C-myc反义寡核苷酸对结肠癌细胞SW480增殖及凋亡的影响

目的：观察脂质体介导的c—myc正反义寡核苷酸对结肠癌细胞SW480增殖和凋亡的影响。方法：通过脂质体将c—myc反义寡核苷酸转入人结肠癌细胞SW480，western blot动态监测c—myc蛋白的表达情况，MTT法、流式细胞仪测定c—myc正反义寡核苷酸对SW480细胞增殖和凋亡的影响。结果：c—myc反义核苷酸对SW480细胞有明显的促进凋亡和抑制增殖的作用，而正义寡核苷酸没有这样的作用。结论：c—myc反义核苷酸具有明显的抗肿瘤作用，可以抑制肿瘤细胞生长，促进肿瘤细胞凋亡，可能成为治疗肿瘤的药物。     

反义c-myc寡核苷酸对hTERT蛋白表达抑制作用的研究

目的 探讨脂质体LipfectAMINE^TM（LR）介导的反义c—myc寡核苷酸（ASODN）对乳腺癌MCF-7细胞hTERT蛋白表达的抑制作用。方法 应用免疫细胞化学ABC法检测转染反义、正义及未转染细胞巾hTERT蛋白的表达情况。结果 免疫细胞化学显示转染反义、正义与未转染细胞的hTERT蛋白表达分别为23％、96％、99％（P〈0．01），表明转染反义c—myc的MCF-7细胞hTERT蛋白表达明显降低。结论 反义c—myc寡核苷酸可以抑制hTERT蛋白的表达。     

靶向抑制survivin对结肠癌细胞凋亡及增殖效应的影响

目的探讨survivin反义寡核苷酸对结肠癌细胞凋亡及增殖效应的影响及机制。方法在脂质体介导下将不同浓度的survivin反义寡核苷酸（ASODN）转染入结肠癌细胞株SW480，用免疫组化染色检测结肠癌细胞株survivin蛋白的表达；激酶活性检测法测定细胞内caspase-3活性变化；用流式细胞仪检测Annexin—V—FITC标记的凋亡细胞；用四唑盐比色法（MTT）检测细胞生长活性及其生长抑制率。结果survivin ASODN能有效下调survivin蛋白表达，细胞凋亡率及生长抑制率也随转染剂量增加而逐渐递增，与对照组比较差异有显著性（P〈0．01）。同时，各ASODN组caspase-3活性明显高于对照组（P〈0．01），且随浓度的增加caspase-3活性越高。结论脂质体介导转染survivin反义寡核苷酸可以有效降低细胞内survivin蛋白的表达，诱导细胞发生凋亡，抑制结肠癌细胞生长。     

反义c-myc寡核苷酸对骨肉瘤MG-63细胞增殖和凋亡的影响

目的研究反义c-myc寡核苷酸（c-mycASODN）对人骨肉瘤MG-63细胞增殖和凋亡的影响。方法设计c—mycASODN片段，转染入人骨肉瘤MG-63细胞，通过MTT检测、HE染色光镜观察、透射电镜超微结构及流式细胞仪（FCM）分析，观察和分析其对瘤细胞体外增殖、凋亡、细胞周期及c-myc基因蛋白的影响。结果MTT示c—mycASODN可抑制人骨肉瘤MG-63细胞的体外增殖，10．0μmol／L、作用48h效果最明显，形态学观察到典型瘤细胞凋亡特征，流式细胞仪分析证实反义c—myc寡核苷酸主要阻止瘤细胞进入S期，出现明显的凋亡峰，凋亡率达36.82％，并可抑制c-myc基因蛋白的表达。结论反义c-myc寡核苷酸可诱导人骨肉瘤MG-63细胞的凋亡，对瘤细胞的增殖有抑制作用。     

