一种优化的PCR方法--降落PCR扩增目的基因

目的尝试用一种新的PCR方法--降落PCR扩增目的基因.方法在构建人CD137-hIgG1Fc-pCDNA3融合蛋白真核表达载体以及在检测HBV多聚酶YMDD变异的过程中运用降落PCR扩增目的基因.结果扩增出的特异性条带与目的基因大小一致.结论降落PCR省却了常规PCR中摸索最适退火温度的过程,对一些Tm值相近的PCR反应可应用一套温度程序扩增,是一种行之有效的PCR方法.     

乙型肝炎病毒荧光PCR基因分型方法的建立和应用

[目的]建立一种在临床上准确、快速、简便地对乙型肝炎病毒进行基因分型（BCD三型）的方法。[方法]大量分析已分型的HBV基因组序列，寻找出HBV各基因型的型特异性碱基的分布规律，设计型特异性的引物和探针，利用已知全序列HBV建立荧光PCR的基因分型方法。并与PCR-RFLP及S基因测序等分型方法作比较。[结果]荧光PCR方法对已知基因组序列的HBV分型结果与基因组分析完全一致，利用大量随机临床标本摸索的最佳反应条件为94℃，1min；94℃，10s，60℃，30s，40个循环。与PCR-RFLP相比，分型结果一致性在84．0％；与S基因测序分型相比，一致性为96．2％。[结论]利用荧光PCR能灵敏、快速、准确地进行乙型肝炎病毒基因分型，方便临床应用和流行病学调查。     

国产乙型肝炎病毒(HBV)核酸扩增(PCR)定量检测试剂盒技术现状介绍

利用核酸扩增技术(PCR)定量检测样本中HBV DNA是乙型肝炎治疗过程中疗效监测的重要手段之一。继乙型肝炎病毒(HBV)核酸扩增(PCR)定性检测试剂盒批准临床使用之后，定量检测试剂盒也已陆续批准临床使用。本文对乙型肝炎病毒(HBV)核酸扩增(PCR)定量检测试剂盒的技术现状，国家定量检测标准品的组成、定值方法、合格标准及国产试剂存在的问题等方面作一粗浅的介绍，以供使用者、临床医生及诊断试剂的研发者参考。     

改良HBV全基因组PCR扩增方法的建立

乙型肝炎是一种严重威胁人体健康的疾病，尤其是在我国，人群中HBV感染率一直居高不下，约有1.3亿人为HBV DNA携带者。由于免疫和药物的双重压力，HBV感染人群存在一定比例的变异株的流行。因此，如何控制变异株的流行，制定新的免疫和检测策略，则需要了解其流行情况。此外，针对变异株感染的抗病毒治疗，也是临床有效治疗HBV感染者的重要一环。这些都需要对HBV的基因组序列进行分析。     

乙型肝炎病毒S基因分型方法的建立

目的 建立乙型肝炎病毒(HBV)S基因分型方法。方法 利用PCR扩增乙型肝炎病毒S基因,对上海地区无症状携带者、慢性乙型肝炎、重型肝炎的HBV DNA进行分型。结果 2例无症状携带者为C型;85例慢性乙型肝炎19例B型(22．3％),53例C型(62.3％)、13例BC混合型(15．3％);16例重型肝炎,B型3例(18．7％)、C型4例(25．0％)、BC混合型9例(56．3％)。结论 新的基因分型方法,简化了传统的序列分型法,结果可靠,操作简便。     

乙型肝炎表面抗原阳性血清经不同方法消毒后用PCR法对HBV—DNA…

经用ＰＣＲ法技术检测，以辐照度值〉１０５μＷ／ｃｍ＾２的紫外线对ＨＢｓＡｇ阳性血清照射８小时，对ＨＢＶ－ＤＮＡ有一定灭活作用。煮沸１０分钟，或者以７５％乙醇作用１小时，对ＨＢＶ－ＤＮＡ灭活能力较差。     

富GC apoE基因PCR扩增条件优化

目的 建立一种简便、准确、高效率的富GC apoE基因的扩增方法。方法 采用加入PCR增效剂和热启动方法扩增apoE增强子和外显子4两位点基因。结果 改变不同增效剂及其浓度和PCR反应温度,可得到apoE内含子1增强子元件（IE1）和apoE外显子4两变羿热点区特异性基因片段。结论 富GC apoE基因可通过提高变性温度及加入二甲基亚砜或甲酰胺等增效剂得到相应特异片段。     

国产荧光定量PCR与COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan v 2.0检测HBV DNA结果比较

