FACSAria流式细胞仪无菌操作分选高纯度细胞亚群

BGC823细胞瞬时转染绿色荧光蛋白(GFP)质粒2d后,用FACSAria流式细胞仪分选GFP阳性和阴性BGC823细胞亚群,检测其分选纯度并培养分选后细胞,观察其无菌生长状态;商品化FITC直标抗体孵育SMMC7721细胞后,FACSAria流式细胞仪分选FITC阳性和阴性细胞亚群.将所有分选的细胞进行培养检测无菌状态,并观察细胞生长情况.FACSAria流式细胞仪分选得到的GFP阳性细胞群的分选纯度达99.6％,GFP阴性细胞群的分选纯度达98.8％,同时激光共聚焦荧光显微镜显示分选后的GFP阳性细胞明显富集;分选后的BGC823细胞和SMMC7721细胞常规培养,细胞均无污染且生长状态良好.     

PC12细胞中增强型绿色荧光蛋白基因的表达

目的：研究PC12细胞中增强型绿色荧光蛋白(GFP)基因的表达。方法：用脂质体转染法将增强型GFP基因转入PC12细胞,在荧光显微镜下观察转染细胞GFP表达及荧光强度。用碘化丙啶(PI)标记缺氧血清剥夺再灌流后的PC12／GFP细胞,在流式细胞仪上分选GFP阳性(活)细胞并测定其比例。结果：克隆转移后几乎所有细胞表达GFP,可连续稳定传40代以上。流式细胞仪可精确分选出GFP( )／PI(-)、GFP( )／PI( )、GFP(-)／PI(-)、GFP(-)／PI( )4组细胞。结论：增强型GFP基因可在PC12细胞中稳定高表达。PC12／GFP细胞株的建立为短暂脑缺血再灌流后干预治疗的研究提供了理想的对照实验细胞模型。     

胞浆表达绿色荧光蛋白的伯氏疟原虫的构建和筛选

目的:为了追踪疟原虫发育及侵染的情况,构建及筛选胞浆稳定表达绿色荧光蛋白（GFP）的伯氏疟原虫。方法:构建含有伯氏疟原虫230p基因和GFP基因的重组质粒pL0035-GFP,质粒线性化后通过电转染转入野生型伯氏疟原虫;基于双交换同源重组原理,利用乙胺嘧啶筛选获得在230p基因处插入GFP的重组疟原虫;有限稀释法筛选表达GFP的单克隆重组伯氏疟原虫;PCR鉴定重组疟原虫基因型,荧光显微镜和流式细胞术检测GFP表达情况。结果:PCR及DNA测序结果表明GFP基因成功整合到伯氏疟原虫基因230p;荧光显微镜可观察到重组疟原虫胞浆呈绿色荧光,流式细胞术检测到绿色荧光信号。结论:成功构建胞浆表达绿色荧光蛋白的伯氏疟原虫。     

携EGFP基因的逆转录病毒包装细胞的分选和滴度测定

目的探讨利用荧光激活细胞分选技术获得有效重组逆转录病毒包装细胞系的方法。方法用脂质体介导pLEGFP转染PA317细胞，用荧光显微镜观察转染结果；依据EGFP荧光利用流式细胞仪的分选技术获得多克隆和单克隆源性的包装细胞，并利用PCR、RT-PCR对其鉴定；以NIH3T3为靶细胞，对其滴度进行测定。结果荧光显微镜显示用脂质体介导的方法成功的转染PA317细胞，在4次连续流式细胞仪分选后得到了稳定表达的多克隆和单克隆源性的包装细胞。PCR和RT-PCR分别从多克隆和单克隆源性的包装细胞细胞基因组DNA以及多克隆和部分(6／8)单克隆源性的包装细胞培养上清中的重组逆转录病毒RNA中扩增出了插入的EGFP片段。滴度测定显示得到的包装细胞能够产生有效的病毒滴度。结论荧光激活细胞分选技术是获得有效病毒滴度的包装细胞的有效方法。     

