紫花苜蓿不同栽培品种植株再生的研究

离体培养条件下对紫花苜蓿地方栽培品种--陇东苜蓿、和田苜蓿、准格尔苜蓿以及引进品种Rambler苜蓿植株不同部位的再生进行了研究,结果表明,不同的苜蓿品种、外植体、外源激素种类及其浓度等因素均影响着植株的再生.陇东苜蓿下胚轴愈伤组织出愈率和体细胞胚形成率最高可达91.04%和63.75%;和田苜蓿下胚轴愈伤组织出愈率最高可达92.05%,体细胞胚形成率最高为56.82%.这2个品种在紫花苜蓿的组织培养植株再生中是较理想的试验材料;紫花苜蓿下胚轴是理想的受体材料.苜蓿愈伤组织的诱导、体细胞胚的形成以2.0 mg/L 2,4-D处理2周为最佳;在2.0 mg/L 2,4-D 0.5～2.0 mg/L 6-BA的作用下,外植体产生愈伤组织以及进一步发育的趋势较强.对体细胞胚的发育和幼苗的形成则以2.0 mg/L 6-BA 0.5 mg/L NAA的激素组合进行处理.适宜的生根培养基为1/2 MS 1.0 mg/L IBA 1%蔗糖 0.7%琼脂.     

匍匐翦股颖AsSAUR71基因克隆及转化

以匍匐翦股颖(Agrostis stolonifera)Penn A-4品种为材料,利用PCR技术在匍匐翦股颖中克隆出SAUR71基因,构建3302Y-SAUR71植物表达载体,通过农杆菌侵染转化匍匐翦股颖。在遗传转化过程,愈伤组织继代培养基中添加0.3mg/L KT、0.1mg/L 6-BA与300mg/L水解酪蛋白以形成较多的分化率较高的胚性愈伤组织,在该愈伤组织诱导体系中出愈率达到57.2%。在进行诱导生芽生根过程中,提高KT与6-BA浓度促进愈伤组织分化,使愈伤组织分化率达到83.7%。在该转化体系中,通过PCR检测,最终获得24株转基因植株,为后续进行AsSAUR71基因功能的相关研究提供了基础。     

抗冻蛋白基因AFP表达载体构建及转化紫花苜蓿初报

以胡萝卜基因组DNA为模板,用PCR方法扩增目的基因,连接到PGEM-T Easy Vector载体上,经XbalⅠ和SacⅠ双酶切,将目的片段连接到PBI121工程质粒上,通过农杆菌介导法转化和田苜蓿,为提高紫花苜蓿的抗冻性奠定基础.结果表明,成功克隆出抗冻蛋白基因AFP,并构建成AFP植物表达载体.获得了具有卡那霉素抗性的苜蓿愈伤组织,和田苜蓿愈伤组织的最佳Kan筛选浓度为60 mg/L.经PCR技术鉴定,AFP抗冻蛋白基因已整合到苜蓿基因组中.     

Lyz-GFP双元基因在苜蓿愈伤组织中的转化

利用农杆菌介导法将溶菌酶(Lyz)与绿色荧光蛋白(GFP)基因转入"甘农1号"杂花苜蓿(Medicago sativa Martyn)和"甘农3号"紫花苜蓿(Medicagosativa L.)品种中,获得含有该双元基因的苜蓿转基因愈伤组织;采用荧光检测和PCR扩增技术,检测到溶菌酶Lyz和绿色荧光蛋白GFP基因在苜蓿愈伤细胞中的表达;研究该双元基因在苜蓿品种"甘农1号"和"甘农3号"中转化的若干影响因素,确定适宜的转化条件以期提高基因转化效率。结果表明:75 mg·L^-1的卡那霉素对苜蓿愈伤组织的生长具有显著抑制效应;300mg·L^-1头孢霉素能够有效地抑制农杆菌LBA4404的生长;OD₆₀₀值为0.4-0.5的农杆菌适宜的侵染时间是10min;经预培养3-4d的材料侵染后再共培养3d之后,在愈伤组织诱导培养基MS₊2,4-D 2.0mg·L^-1+KT0.5 mg·L^-1+0.6%琼脂+2.5%蔗糖的培养基上诱导出抗性愈伤组织;"甘农1号"和"甘农3号"的抗性愈伤组织诱导率分别为35%和32%。     

