞系THP-1扩增分离出ACAT 1基因P 1启动子全长片段,将PCR产物克隆入T载体,并对所获得的序列进行生物信息学分析。结果经琼脂糖凝胶电泳及直接测序鉴定,克隆的ACAT 1基因P 1启动子片段碱基序列与G enB ank数据库一致,未发现突变。结论人ACAT 1基因P 1启动子克隆成功,此为动脉粥样硬化(A S)过程中ACAT 1基因转录调控机制的研究奠定了基础。     

日本血吸虫抗原表位编码基因重组质粒的高效构建与鉴定

目的探索用一种新方法—胶内连接法,快速构建日本血吸虫抗原表位编码基因重组表达载体,高效克隆及表达日本血吸虫抗原表位,用于疫苗候选分子的筛选。方法将pUMCV质粒载体用SalI和EcoRI双酶切,酶切产物于低熔点胶中电泳,紫外灯下割取含酶切载体的条带。取一定量割取的低熔点胶,直接将其与合成的单个抗原表位编码基因或者是两个不同抗原表位编码基因进行连接。连接产物转化感受态菌DH5α。挑选阳性克隆进行双酶切、电泳及测序鉴定。结果单个抗原表位或两个不同的表位编码基因被成功地插入真核表达载体。结论采用胶内连接法直接在低熔点胶存在的条件下进行插入基因片段与质粒载体的连接,快速高效地获得了多个单一或组合抗原表位编码基因重组质粒,为进一步筛选日本血吸虫疫苗分子奠定了基础。     

编码日本血吸虫大陆株磷酸丙糖异构酶(TPI)抗原基因的克隆与测序

目的 :获得编码日本血吸虫大陆株磷酸丙糖异构酶 ( Sjc TPI)的 c DNA基因片段 ,对其克隆与测序。方法 :以日本血吸虫大陆株成虫总 RNA为模板 ,经过逆转录 -聚合酶链 (式 )反应( RT- PCR)获得编码 Sjc TPI抗原的 c DNA片段 ,并克隆于载体 M13mp18、M13mp19,双脱氧链末端终止法测 DNA序列。结果 :体外 PCR扩增获得了编码 Sjc TPI的 0 .75kb c DNA片段 ,6个重组克隆子经酶切鉴定均有 0 .75kb片段的插入。测得编码 Sjc TPI的 DNA序列。结论 :用自行设计的引物成功地扩增了编码日本血吸虫大陆株 TPI抗原的基因片段并进行了克隆、测序 ,为制备重组 TPI进行疫苗试验打下基础。     

结核分枝杆菌HSP65与IL-2融合蛋白的表达和纯化

目的获得融合表达的结核分枝杆菌热休克蛋白65与人白细胞介素2的重组蛋白,为进一步研究其对结核疫苗的作用奠定基础。方法用PCR的方法分别从H37Rv DNA和质粒pGEM-Teasy-IL-2中扩增目的基因片段hsp65和IL-2,将各目的片段克隆至pMD18-T载体中进行测序,将测序正确的目的基因片段分别经EcoRI和ClaI,ClaI和HindⅢ双酶切后亚克隆至原核表达载体pPro-EX HTa,转化大肠杆菌DH5α,挑选阳性克隆,经IPTG诱导后进行融合表达,并通过镍柱对融合蛋白进行纯化。结果PCR法扩增获得的各目的基因片段与GenBank报道的一致。构建的融合蛋白原核表达载体在大肠杆菌中表达后,经SDS-PAGE和Western-blot分析,在Mr 78000处有特异性的蛋白表达条带。用镍柱进行亲和层析纯化后得到了高纯度的HSP65-IL-2融合蛋白。结论成功的构建了结核分枝杆菌HSP65与人IL-2的融合表达载体,并在大肠杆菌中获得高效表达,有望为结核的预防提供有效的疫苗。