携EGFP基因的逆转录病毒包装细胞的分选和滴度测定

目的 探讨利用荧光激活细胞分选技术获得有效重组逆转录病毒包装细胞系的方法。方法 用脂质体介导pLEGFP转染PA317细胞,用荧光显微镜观察转染结果;依据EGFP荧光利用流式细胞仪的分选技术获得多克隆和单克隆源性的包装细胞,并利用PCR、RT-PCR对其鉴定;以NIH3T3为靶细胞,对其滴度进行测定。结果 荧光显微镜显示用脂质体介导的方法成功的转染PA317细胞,在4次连续流式细胞仪分选后得到了稳定表达的多克隆和单克隆源性的包装细胞。PCR和RT-PCR分别从多克隆和单克隆源性的包装细胞细胞基因组DNA以及多克隆和部分(6/8)单克隆源性的包装细胞培养上清中的重组逆转录病毒RNA中扩增出了插入的EGFP片段。滴度测定显示得到的包装细胞能够产生有效的病毒滴度。结论 荧光激活细胞分选技术是获得有效病毒滴度的包装细胞的有效方法。     

利用CRISPR/Cas9技术构建Aff4基因敲除B16-F10细胞系及AFF4的多克隆抗体制备

目的：利用CRISPR/Cas9技术构建ALF转录伸长因子4(AFF4)基因敲除的小鼠黑色素瘤细胞（B16-F10），自主制备特异的AFF4多克隆抗体。方法：设计一对分别靶向小鼠Aff4基因第3个外显子和第4个内含子的向导RNA(sgRNA)。将构建成功的重组质粒转染至B16-F10细胞中，并利用抗性筛选出单克隆细胞，进行基因型鉴定和AFF4表达水平检测。验证自主制备的AFF4多克隆抗体的特异性。结果：通过基因组DNA鉴定获得两株正确的单克隆细胞系，其Aff4基因m RNA水平（t=53.08,P<0.001）和AFF4蛋白表达水平（t=15.17,P<0.001）显著降低。免疫共沉淀实验和蛋白免疫印迹实验证明自主制备的抗人/鼠AFF4多克隆抗体特异性良好（t=264.7,P<0.000 1）。结论：成功构建了Aff4基因敲除的B16-F10稳定细胞系，并且成功制备抗AFF4蛋白的多克隆抗体。     

单纯疱疹病毒胸苷激酶与绿色荧光蛋白融合基因表达载体的构建

目的建立既有TK活性又表达绿色荧光的融合蛋白治疗系统用于实验研究，为建立荧光活体成像技术，更为科学地进行肿瘤自杀基因增效中药成分的研究打下基础。方法DNA重组技术构建HSV1-TKcDNA与EGFP基因融合的真核细胞表达载体pTKGFP，用晦切鉴定并进行序列测定；polyFect转染液对鼠黑色素瘤细胞B16进行转染，荧光显微镜观察基因表达情况，MTT法检测转化细胞B16对GCV的敏感性。结果重组质粒pTKGFP经限制性酶切鉴定和DNA序列测定分析显示，TK基因已经成功与GFP基因连接，连接处无移码突变产生；荧光显微镜下观察显示，TK—GFP融合基因在B16中获得表达。其在细胞中的定位与文献资料一致，TKGFP主要集中于胞核区而GFP弥散分布于胞质中。TKGFP组细胞对GCV的敏感性大于对照组细胞，差异有显著性。结论构建了pTKGFP融合蛋白基因表达载体，并成功在B16中进行表达，所表达的融合蛋白具有TK活性和GFP的荧光活性，可用于后续性的体外与体内实验。     