根蘖型苜蓿高频再生体系的建立

根蘖型苜蓿具有较强的耐牧性,是苜蓿育种重要的种质资源。建立高效的苜蓿再生体系有助于其遗传转化的研究。试验以公农4号苜蓿的子叶为材料,通过比较不同植物生长调节剂浓度配比对苜蓿愈伤组织诱导和分化的影响,建立了根蘖型苜蓿的高频再生体系。结果表明:最佳愈伤组织诱导培养基为:MS培养基+2 mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)+0.4 mg/L激动素(KT),子叶愈伤诱导率达100%;最佳分化培养基为:UM培养基+1.6 mg/L KT,愈伤组织分化率达50%;移栽小苗的成活率达90%以上。     

苜蓿愈伤组织原生质体游离与培养

对阿尔冈金苜蓿(Medicago sativa L. cv. Algonguin)原生质体游离和培养的最佳条件进行研究,建立其细胞融合原生质体杂交体系。以下胚轴诱导的愈伤组织为材料,研究了愈伤组织继代培养时间、酶液组合、酶解时间及酶液渗透压对原生质体游离的影响,并探讨了愈伤组织原生质体在KM8P培养基上的分裂情况。结果表明:继代12d的愈伤组织游离性最好,最佳酶液组合为2%纤维素酶+0.5%果胶+1%半纤维素酶、最佳酶解时间为12h、最佳酶液渗透压为0.55mol/L;最适宜培养苜蓿愈伤组织原生质体的培养基为KM8P+2.0mg/L2,4-D+1.0mg/LNAA。     

紫花苜蓿基因转化的影响因素分析

通过农杆菌介导法对紫花苜蓿不同品种植株进行了抗旱基因转化的研究,得到了一套紫花苜蓿基因转化的优化体系。研究表明,100 mg/L的卡那霉素对苜蓿愈伤组织的生长有着显著的抑制效应。250 mg/L头孢霉素能够有效地抑制农杆菌菌株LBA4404的生长。紫花苜蓿供试材料被切后直接用OD600值为0.3~0.5的农杆菌LBA4404菌液侵染10~15 min;培养材料共培养3 d后在愈伤组织诱导培养基MS 2 mg/L 2,4-D 0.5 mg/LKT 30 g/L蔗糖 9 g/L琼脂 250 mg/L Cef上诱导出愈伤组织;在体细胞胚分化培养基MS 1.0 mg/L BA 0.3 mg/L NAA 30 g/L蔗糖 9 g/L琼脂 50 mg/L Kan 250 mg/L Cef上促进体细胞胚的分化;分化出的体细胞胚在再生培养基上(同分化培养基,Kan为80 mg/L)进一步发育成抗性转化苗;转化的无根小苗在生根培养基1/2 MS 1.0 mg/L IBA 1%蔗糖 0.8%琼脂 100 mg/L卡那霉素上可生长出根系。     

牛皮蝇HA抗原基因转化紫花苜蓿的研究

以“甘农1号”紫花苜蓿(Medicago sativa)7 d苗龄子叶和下胚轴为受体材料,建立了高效的苜蓿再生体系和遗传转化体系,筛选出MS+2,4 D 2.0 mg/L+6 BA 0.5 mg/L和MS+6 BA 0.5 mg/L+NAA 0.03 mg/L+GA3 2.0 mg/L为苜蓿子叶愈伤组织诱导和分化的适宜培养基;探讨了农杆菌浓度OD600约0.5、感染时间8~10 min、共培养时间2 d为适宜的转化条件。采用农杆菌介导法将Hyperdomin A（HA）基因导入紫花苜蓿,经PCR检测和Southern分子杂交分析,结果表明HA基因已经整合到苜蓿基因组中,可为牛皮蝇蛆病可食性疫苗的研究提供理论基础。     