FHIT转染对丝裂霉素诱导结肠癌细胞凋亡的影响

目的:研究FHIT转染对丝裂霉素诱导结肠癌细胞凋亡的影响。方法:将FIHT基因及其空载体转染至SW480细胞,Western blot检测SW480细胞FHIT蛋白的表达,MTT检测丝裂霉素对转染FHIT细胞和转染空载体细胞的生长抑制率,流式细胞仪分析丝裂霉素处理后细胞凋亡率。结果:FHIT基因转染后,可以检测到FHIT蛋白的表达;MTT法检测同等浓度的丝裂霉素对FHIT+SW480细胞的生长抑制率要明显高于FHIT-SW480细胞;丝裂霉素处理后,FHIT+SW480细胞的凋亡率均明显高于FHIT-SW480细胞。结论:真核质粒介导的FHIT基因转染本身不能促进肿瘤细胞的凋亡,但是FHIT基因转染后可以使得细胞对抗癌药物丝裂霉素的敏感性增加。     

bFGF反义寡核苷酸对肺癌细胞凋亡的影响

目的：探讨碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）反义寡核苷酸对肺癌细胞凋亡的影响。方法：以脂质体作为转染载体，转染bFGF反义寡核苷酸于SH-77细胞，用Western blot方法检测bFGF蛋白的表达，用流式细胞仪检测SH-77细胞凋亡率。结果：与随机对照序列组相比,bFGF反义寡核苷酸对SH-77细胞中bFGF蛋白表达有明显抑制作用，P〈0．05；可使SH-77细胞凋亡率明显增加，P％0．01。结论：bFGF在肺癌细胞凋亡中有重要调节作用，可作为肺癌增敏治疗的有效靶点。     

Chk2反义寡核苷酸对放射线照射诱导的HeLa细胞凋亡的影响

目的：观察宫颈癌细胞HeLa转染chk2反义寡核苷酸后，在X射线作用下对凋亡的影响。方法：以脂质体为载体将chk2正义链和反义链转染HeLa细胞，用Western blot检测HeLa细胞中Chk2蛋白的表达，用流式细胞仪和TUNEL法检测X射线照射后细胞凋亡率。结果：反义封闭chk2可明显抑制Chk2蛋白表达（P〈0．01），X射线作用下细胞凋亡率明显高于转染正义链组（P〈0．01）。结论：反义封闭chk2基因可增加He-La细胞对X射线照射的凋亡敏感性。     

香加皮杠柳苷通过抑制Wnt／β-catenin信号通路诱导结肠癌细胞SW480凋亡

背景与目的：Wnt／β-catenin信号通路在人类肿瘤尤其在大肠癌的发生发展中起着重要作用。本研究分析了香加皮杠柳苷（periplocin extracted fromcortex periplocae,CPP）对人结肠癌细胞SW480增殖的抑制作用,及对Wnt／β-catenin信号通路的调控作用。方法：MTT法检测CPP对SW480细胞增殖的影响,流式细胞技术检测细胞周期的变化和凋亡。Western blot法检测CPP处理组与对照组细胞总蛋白、细胞浆蛋白及细胞核蛋白中β-catenin表达变化,电泳迁移率改变法分析CPP作用后SW480细胞核TCF复合物与其特异性DNA结合序列结合能力变化。半定量RT—PCR法检测CPP作用后细胞中β-catenin、survivin、c—myc和cyclin D1mRNA的表达。结果：CPP明显抑制SW480细胞增殖（P〈0．01）,并呈时间和浓度依赖性;0．5μg／mLCPP可将SW480细胞阻滞于G0／G1期,并诱导细胞凋亡（P〈0．05）。CPP作用后SW480细胞总蛋白、胞浆蛋白及细胞核蛋白中的B—catenin表达均明显降低（P〈0．01）,细胞核中TCF复合物与其特异性DNA结合序列结合能力受到抑制,其下游靶基因mRNA表达水平下降（P〈0．01）,而β-cateninmRNA表达未见明显改变。结论：CPP可明显抑制SW480细胞增殖并诱导细胞凋亡,其作用机制与抑制细胞Wnt／β-catenin信号转导通路有关。     