髓系特异性SOCS3基因敲除小鼠的构建及应用

目的：通过Cre-loxP基因敲除系统特异性敲除髓系SOCS3基因,构建早期髓系来源抑制细胞（eMDSCs）高浸润荷瘤鼠模型。方法：通过将SOCS3fl/-小鼠与Lyz2-Cre小鼠杂交繁育,获得髓系特异性SOCS3基因敲除小鼠,PCR法鉴定小鼠基因型,Western印迹验证基因敲除效果,流式细胞术检测髓系特异性SOCS3基因敲除小鼠骨髓中eMDSCs比例及其对T细胞的抑制作用,并在该小鼠基础上分别构建乳腺癌、肺癌和黑色素瘤3种eMDSCs高浸润荷瘤鼠模型,流式细胞术检测肿瘤组织中eMDSCs浸润情况。结果：PCR鉴定和Western印迹检测证实髓系特异性SOCS3基因敲除小鼠构建成功,流式细胞术结果表明髓系SOCS3基因敲除小鼠骨髓中eMDSCs比例显著升高（t=17.94,P<0.001）,且该群eMDSCs抑制T细胞增殖（t=14.21,P<0.001）、促进T细胞凋亡（t=13.53,P<0.001）。在黑色素瘤、乳腺癌、肺癌3种髓系特异性SOCS3基因敲除荷瘤鼠的肿瘤组织中eMDSCs数量显著增加（t=24.14、24.56、14.93,均P<0.00...     

LSS基因敲除小鼠的饲养、繁殖及基因型鉴定

探讨羊毛固醇合成酶(LSS)基因敲除鼠的繁育和基因型分析.将引进杂合子小鼠进行饲养并繁育,提取其基因组DNA,利用PCR反应扩增目的 基因片段,鉴定出小鼠的基因型;Westem blot分析并比较LSS基因敲除杂合子小鼠和野生型小鼠的肝脏、皮肤组织中LSS蛋白的表达情况.成功的繁育出LSS基因敲除小鼠,使用PCR鉴定其子代小鼠包括野生型(LSS+/+,Wt)、杂合子(LSS+/-),未出现纯合敲除小鼠;Western blot结果表明:相较于野生型小鼠,LSS基因敲除杂合子小鼠在肝组织和皮肤组织中表达LSS蛋白量少;杂合子敲除鼠的生存能力比野生型小鼠弱.获得LSS基因敲除小鼠,PCR鉴定小鼠基因型具有简单、稳定的优点.     

稳定表达人survivin基因的B16细胞系的建立与鉴定

目的构建人survivin真核表达载体,稳定转染入小鼠黑素瘤B16细胞,建立稳定表达人survivin的小鼠黑素瘤细胞系。方法采用PCR方法扩增出人survivin全长基因的cDNA编码区序列,利用DNA重组技术将其定向插入到真核表达载体pIRES-neo中,并加入酶切位点和6×his标签,得到重组表达质粒pIRES-neo-SUR-(his)6。利用阳离子脂质体介导法将其稳定转染入小鼠黑素瘤B16细胞,经G418加压筛选出阳性克隆。利用RT-PCR、蛋白免疫印迹及免疫荧光等检测方法验证人survivin基因在稳定转染B16细胞株中的表达。结果经限制性内切酶鉴定及序列分析,pIRES-neo-SUR-(his)6重组体构建正确。RT-PCR结果表明:从稳定转染pIRES-neo-SUR-(his)6的B16细胞所抽提的总RNA中能够扩增出survivin基因(约530bp);蛋白免疫印迹结果表明:利用特异抗体能够从稳定转染pIRES-neo-SUR-(his)6的B16细胞中检测到survivin蛋白条带,而对照空质粒转染后的细胞则没有相应的条带;流式细胞仪和激光共聚焦显微镜检测结果显示,稳定转染pIRES-neo-SUR-(his)6的B16细胞用特异性抗体检测到高效的荧光表达,其中5号单克隆的荧光表达率为91.38%,而对照空质粒转染后的细胞则没有相应的荧光表达。结论成功构建了真核表达载体pIRES-neo-SUR-(his)6,建立了稳定转染高效表达人survivin的小鼠黑素瘤细胞系。     