目的针对不同HBV分型,比较某国产实时荧光定量PCR试剂与Roche公司COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan v 2.0试剂检测HBV DNA的结果。方法根据HBV分型结果,抽取72份慢性乙型肝炎患者血清标本,用Roche公司COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan v 2.0(试剂A)和某国产实时荧光定量PCR(试剂B)对72份慢性乙型肝炎患者血清标本进行HBV DNA定量检测,以分析针对不同HBV分型样本,国产试剂与试剂A的相关性。结果试剂A和B测得的HBV DNA结果 (IU/mL)以10为底数取对数分别为5.67±1.67和5.72±1.75,两者结果差异无统计学意义(P0.05)。共检测72份样本,其中63例A、B两种试剂检测结果有数值。此63例总相关系数(r)为0.94(P0.01),试剂A与试剂B对63例样本中HBV基因型B型、C型和B/C混合型样本检测结果 r分别为0.94、0.95和0.92(P0.05)。对于HBV DNA定量结果 104IU/mL标本,试剂B与试剂A相关性较低(r=0.31,P=0.35)。结论对于不同的HBV基因型,试剂B与试剂A在检测HBV DNA方面有较好相关性,适用于HBV DNA的临床检测,但在低HBV载量时试剂B与试剂A相关性较低。建议结合临床诊治进程和检测的效率及检测费用等因素,选择适当的检测试剂。     

PCR扩增肠癌组织p53基因失败的原因分析与解决

目的：分析与解决ＰＣＲ扩增肠癌组织ｐ５３基因时失败的问题,为如何解决ＰＣＲ技术在科研应用中的问题提供一个实例,方法：经初步分析,将失败原因确定为ＤＮＡ模板有问题,采用下列方法处理模板再进行ＰＣＲ反应：用７０％乙醇再清洗模板,用新标本重新提取模板,用ＰＣＲ反应成功与失败的模板配成混合模板。比较ＰＣＲ比较与失败所用模板的差异,寻找与证实失败的原因。结果：最终发现溶解ＤＮＡ模板的ＴＥ缓冲液浓度不高,使Ｐ     

用套式基因扩增技术检测乙型肝炎病毒P基因区YMDD变异

目的了解套式基因扩增(nested PCR)技术在检测HBV P基因区酪氨酸-蛋氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸(YMDD)变异中的敏感性和特异性.方法用套式基因扩增技术对3组共85例慢性乙型肝炎患者血清进行YMDD变异检测,检测结果经琼脂糖凝胶电泳判断.第1组40例未经拉米夫定治疗,HBV DNA>5×105拷贝/ml;第2组24例经拉米夫定治疗6～18个月,HBV DNA≤5×105拷贝/ml;第3组21例经拉米夫定治疗6～18个月,HBV DNA>5×105拷贝/ml.结果第1组检出YVDD 2例、YVDD+YIDD 1例,检出率为7.5%;第2组检出YVDD、YIDD各1例,检出率为8.3%;第3组检出YVDD 4例、YIDD 2例、YVDD+YIDD 3例,检出率为42.9%.结论套式基因扩增技术检测YMDD变异具有较高的敏感性和特异性,适合变异株快速检测,尤其适合检测处于弱势的YMDD变异株.     

用套式基因扩增技术检测乙型肝炎病毒P基因区YMDD变异

目的　了解套式基因扩增 (nestedPCR)技术在检测HBVP基因区酪氨酸 -蛋氨酸 -天冬氨酸 -天冬氨酸 (YMDD)变异中的敏感性和特异性。方法　用套式基因扩增技术对 3组共 85例慢性乙型肝炎患者血清进行YMDD变异检测 ,检测结果经琼脂糖凝胶电泳判断。第 1组 :4 0例未经拉米夫定治疗 ,HBVDNA >5× 10 5拷贝 /ml;第 2组 :2 4例经拉米夫定治疗 6～ 18个月 ,HBVDNA≤ 5× 10 5拷贝 /ml;第 3组 :2 1例经拉米夫定治疗 6～ 18个月 ,HBVDNA >5× 10 5拷贝 /ml。结果　第 1组检出YVDD 2例、YVDD YIDD 1例 ,检出率为 7.5 % ;第 2组检出YVDD、YIDD各 1例 ,检出率为 8.3% ;第 3组检出YVDD 4例、YIDD 2例、YVDD YIDD 3例 ,检出率为 4 2 .9%。结论　套式基因扩增技术检测YMDD变异具有较高的敏感性和特异性 ,适合变异株快速检测 ,尤其适合检测处于弱势的YMDD变异株     

核酸扩增检测在血液筛查的初步应用

目的为提高血站供血安全性,探讨核酸扩增检测在血站血液筛查中的可行性。方法在酶联免疫吸附试验(ELISA)常规筛查血液的基础上,采用荧光定量聚合酶链反应（PCR）方法,检测乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、丙型肝炎抗体(抗-HCV)和人免疫缺陷病毒抗体(抗-HIV)1/2呈阴性的献血者微量血浆汇集池标本（20人份×50μl汇集）中的丙肝病毒（HCV）和乙肝病毒（HBV）核酸,再对阳性汇集池中的标本进行单份检测。结果8805份（分442个汇集池）血液被检测HCVRNA,结果有1例（0.01%）为阳性;1441份血液被检测HBVDNA,结果6例（0.4%）为阳性。从标本汇集到筛查出单份阳性献血者大约需要3d。结论ELISA结合荧光定量PCR检测微量血浆汇集池标本的方法筛查血液HBV和HCV感染是可行的,能够进一步提高输血的安全性。     