c-erbB-2与c-raf-1反义寡核苷酸转染对卵巢癌SKOV3细胞的作用

目的：探讨c—erbB-2与c—raf-1基因ASODN联合转染对人卵巢癌细胞增殖的抑制作用及其分子机制。方法：实验分为7组：对照组、c—erbB-2正义治疗组、c—raf-1正义治疗组、c—erbB-2反义治疗组、c—raf-1反义治疗组、全剂量联合治疗组和半剂量联合治疗组。脂质体转染后不同时间分别进行MTT试验、集落形成试验、荧光显微镜检测、蛋白质荧光强度测定与免疫组织化学检查，以观察不同条件处理后各组细胞的增殖、凋亡、蛋白质表达有无差别。结果：与对照组比较，全剂量联合治疗组和半剂量联合治疗组，转染72h的光密度值分别为0．151（P〈0．005）和0．073（P〈0．005），增殖抑制率分别达到了88．7％和94．5％，克隆形成率分别为19．4％（P〈0．01）和12.8％（P〈0．01），凋亡率分别为24.3％（P〈0．05）和31．5％（P〈0．01），同时明显地下调了c—erbB-2、c—raf-1、PCNA、c-jun、c—fos基因蛋白质的表达水平。结论：c—erbB-2与c—raf-1基因反义寡核苷酸联合转染对人卵巢癌SKOV，细胞增殖的抑制作用优于单反义基因，其对卵巢癌细胞增殖的抑制作用可能通过下调c—erbB-2、c—raf-1、PCNA、c-jun、c—fos基因蛋白的表达水平实现。     

慢病毒介导的RNA干扰沉默KIF14表达对结肠癌细胞生长和转移的影响

目的:探讨慢病毒介导RNA干扰沉默KIF14表达对结肠癌SW480细胞生长和转移的影响。方法:采用脂质体法将构建的慢病毒靶向siRNA-KIF14干扰载体转入SW480细胞后,采用RT-PCR和Western blot检测KIF14 mRNA和蛋白的表达,MTT法、流式细胞仪和Transwell小室实验分别检测SW480细胞增殖、凋亡和侵袭,Western blot检测上皮-间质转化相关蛋白N-cadherin、E-cadherin和Vimentin的表达。结果:转染SW480细胞后成功下调KIF14 mRNA和蛋白的表达。与未转染细胞相比,下调KIF14的表达可抑制SW480细胞增殖、侵袭和上皮-间质转化,并促进细胞凋亡（P＜0.05）。结论:下调KIF14表达可抑制结肠癌SW480细胞生长和转移。     

环氧化酶2启动子调控促凋亡基因BAX在卵巢癌细胞系的特异性高表达

目的:验证环氧化酶-2(COX-2)启动子能调控下游基因特异性在COX-2阳性的卵巢癌细胞系高表达;并以CMV启动子为对照,分析COX-2启动子的转录效率.方法:构建重组质粒COX-2-BAX和CMV-Luc.脂质体介导分别把质粒phPES2,CMV-Luc瞬时转染COX-2阳性的卵巢癌细胞系SKOV-3和COX-2阴性的结肠癌细胞系SW480,检测荧光素酶报告基因的表达情况.同法把质粒COX-2-BAX、pcDNA3-BAX转染SKOV-3和SW480,流式细胞仪检测细胞凋亡率.结果:成功构建重组质粒COX-2-BAX和CMV-Luc.COX-2-Luc转染SKOV3和SW480细胞24 h后报告基因活性分别为1554±86.5和53.7±10.9.CMV-Luc财法转染后,报告基因活性分别为9851.7±129.5和8831.0±167.3.COX-2-BAX转染SKOV-3和SW480细胞36 h后细胞凋亡率分别为10.4%,3.7%;CMV-BAX同法转染后,细胞凋亡率分别为21.7%,25.6%.结论:COX-2启动子可调控下游基因特异性地在COX-2阳性的卵巢癌细胞系中高表达,但转录效率明显低于CMV启动子.含COX-2启动子经合理修饰后可用于卵巢癌的基因治疗.     