miR-15a/16-1基因敲除小鼠的鉴定及其脾脏免疫细胞频率分析

目的:探讨miR-15a/16-1基因敲除小鼠的繁育与子代鼠的鉴定,及其脾脏免疫细胞频率?方法:从子鼠鼠尾中提取基因组DNA,采用PCR方法进行基因型鉴定?miR-15a/16-1基因敲除小鼠眼眶取血,用动物血液分析仪进行全血细胞分析?采用流式细胞仪分析miR-15a/16-1基因敲除小鼠脾脏中免疫细胞频率?结果:miR-15a/16-1+/+?miR-15a/16-1+/-?miR-15a/16-1-/- 各表型小鼠互交繁殖结果基本符合孟德尔遗传规律?流式结果显示,miR-15a/16-1基因敲除小鼠与野生型小鼠相比,CD19+?NKG2D+ 细胞增多,其余无明显差异?全血细胞分析结果显示淋巴细胞增多?结论:实验所用PCR方法可以鉴定miR-15a/16-1-/-小鼠;miR-15a/16-1-/-小鼠的获得为进一步探究miR-15a/16-1的作用提供了较理想的动物模型;敲除miR-15a/16-1基因,小鼠脾脏CD19+?NKG2D+细胞增多?     

EGFP基因在前列腺癌PC-3M细胞系中的转染与表达

目的 :研究绿色荧光蛋白 (GFP)在前列腺癌 PC- 3M细胞中表达及对其细胞周期的影响。方法 :制备含绿色荧光蛋白基因的重组 DNA,用阳离子脂质体 Lipofectin Regant转染培养的 PC-3M细胞 ,在倒置荧光显微镜下观察 GFP的表达情况 ,同时经流式细胞仪测定阳性克隆的细胞周期。结果 :转染后有 1 0 %～ 1 5%细胞表达绿色荧光蛋白 ,且阳性克隆细胞与亲本细胞的细胞周期无明显改变。结论 :GFP是研究活细胞生命现象的一种新途径     

Marcksl1基因敲除对小鼠成年造血的影响

目的 建立造血系统特异性Marcksl1敲除小鼠,探究该基因敲除对小鼠成年造血的影响。方法 对E15.5 Marcskl1敲除小鼠进行胎肝竞争性移植实验,分析胎肝移植后不同月龄小鼠外周血中成熟功能谱系血细胞的占比。流式分选胎肝KSL细胞,利用RNA-Seq分析该基因敲除后差异基因表达。利用CRISPR/Cas9技术,构建Marcksl1条件敲除小鼠,并与Vav1-Cre小鼠杂交,获得造血系统特异性Marcksl1敲除小鼠。利用PCR和Sanger测序鉴定基因型。利用Real-time PCR检测小鼠骨髓和造血干细胞中Marcksl1 mRNA的表达。利用流式细胞技术分析小鼠骨髓、外周血、脾和胸腺中不同类型造血细胞的占比。通过竞争性骨髓移植实验分析Marcksl1敲除对造血重建的影响。结果 Marcksl1敲除造成胎肝移植后B细胞占比下降、髓系细胞占比升高,骨髓中CLP和CMP占比下降、GMP占比升高。RNA-seq结果显示该基因敲除后导致胎肝KSL细胞中252个基因上调,400个基因下调。GO结果显示差异基因主要富集在免疫应答、质膜以及低压门钙离子通道活性等相关基因。KEGG结果显示差...     