4个苜蓿品种愈伤组织诱导对光照的响应及再生体系建立

为实现苜蓿(Medicago sativa)的遗传改良,建立稳定、高效的离体培养再生体系,以甘农1号、巨人、WL324和三得利4个苜蓿品种为试验材料,以下胚轴为外植体,MS、UM、改良HS、改良UM为基本培养基,分别添加2,4-D、KT和水解酪蛋白诱导愈伤组织,通过体细胞胚发生途径建立再生体系,研究光照对苜蓿愈伤组织诱导及愈伤组织形态对体细胞胚发生的影响。结果表明,光照对愈伤组织诱导率差异不显著,均为100%;光暗交替条件下诱导的愈伤组织褐化率高、生长更快、更旺盛,颜色稍显绿或黄绿相间。在不同光照条件下4个苜蓿品种诱导的愈伤组织,以甘农1号的体细胞胚发生率最高,为20.83%~56.25%,而且光暗交替条件下诱导的愈伤组织更易形成体细胞胚;不同培养基中,UM+0.1 mg/L NAA+0.5 mg/L KT下体细胞胚发生率最高,为56.25%。     

多叶苜蓿自交S1代的胚挽救培养

以苜蓿(Medicago sativa)多叶性状S1代的3个单株为材料,研究了3份参试材料的败育率,测定了开展胚挽救培养的最佳取材时间和不同激素水平对苜蓿自交系胚挽救的影响。结果表明,参试材料平均败育率为37.59%;进行苜蓿胚挽救培养的最佳取样时间为授粉后30 d;胚挽救培养的最佳培养基配方为MS+0.5 mg/L IAA +0.07 mg/L 6 BA,蔗糖30 g/L,琼脂7 g/L,pH值5.8～6.1。对萌动的胚进行愈伤组织诱导发现,参试材料平均诱导率为85.32%,愈伤组织平均分化率为75.66%。研究以期为苜蓿胚挽救育种提供理论基础,并为苜蓿特异性状自交系结实率低等方面的研究提供有效的解决途径。     

紫花与杂花苜蓿再生影响因子的比较研究

对紫花苜蓿(Medicago sativa L.)(秘鲁、关中、甘农3号)及杂花苜蓿(Medicagovaria Martyn)(甘农1号、甘农2号)组培再生体系各影响因子进行比较研究。结果表明:紫花、杂花苜蓿的组培再生能力差异较大,前者显著高于后者;在愈伤组织诱导中,子叶节是最佳的外植体材料;2,4-D浓度增加对紫花苜蓿出愈率影响不明显,但杂花苜蓿的出愈率随着2,4-D浓度的增加呈明显的升高趋势;紫花苜蓿的最佳愈伤组织诱导培养基为MS₊2,4-D2.0mg/L+蔗糖30g/L,诱导率均在95%以上;杂花苜蓿为MS₊2,4-D 4.0mg/L+蔗糖30 g/L,两个品种诱导率分别为65.6%、73.3%;5个品种的最适分化培养基均为MS₊KT 1.0 mg/L+NAA 0.5mg/L+蔗糖20 g/L或MS₊BA4.0 mg/L,分化率也各有差异,紫花苜蓿不定芽的分化率可达到70%左右,而杂花苜蓿在30%左右;最佳诱导生根的培养基为1/2MS₊IBA 1.0 mg/L;本研究建立了紫花苜蓿高频再生组织培养体系,为实现外源基因的高效遗传转化奠定基础;通过紫花苜蓿和杂花苜蓿的再生体系影响因子的比较研究,为杂花苜蓿再生体系的建立提供参考。     

紫花苜蓿不同品种对卡那霉素敏感性分析

组织培养条件下卡那霉素(Kan)对不同紫花苜蓿品种(秘鲁、富平、甘农3号)愈伤组织诱导及芽分化的影响进行了研究,实验结果表明:不同的外植体对卡那霉素的敏感性差异较大,不同品种间也存在差异。子叶对卡那霉素的敏感性高于下胚轴,当卡那霉素的浓度为20mg/L时,子叶的愈伤率极低。子叶愈伤阶段卡那霉素的有效工作浓度为15~18mg/L,分化阶段为40mg/L。下胚轴对卡那霉素的敏感性因品种不同:秘鲁苜蓿愈伤阶段的选择压为60mg/L,分化阶段以50mg/L为宜。富平苜蓿和甘农3号苜蓿愈伤阶段的选择压力分别为80mg/L9、0mg/L,分化阶段选择压降低到60mg/L。另外,如果在愈伤阶段加入选择压,后期分化中应适当降低压力或除去压力,以利于体细胞胚的产生和发育。     