细丝蛋白A抑制荷人结肠腺癌细胞SW480裸鼠移植瘤的生长

目的:探讨细丝蛋白A(fi lamin A,FLNa)基因对人结肠腺癌SW480细胞在裸鼠体内成瘤的影响及其可能的机制。方法:将重组载体质粒pcDNA3.1/V5-His-TOPO/FLNa通过脂质体介导的方式转染到SW480细胞中,RT-PCR和蛋白质印迹法检测SW480/FLNa细胞中FLNa mRNA和蛋白的表达,MTT法检测细胞的体外增殖能力。将SW480/FLNa、SW480/pcDNA3.1和SW480细胞接种于裸鼠皮下,观察移植瘤的生长情况,计算抑瘤率,HE染色观察移植瘤组织的形态学变化,RT-PCR和蛋白质印迹法检测移植瘤组织中基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinases-9,MMP-9)mRNA和蛋白的表达水平。结果:FLNa基因在SW480细胞中获得稳定表达,SW480/FLNa、SW480/pcDNA3.1和SW480细胞的体外增殖能力相似;SW480/FLNa组移植瘤的生长速度和质量低于SW480组,抑瘤率为(88.7±3.5)%(P=0.000);SW480/FLNa组移植瘤组织出现退变坏死,MMP-9mRNA和蛋白的表达水平(0.11±0.02和0.02±0.00)均低于SW480组(1.12±0.02和1.25±0.05),差异均有统计学意义(P=0.012,P=0.025)。结论:FLNa基因具有抑制人结肠腺癌SW480细胞在裸鼠体内的生长作用,其作用机制可能与下调MMP-9的表达有关。     

Enhancing radiosensitivity of Hela cells by combining transfection of bcl-2 c-myc ASODNs

Previous studies have detected bcl2 and c-myc upregulated in Hela cells. In this study, we investigated the effect on apoptosis of Hela cells by combining transfection of bcl2 and c-myc antisense oligonucleotides(ASODNs), and to explore the relationship between combining gene transfection and radiosensitivity of Hela cells, furthermore, to seek a new method to enhance the radiosensitivity of tumor cells. ASODNs of bcl2 and c-myc coated with cationic liposomes were designed and synthesized and transfected to Hela cells. The expressions of BCL2 and C-MYC were assessed by immunohistochemistry (IHC) staining and flow cytometry (FCM), and the induced-apoptosis phenomenon of Hela cells transfected with bcl2 ASODN or c-myc ASODN was observed by Giemsa Staining, DNA Ladder and FCM. Irradiation was performed on ASODNs transfected cells, then the radiosensitivity, biological reaction and cell proliferation of the transfected cells were investigated by cellular clone formation analysis, MTT assay and FCM. Both bcl2 and c-myc ASODNs could partially inhibit the growth of Hela cells by reducing the expression of bcl2 and c-myc (p < 0.05). The apoptosis rate of Hela cells treated with bcl2 ASODN was 6.60 +/- 0.70%, c-myc ASODN 10.29 +/- 0.66%, bcl2 + c-myc ASODNs 11.83 +/- 0.57 %, which were much higher than that of control 1.79 +/- 0.19%(p < 0.05). The sensitivity enhancement ratio(SER) of Hela cells transfected with bcl2 ASODN,c-myc ASODN and bcl2 + c-myc ASODNs was 1.20, 1.53 and 2.18 respectively. Combining transfection of bcl2 and c-myc ASODN could more effectively induce apoptosis of Hela cells, which subsequently enhanced radiosensitivity of Hela cells. Furthermore, combining transfection ASODNs of apoptosis-inhibiting genes or oncogenes followed radiotherapy to malignant tumor cells might be a new potential strategy.     