以慢病毒构建的GFP阳性卵巢肿瘤细胞中侧群细胞的分离和动物活体内示踪

 目的 通过慢病毒将绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP)基因转入卵巢癌细胞中,研究慢病毒感染对细胞泵出Hoechst 33342能力的影响,追踪GFP(+)侧群（side population,SP）细胞在裸鼠体内的荧光表达和肿瘤成像。方法 选用人卵巢癌细胞株HO-8910PM,以慢病毒感染GFP基因至人卵巢癌细胞株HO-8910PM,摸索以Ubiquitin启动子构建的慢病毒颗粒对该细胞的最佳感染复数（multiplicity of infection,MOI)。以流式细胞仪分选表达GFP的卵巢癌细胞株,获得高纯度的GFP(+)HO-8910PM,检测GFP表达对Hoechst 33342染色的影响。再以流式细胞仪分选GFP(+)SP细胞,将分选的GFP(+)SP细胞注射入裸鼠皮下,观察GFP(+)SP细胞的致瘤能力,并在体内观测GFP(+)SP来源肿瘤的荧光成像。结果 Ubiquitin启动子构建的慢病毒感染不影响卵巢癌细胞拒染Hoechst 33342的能力,分选的GFP(+)SP细胞仍能在裸鼠体内形成表达GFP的肿瘤,成瘤能力和未感染细胞相比无显著变化,GFP阳性肿瘤在成像系统中可见荧光表达。结论 慢病毒感染不影响卵巢癌细胞拒染Hoechst 33342的能力,慢病毒感染后分选的GFP(+)SP细胞仍能在裸鼠体内形成表达GFP的肿瘤,成瘤能力和未感染细胞相比无显著变化,GFP标记可以作为研究卵巢癌细胞在动物活体内生物学行为的示踪标记。     

鼠原始生殖细胞报告基因系统的建立及验证

目的:构建小鼠原始生殖细胞（PGCs）报告基因系统。方法:根据CRISPR基因编辑技术结合同源重组原理,针对鼠Prdm1和Dppa3基因的翻译起始位点ATG附近位置分别设计一对sgRNA,并根据Cas9切割位点以及拟插入目的片段构建相应的用于同源重组的供体质粒,将sgRNA与Donor质粒同时转染入小鼠胚胎干细胞（ESCs）中,并利用质粒携带的抗性基因筛选出目标单克隆细胞,并进行基因型鉴定。结果:通过提取单克隆细胞的基因组DNA进行基因型鉴定,PCR和Sanger测序结果显示,单克隆细胞的基因组中,Prdm1和Dppa3基因翻译起始位点后分别成功插入eGFP和mCherry荧光蛋白编码序列。利用细胞因子诱导eGFP-Prdm1/mCherry-Dppa3mESCs（mouse ESCs）定向分化为mPGCs（mouse PGCs）,流式细胞仪检测显示诱导分化的mPGCs特异表达eGFP和mCherry荧光信号。结论:成功构建mPGCs报告基因系统,可用于后续研究mPGCs命运决定的分子机制,对于研究小鼠早期胚胎发育过程具有重要意义。     

人G250真核表达载体的构建及稳定转染B16细胞系的建立

目的构建人G250真核表达载体,建立稳定表达人G250的小鼠黑色素瘤细胞系。方法采用PCR方法扩增出人G250基因的cDNA编码区序列,利用DNA重组技术将其定向插入到真核表达载体pIRES-neo-sig中,并加入酶切位点和FLAG标签,得到重组表达质粒pIRES-neo-sig-FLAG-G250。利用阳离子脂质体介导法将其稳定转染入小鼠黑色素瘤B16细胞,经G418加压筛选出阳性克隆。RT-PCR及免疫荧光检测人G250在B16细胞中的表达。结果经限制性内切酶鉴定及序列分析,pIRES-neo-sig-FLAG-G250重组质粒构建正确,最终建立的表达人G250基因的B16细胞系阳性率接近100%。结论成功构建了真核表达载体pIRES-neo-sig-FLAG-G250,建立的稳定转染人G250小鼠黑色素瘤细胞系能够高效表达G250基因。该稳定转染细胞系的建立为G250在肿瘤免疫治疗中的应用奠定了研究基础。     

T细胞条件性敲除Spi1基因小鼠的繁育及鉴定

目的 繁育T细胞条件性敲除Spi1基因的小鼠并对其进行鉴定,为进一步探索Spi1编码蛋白PU.1的作用提供研究基础。方法 将Lck-Cre小鼠与Spi1^flox/flox小鼠进行杂交繁育,通过聚合酶链式反应(PCR)和琼脂糖凝胶电泳鉴定小鼠基因型,筛选出基因型为Lck-Cre×Spi1^flox/flox的小鼠即为T细胞条件性敲除Spi1基因的纯合子小鼠。使用磁珠分选脾脏T淋巴细胞,并应用Westernblot、实时荧光定量PCR(qPCR)及流式细胞术检测PU.1在T细胞中的敲除效率。结果 Lck-Cre×Spi1^flox/flox小鼠基因稳定遗传。与Spi1^flox/flox小鼠相比,Lck-Cre×Spi1^flox/flox小鼠脾脏T细胞中的PU.1表达水平显著降低。结论该研究应用Cre/LoxP系统和CRISPR/Cas9技术成功构建了T细胞条件性敲除Spi1基因小鼠,为后续研究PU.1在T细胞相关疾病中的具体作用提供了可靠的动物模型。     

