miR-29c过表达对P19细胞增殖、凋亡和分化影响的研究

目的：探讨miR-29c过表达对P19细胞增殖、凋亡和分化的影响及机制。方法：(1)体外传代培养P19细胞,利用细胞转染技术构建miR-29c过表达组(mimic组),荧光观察和定量PCR验证miR-29c过表达效率。(2)CCK-8试剂盒检测细胞增殖;(3)Hoechst染色结合流式细胞技术检测凋亡情况,定量PCR检测凋亡相关基因Bax/Bcl-2表达情况;(4)二甲亚砜(DMSO)诱导P19细胞分化,定量PCR检测心肌特异性标志基因肌球蛋白重链(α-myosin heavy chain,αMHC), 转录因子GATA4和心肌增强因子2c(Myocyte enhancer factor 2c,Mef2c)表达情况,明确miR-29c过表达对P19细胞分化的影响;(5)蛋白质免疫印迹(Western blot)验证Akt3为miR-29c的靶基因。结果：miR-29c过表达组细胞与对照组相比,增殖速率更慢,凋亡率高于对照组,Bax表达水平高于对照组而Bcl-2表达无明显差异;P19细胞分化第6天和第8天miR-29c过表达组αMHC, GATA4和Mef2c的表达水平显著高于对照组;miR-29c过表达组的p-Akt3蛋白表达水平高于对照组,而miR-29c沉默组的p-Akt3蛋白表达水平低于对照组。结论：miR-29c过表达可能是通过调控Akt3来抑制P19细胞增殖,促进P19细胞凋亡和分化。     

沉默HERC4表达可抑制宫颈癌细胞的增殖、凋亡和迁移

目的 探讨HERC4对宫颈癌细胞生物学功能的影响及其分子机制.方法 设计特异HERC4siRNA干扰序列,Lipofectamine2000法转染Hela细胞,Western blotting检测转染特异siRNA后Hela细胞HERC4蛋白的表达水平;CCK-8法检测转染后Hela细胞的增殖能力;Annexin V-FITC/PI双染法检测转染后Hela细胞凋亡率的变化;划痕实验检测转染后Hela细胞迁移能力.Western blotting检测转染后Hela细胞CyclinD1、Bcl-2表达变化.结果 转染特异siRNA后Hela细胞HERC4蛋白表达量明显下降,差异有统计学意义(P＜0.01).与对照组相比,干扰组Hela细胞生长速度明显减慢,细胞凋亡率增加,迁移能力明显下降,差异有统计学意义(P＜0.01).转染后Cyclin D1和Bcl-2在蛋白水平的表达显著下调(P＜0.01).结论 siRNA可有效降低宫颈癌Hela细胞中HERC4的表达,并通过抑制Cyclin D1表达抑制宫颈癌Hela细胞的增殖和迁移能力,抑制Bcl-2表达增加细胞凋亡能力.     

miR-195表达调控对大肠癌细胞HT-29增殖和凋亡的影响及其机制探讨

目的:探讨miR-195对大肠癌细胞HT-29增殖和凋亡的影响及可能的机制。方法:应用脂质体转染的方法,将miR-195 mimics转染入HT-29细胞,q RT-PCR检测转染后miR-195的表达,分别采用CCK-8法及流式细胞术检测细胞增殖和凋亡情况,qRT-PCR和Western blot检测转染后VEGFA mRNA和蛋白表达变化。结果:与NC组比较,miR-195 mimics转染组明显上调HT-29细胞miR-195的表达,抑制细胞增殖,促进细胞凋亡,下调VEGFA mRNA及蛋白表达,两组比较差异均有统计学意义(P0.05)。结论:上调HT-29细胞的miR-195表达,可明显抑制细胞增殖、促进细胞凋亡,其机制可能与抑制其靶基因VEGFA表达相关。     