外源性FHIT基因对奥曲肽诱导胃癌细胞MGC-803凋亡的影响

目的:探讨外源性脆性组氨酸三联体(fragile histidine triad, FHIT)基因对奥曲肽(octreotide)诱导胃癌细胞凋亡的影响,并探讨其作用机制.方法:采用脂质体法将带有FHIT基因的表达载体pRcCMV-FHIT和空载体pRcCMV分别转入FHIT表达缺失的人类胃癌细胞系MGC-803中.Western 印迹法检测转染细胞中FHIT蛋白的表达.使用不同浓度的奥曲肽(10~(-10)、10~(-9)、10~(-8) 、10~(-7)和10~(-6)mol/L)分别处理各组细胞24、48 和72 h, MTT法检测分析细胞增殖情况,FCM法检测细胞凋亡. Western印迹法检测奥曲肽作用细胞前后,细胞中bcl-2和bax的表达.结果:转染FHIT基因后,胃癌细胞系MGC-803中检测到FHIT蛋白的表达.奥曲肽(10~(-8) mol/L)处理细胞48 h后,转染FHIT基因组细胞的凋亡率为(26.777±1.702)%,与转染空载体组的(13.800±0.511)%和空白细胞组的(12.634±0.479)%相比,凋亡率明显增高(F=245.789,P<0.05,).转染FHIT基因组细胞经奥曲肽处理后bcl-2蛋白表达量减少,bax蛋白表达量增加.结论:外源性FHIT基因表达与奥曲肽可协同促进胃癌细胞MGC-803凋亡,其机制可能与bcl-2家族中的凋亡相关蛋白改变有关.     

miR-34a对结肠癌细胞SW480增殖、迁移和侵袭能力的影响及机制探讨

目的 探讨miR-34a对结肠癌细胞株SW480增殖、侵袭和迁移能力的影响及可能的作用机制。方法将miR-34a过表达慢病毒、空病毒载体转染SW480细胞,未做处理细胞作为空白对照组。Real-time PCR检测各组细胞内miR-34a的表达;CCK8法检测细胞增殖能力;划痕实验、Transwell小室实验检测细胞迁移和侵袭能力;Western blot实验检测细胞内E-cadherin和Vimentin蛋白表达。结果 与空病毒载体组及空白对照组相比,转染组细胞中miR-34a的表达增高,且细胞增殖效率、侵袭和迁移能力降低(P＜0.05),miR-34a使E-cadherin蛋白表达增加、Vimentin蛋白表达降低。结论 miR-34a可抑制结肠癌细胞SW480增殖、侵袭和迁移能力,并能影响E-cadherin和Vimentin的表达,miR-34a有望成为干预结肠癌转移和复发的分子靶点。     

Survivin基因的shRNA 干扰对结肠癌SW480 细胞增殖和凋亡的影响*

目的:以携带shRNA 片段的腺病毒为载体,对结肠癌细胞SW480 中Survivin基因的表达进行干扰,研究其对肿瘤细胞中Survivin基因沉默效果及对细胞周期、凋亡和增殖的影响。方法:将构建好的携带Survivin-shRNA 片段腺病毒,体外转染结肠癌细胞株SW480。以EGFP为报告基因,采用流式细胞计数测定不同感染复数（MOI）下的转染效率,选取适当病毒浓度进行下一步实验。通过RT-PCR 和Western blot检测基因沉默后结肠癌细胞内Survivin mRNA和蛋白的表达水平;在Annexin V-FITC 和PI染色后通过流式细胞术检测并分析Survivin基因沉默后细胞周期和凋亡的变化;同时采用噻唑蓝（MTT）法、克隆增殖实验对细胞不同时期增殖活性进行观察,明确对细胞增殖的抑制时效性。结果:腺病毒转染后MOI 值在0～50时,剂量与转染效率成正比,确定最佳MOI 值为50并进行后续实验;shRNA 干扰后细胞内Survivin mRNA和蛋白表达水平降低,较对照细胞组差异有统计学意义（P<0.01）。 流式细胞仪检测结果显示基因沉默后细胞凋亡率升高,与对照组相比差异有统计学意义（P<0.01）。 同时基因沉默后,细胞周期也有明显变化,表现为G1/S 期细胞增多和G2/M期细胞减少,与对照细胞组相比差异有统计学意义（P<0.05）。 MTT 和单克隆平板实验均显示Survivin基因的沉默,对细胞的增殖和生长均具有明显抑制作用（P<0.05）。 结论:采用腺病毒对结肠癌进行靶向Survivin基因的shRNA 干扰,能有效降低目的基因的表达。其介导的Survivin基因的沉默,可以有效的诱导结肠癌细胞凋亡,同时Survivin基因可以通过抑制细胞G1/S 期转化来阻止细胞分裂,抑制细胞生长。      