人乳牙牙髓干细胞体外成骨特性的实验研究

目的研究人乳牙牙髓干细胞体外成骨特性。方法从健康儿童滞留乳牙牙髓组织中分离培养乳牙牙髓干细胞(SHED)后,经流式细胞仪分选出两组细胞。A组:CD34+/CD117+双阳性表达的细胞,B组:剩余的混杂细胞。研究两组细胞各自成骨特性:运用流式细胞仪分选标记干细胞,以免疫细胞化学技术,荧光定量PCR技术检测成骨细胞标记物,并做矿化染色。结果分离培养的细胞呈成纤维细胞样生长,经分选的A、B两组细胞在第30天时免疫细胞化学检测发现均有成骨细胞的标记物RUNX-2、OC、BSP表达,在培养第40天时运用荧光定量PCR检测分析发现A、B两组细胞表达RUNX-2、OC、BSPmRNA基因水平的差异有显著性意义:A组高于B组;在第50天A、B两组细胞运用VonKossa's染色法和茜素红染色法检测,结果显示A组细胞呈阳性表达,B组细胞呈阴性表达。结论纯化后的CD34+/CD117+双阳性表达的SHED具有体外自行成骨特性。     

利用CRISPR/Cpf1系统构建稳定敲除LncRNA458314的肾癌细胞株及其功能探讨

［摘要］目的: 通过新基因编辑系统CRISPR/Cpf1稳定敲除肾癌细胞769P中的LncRNA458314,并初步研究LncRNA458314在肾癌中的作用。方法: 使用CRISPR/Cpf1系统敲除肾癌细胞769P的LncRNA458314,并通过荧光定量PCR检测敲除效率。通过CCK8实验检测LncRNA458314敲除后769P细胞的增殖能力;蛋白质印迹法检测LncRNA458314敲除后769P细胞pAKT、pERK和LC3A/B蛋白的表达。结果： 荧光定量PCR结果表明CRISPR/Cpf1系统成功敲除了目标LncRNA458314,并且通过多次荧光定量PCR检测对比后,挑选了两个稳定LncRNA458314低表达的769P单克隆细胞（6#和13#）用于后续实验。CCK8实验表明,LncRNA458314下调后,肾癌769P细胞的增殖能力明显下降;蛋白质印迹结果表明,LncRNA458314敲除后的769P细胞pAKT、pERK表达水平明显下降,LC3A/B表达水平明显上升。结论： LncRNA458314可能通过调控pAKT、pERK和LC3A/B表达发挥其生物学功能。     

利用CRISPR-Cas9系统敲除小鼠黑色素瘤细胞系MATP基因的初步研究

目的利用CRISPR/Cas9系统,敲除小鼠黑色素瘤细胞系的MATP基因,为MATP基因的功能研究奠定基础。方法利用http://crispr.mit.edu/网站,设计针对MATP的特异性引物,并将引物链接到pCAS9/gRNA1载体。将阳性载体转染小鼠黑色素瘤细胞系B16F10,利用无限稀释的方法获得转染后的单克隆细胞株。提取不同细胞株的基因组,通过测序的方法进一步筛选出发生MATP基因切割的细胞株,并利用Western-blot的方法验证MATP的表达情况。结果成功获得了3株MATP基因敲除的细胞株,Western-blot结果表明,该细胞株不表达MATP蛋白。结论利用pCAS9/gRNA1载体,可以实现B16F10细胞系MATP基因的敲除。