一种快速检测HBV基因的荧光定量PCR法的建立

目的：利用二聚体蝎型荧光探针技术,建立一种能用于临床的快捷、敏感、特异、价格低廉的HBV实时荧光定量PCR检测方法。方法：根据HBV基因组保守区域precore／core设计二聚体蝎型荧光探针和引物,构建质粒标准品,优化荧光定量PCR条件,并进行方法学评价。结果：所建方法的检测范围为10^1～10^8 copies／μl,灵敏度达到10copies／μl,低拷贝样品的批内和日间重复性（CV）分别为1．71％和2．57％,高拷贝样品的批内和日间GV,分别为3．00％和3．86％。与商品化TaqMan试剂盒相比,本法阳性检出率较高,且检测时间缩短了45min（约减少1／3）,成本降低50％。结论：成功建立了快速检测HBVDNA的二聚体蝎型荧光定量PCR方法,为研发适合临床应用的HBV基因定量检测试剂盒奠定了基础。     

PCR检测HBV-DNA不同试剂和方法的比较

本文对目前部分市售的ＨＢＶＰＣＲ试剂进行了灵敏度和检测率的测定，并在检测ＨＢＶ低水平感染中，用ＰＣＲ和斑点杂交作了比较。结果不同公司试剂盒的ＨＢＶ－ＤＮＡ最低检测浓度从０．１ｆｇ到１ｐｇ不等，同一公司不同批号的ＨＢＶ－ＤＮＡ最低检测浓度也从１００ｆｇ到１００ａｇ不同，差达１０３～１０４倍。ＰＣＲ和斑点杂交在三组不同乙肝标志组中的阳性检测率为ＨＢｓＡｇ（＋）ＨＢｅＡｇ（－）抗ＨＢｅ（－）组：ＰＣＲ７０％，斑点杂交４６．４％；ＨＢｓＡｇ（＋）ＨＢｅＡｇ（－）抗ＨＢｓ（＋）组：ＰＣＲ３５．７％，斑点杂交２．９％；ＨＢｓＡｇ（－）抗ＨＢｅ（＋）抗ＨＢｓ（＋）／ＨＢｃ（＋）组：ＰＣＲ１６．６％，斑点杂交３．３％。三组检测率均Ｐ＜０．０１。因此，目前市售的ＨＢＶＰＣＲ试剂必须标化，ＰＣＲ更适合于检测ＨＢＶ低水平的感染     

优化PCR条件扩增人IL-10 cDNA及其原核表达载体构建

目的：探讨PCR扩增人IL—10基因片段的最佳反应条件并构建人IL—10原核表达载体。方法：运用降落PCR扩增5端GC含量高的人IL—10基因片段，主要对退火温度和热启动等因素进行优化选择；载体和PCR产物经拓扑TA克隆技术连接，常规方法转化、筛选阳性重组质粒。结果：PCR反应的最佳退火温度为68.5℃，此时扩增出的DNA片段大小符合预期设想，并通过茵落PCR和DNA测序得到证实。结论：在上述条件下获得的PCR产物纯度高、非特异性产物少，成功地构建了人IL—10原核表达载体。并提示降落PCR是一种潜在的一步找到最佳扩增条件的方法。     

扩增曲线异常对荧光定量PCR检测乙肝病毒核酸的影响

乙型肝炎病毒（HBV）DNA准确定量对乙型肝炎病人的治疗监测和预后判断有重要的临床指导意义。实时荧光定量聚合酶链反应（FQ—PCR）是目前测定HBVDNA较为简便、敏感和特异的方法。影响实时荧光PCR准确定量的因素很多．我们在对血清HBVDNA定量检测中发现个别标本的PCR扩增曲线荧光强度增加特别不明显且不规则（以下称“异常扩增曲线”），致检测结果明显偏低，对此我们进行了分析。     

低变性温度共扩增PCR及其衍生技术的研究进展

低变性温度共扩增PCR(COLD-PCR)技术具有灵敏度高、特异性强、重复性好、成本低廉等优点。该技术及其衍生技术能够优先富集高野生背景下已知或未知的少量突变,在肿瘤个体化诊断、无创性产前诊断、HBV基因型耐药监测等领域具有广泛的应用前景。本文对此类技术及应用进展作一综述,旨在为其临床及实验室应用提供参考。     

一种新型实时荧光PCR检测系统对血浆中乙型肝炎病毒检测的对比观察

目的建立一种灵敏、快速的实时荧光PCR检测系统对HBV进行筛查和准确定量。方法采用本研究建立的实时荧光PCR检测对30例慢性HBV患者的血样和70份献血员血样进行HBV检测并将30例HBV阳性样本进行基因分型测定,与一种商品化的检测进行对比。结果采用WHO国际标准品来评价该检测系统的检测灵敏度,批内和批间变异系数（CV）分别为1．4％-9．4％,0．0％～2．3％。与上海科华HBV核酸检测系统的检测结果相关性良好（r=0．95,P〈0．0001）。结论：该检测系统可以对血浆中的HBV进行检测以及准确定量,可以用来筛查献血员以及进行HBV、HIV和HCV多重检测,并进行大规模的应用。