高表达GRIM-19诱导结肠癌SW480细胞凋亡

目的：研究干扰素/维甲酸诱导死亡基因（retinoidinterferoninduced mortality,GRIM19）对结肠癌SW480细胞凋亡的影响。方法：构建GRIM19真核表达载体（pCMVFlagGRIM19）,转染入SW480细胞中,Western blotting检测GRIM19及凋亡相关蛋白Balxl的表达,采用AnnexinV/PI和线粒体膜电位JC-1染色检测SW480细胞的凋亡。结果：成功构建pCMVFlagGRIM19真核表达载体。pCMV-Flag-GRIM-19质粒转染SW480细胞后,GRIM19的表达上调,凋亡抑制蛋白Bclxl的表达则下调。转染空质粒pCMVFlag组SW480细胞凋亡率为（7.7±1.39）%,转染pCMV-Flag-GRIM-19质粒后SW480细胞凋亡率为（15.0±2.52）%（P<0.05）。线粒体膜电位检测显示转染空质粒pCMVFlag组SW480细胞膜电位降低细胞为（7.5±2.09）%,而转染pCMVFlagGRIM19后细胞线粒体膜电位降低细胞为（17.5±3.07）%（P<0.05）。结论：GRIM-19体外转染可有效诱导结肠癌SW480细胞凋亡。     

AP-2α基因转染对人类结肠癌SW480细胞体外增生及侵袭能力的影响

目的 探讨AP-2α基因对人类结肠癌SW480细胞体外增生及侵袭能力的影响.方法 构建PODNA3.1(+)-AP-2α真核表达载体,利用脂质体介导pcDNA3.1(+)-AP-2α和pcDNA3.1(+)转染5W480细胞,并以正常SW480细胞作为空白对照;采用RT-PCR与Western blotting分别检测转染48 h后各组细胞中AP-2αmRNA与蛋白的表达情况;采用平板克隆、软琼脂克隆形成试验以及Transweil侵袭试验,分别检测各组细胞体外增生及侵袭能力.结果 SW480细胞内源性AP-2α蛋白表达缺失;转染AP-2α基因后,在SW480细胞中可检测到高水平的AP-2αmRNA及蛋白,细胞克隆形成率降低(P<0.05),软琼脂克隆体积小且数量少,细胞侵袭能力下降(P<0.05).结论 转染AP-2α基因可以抑制人类结肠癌SW480细胞的体外恶性增生以及侵袭能力.     

Simultaneous knockdown of APRIL via multiple shRNAs reduces the malignancy of SW480 cells

A proliferation-inducing ligand (APRIL) is a key factor involved in the tumor development and progression in some tumor tissues and cells. Its overexpression and as gene target in SW480 colon carcinoma cells was confirmed in our previous study. To seek a more potent way to treat colon carcinoma using a gene therapy method, herein, we constructed a multiple short hairpin RNA (shRNA) expression vector containing four shRNAs against the APRIL gene in SW480 cells. APRIL expression levels and cell biological behavior were detected after transfection with different kinds of vectors. As expected, we found that our multiple shRNA vector produced a more significant knockdown effect of APRIL than the vectors containing only one APRIL shRNA. Furthermore, our findings indicate that silencing APRIL expression in SW480 cells decreased their malignancy by reducing proliferation, invasion and adhesion, as well as inducing apoptosis. Based on our findings, vectors containing multiple shRNAs to silence the expression of APRIL may be exploited as a novel therapeutic strategy for tumors.