不同苜蓿品种再生体系的差异性比较

以陇东野生紫花苜蓿、阿尔冈金、甘农1号、游客4个苜蓿品种的下胚轴为外植体,比较不同苜蓿品种外植体愈伤组织诱导、分化及再生能力的差异,研究不同激素浓度及配比对再生体系建立的影响。结果表明,4个苜蓿品种下胚轴诱导率依次为阿尔冈金甘农1号陇东野生紫花苜蓿游客;在愈伤组织诱导培养基MS+2.0 mg/L 2,4-D+1.0 mg/L NAA上诱导率最高;MS+0.5 mg/L KT+0.3 mg/L NAA为最佳分化培养基,分化率在84.5%~93.5%;适宜的生根培养基为1/2 MS+0.1 mg/L NAA,附加1%蔗糖,各品种再生植株的移栽成活率为100%。     

外源激素对掌叶大黄愈伤组织诱导及种苗生根的影响

以掌叶大黄无菌苗为材料,研究不同外源激素浓度及配比对试管苗生根、愈伤组织诱导及增殖的影响。结果表明:掌叶大黄的根、茎、叶均可作为诱导愈伤组织的材料。2,4-D诱导愈伤组织的能力明显高于NAA,以2～3mg/L 2,4-D的诱导频率较高为87.93%～93.11%,诱导愈伤组织的适宜培养基为MS+2mg/L NAA+2mg/L 2,4-D+2mg/L 6-BA;6-BA对愈伤组织诱导频率无直接影响,但明显影响愈伤组织的增长量及生长状态。愈伤组织继代增殖以MS+0.5mg/L 2,4-D+1mg/L NAA+1mg/L 6-BA最好;MS+0.5mg/L IBA适宜于试管苗生根。     

口蹄疫病毒抗原决定簇融合基因转化苜蓿

摘要：通过农杆菌的介导,以携带O型和A型口蹄疫抗原决定簇融合基因O21 O14 A21 HBcAg的植物表达载体转化苜蓿(Medicago sativa)愈伤组织,并再生得到抗性植株。试验建立了苜蓿甘农1号愈伤组织再生系统;优化了农杆菌介导的苜蓿遗传转化系统;获得抗性再生植株4棵;GUS报告基因在转化的愈伤组织中得到瞬时表达;抗性植株PCR检测结果证实目的基因已经成功整合到苜蓿基因组中。     

miR396-MsGRFs参与调控紫花苜蓿愈伤组织再生

紫花苜蓿(Medicago sativa L.)愈伤组织再生率受基因型限制,是影响苜蓿遗传转化效率的主要因素之一。研究发现,GRF转录因子家族基因在提高多种植物愈伤再生中起着重要促进作用。本试验以拟南芥(Arabidopsis thaliana)AtGRF序列为模板,在紫花苜蓿基因组序列中查找,获得了含有miR396靶点的9个MsGRFs基因。除MsGRF3a和MsGRF4a外,其余7个MsGRFs在紫花苜蓿胚性愈伤组织中的表达量均显著高于非胚性愈伤。为了进一步研究MsGRFs对紫花苜蓿愈伤再生效率的影响,我们在紫花苜蓿中转入MIM396基因,降低miR396的表达。结果显示：MIM396植株叶片愈伤组织再生时间显著缩短,再生率显著提高;与野生型愈伤组织相比,在MIM396植株叶片诱导的愈伤组织中,除MsGRF3a外,其余MsGRFs显著高表达。以上研究表明,miR396-MsGRF通路对苜蓿愈伤组织再生起着重要调控作用,这为提高苜蓿再生效率,并打破基因型对不同苜蓿品种再生的限制提供候选基因。     

苜蓿雄性不育系花药愈伤形成及分化培养条件的研究

以苜蓿雄性不育株系及其可育株系的花药为外植体,研究取材时间和不同激素配比对其愈伤组织诱导及分化的影响。结果表明,雄性不育株系花药培养时,以现蕾初期取材、MS为基本培养基的条件下出愈率较理想。愈伤组织诱导的适宜培养基为:MS+0.5mg/L 2,4-D+0.25mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA+3mg/L KT+3%蔗糖+0.7%琼脂(出愈率66.7%);不育与可育植株花药愈伤适宜的分化培养基分别为:MS+1mg/L KT+0.2mg/L NAA+2%蔗糖+0.7%琼脂(分化率75%)和MS+4mg/L KT+0.2mg/L NAA+2%蔗糖+0.7%琼脂(分化率79%)。     

象草幼穗离体培养植株再生研究

以象草幼穗为外植体材料、改良的MS为基本培养基,研究了不同外源激素组合对不同发育时期幼穗愈伤组织诱导和植株再生能力的影响.结果表明,象草幼穗离体培养最适长度为2～5 cm;愈伤组织诱导培养基中添加4.0 mg/L 2,4-D 0.05 mg/L KT和4.0 mg/L 2,4-D 0.10 mg/L KT时,颗粒状愈伤组织诱导率分别为79.0%和72.6%;转入添加3.0 mg/L 2,4-D 0.2 mg/L 6-BA的继代培养基,分别有40.9%和74.0%的愈伤组织保持颗粒状结构;在添加2.0 mg/L CPPU 0.01 mg/L NAA和0.50 mg/L KT 0.5 mg/L IAA的分化培养基上,经过继代培养后的颗粒状愈伤组织的成苗率分别为36.4%和38.5%,总成苗率达50.2%和43.9%.3片叶大小的幼苗转入附加NAA 0.50 mg/L的1/2 MS壮根培养基,试管苗移栽成活率达95%以上.在继代培养过程中逐代选择外表呈白色、干燥、紧密、颗粒状的愈伤组织,是提高其植株再生能力的有效方法.     

多年生黑麦草高频再生体系的建立及农杆菌介导PEPC基因的转化

以多年生黑麦草(Lolium perenne L.)成熟种子作为外植体,建立其高频再生体系,通过农杆菌介导法将磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)基因转入,为多年生黑麦草的抗逆转基因工作奠定基础。结果表明:种子充分灭菌后在附加6.0 mg·L^-1 2,4-D的培养基中诱导愈伤组织,诱导率可达61.33%。愈伤组织在2,4-D浓度减半的培养基上继代培养长势良好,分化培养基为MS培养基附加1.0 mg·L^-16-BA,分化率最高达到61.33%,在1/2 MS+0.5 mg·L^-1 NAA培养基中进行生根培养,生根率达100%。以该再生体系为基础,将获得的愈伤组织作为外植体进行遗传转化,经筛选培养后得到再生植株,通过PCR及实时荧光定量(Real-Time)PCR验证表明PEPC基因已成功转入,转化率为8.67%。试验结果将为多年生黑麦草抗性品种的研究奠定基础。     

野牛草成熟胚植株再生及其影响因素研究

以野牛草Buchloe dactyloides成熟胚为外植体,对外植体灭菌方式及影响成熟胚再生的因素进行了研究.结果表明:70%酒精处理60 s,75% NaClO溶液(原溶液含有效氯为7%～10%)处理30 min,污染率最低为0.59%.6-BA 0.1 mg/L,2,4-D浓度增至3 mg/L时,愈伤组织诱导率达最高,为80.27%,但愈伤组织结构疏松、呈水渍状.附加5 mg/L硝酸银(AgNO3)或硫代硫酸银(STS)时,愈伤组织诱导率略有降低,愈伤组织结构紧密且表面有颗粒状突起,当AgNO3或 STS浓度为10 mg/L以上时,均不利于愈伤组织的诱导.愈伤组织继代培养过程中,3/4倍MS大量元素用量、聚乙烯吡咯烷酮(PVP) 200 mg/L、维生素C(Vc )200 mg/L及水解酪蛋白(CH) 1 000 mg/L可减轻愈伤组织褐化程度.不同诱导培养基所获得的愈伤组织与其植株再生能力有关,以不加任何植物生长调节剂的MS培养基(MS0)为分化培养基,仅在附加STS的诱导培养基中所得的愈伤组织能够形成再生植株,再生率为10%.