过表达miR-140-5p促进前列腺癌细胞凋亡抑制其增殖

［摘要］ 目的研究miR-140-5p在前列腺癌细胞中的表达情况,探讨 miR-140-5p在前列腺癌细胞中的生物学功能。 方法RT-qPCR方法检测前列腺癌细胞株PC3细胞及DU145细胞中miR-140-5p表达;PC3细胞中转染miR-140-5p模拟物或抑制物,CCK-8及AnnexinV/PI双染流式细胞学检测细胞活力及细胞凋亡。TCGA数据库分析高表达miR-140-5p与前列腺癌患者总生存率的关系。 结果miR-140-5p在DU145及PC3细胞中的表达明显低于RWPE-1细胞,miR-140-5p在PC3细胞中的表达明显低于DU145细胞（P＜0.05）。转染miR-140-5p模拟物的 PC3细胞中miR-140-5p相对表达量明显高于阴性对照组（P＜0.05）。miR-140-5p的模拟物转染PC3细胞48 h,过表达组细胞增殖率低于阴性对照组,凋亡率高于阴性对照组（P＜0.05）。转染miR-140-5p抑制物的PC3细胞中miR-140-5p相对表达量明显低于阴性对照组（P＜0.05）。敲低miR-140-5p表达组细胞增殖率明显高于阴性对照组,凋亡率明显低于阴性对照组（P＜0.05）。低表达miR-140-5p组患者总生存率低于高表达miR-140-5p组患者（P＜0.05）。 结论miR-140-5p在前列腺癌细胞株低表达,低表达miR-140-5p前列腺癌患者预后不良;过表达miR-140-5p可促进前列腺癌细胞凋亡,抑制其增殖。     

miR-92b对胃癌细胞周期和凋亡的影响

目的观察miR-92b对胃癌细胞周期和凋亡的影响。方法在胃癌SGC-7901细胞中瞬时转染化学修饰的microRNA抑制物,抑制miR-92b的表达。采用流式细胞术检测细胞周期和凋亡变化,并在荧光显微镜下观察细胞形态,western blot检测Bcl-2和p53的变化。结果抑制miR-92b表达后,细胞周期延缓,凋亡细胞比率增加,细胞核皱缩,Bcl-2和p53表达下调。结论 miR-92b在胃癌发展过程中推动细胞通过周期限制点,加速细胞生长,并可能通过抑制线粒体凋亡途径促进胃癌细胞增殖。     

miR⁃29c过表达对P19细胞增殖、凋亡和分化的影响

目的：探讨microRNA?29c（miR?29c）过表达对P19细胞增殖、凋亡和分化的影响及机制。方法：体外传代培养P19细胞,利用细胞转染技术构建miR?29c过表达细胞（mimic组）。CCK?8试剂盒检测细胞增殖,流式细胞技术检测细胞周期;Hoechst染色结合流式细胞技术检测细胞凋亡情况,定量PCR和蛋白质免疫印迹（Western blot）检测凋亡相关因子Bax/Bcl?2表达情况;二甲亚砜（DMSO）诱导P19细胞分化,定量PCR检测心肌特异性标志基因肌球蛋白重链（α?myosin heavy chain,αMHC）,转录因子GATA4和心肌增强因子2c（myocyte enhancer factor 2c,Mef2c）表达情况,明确miR?29c过表达对P19细胞分化的影响;生物信息学分析结合荧光素酶报告实验和Western blot明确miR?29c的靶基因。结果：与对照组相比,miR?29c过表达组细胞增殖速率较慢,细胞周期S期比例降低;miR?29c过表达组细胞凋亡率增高,Bax表达水平增高,而Bcl?2表达无明显差异;P19细胞分化第6天和第8天miR?29c过表达组αMHC、GATA4和Mef2c的表达水平显著高于对照组;Akt3被证实为miR?29c的靶基因。结论：miR?29c过表达可能是通过调控Akt3来抑制P19细胞增殖、促进P19细胞的凋亡和分化。     

miR-144通过LIS1抑制胆管癌细胞的增殖和侵袭

目的:筛选并验证miR-144的可能作用靶点,阐明miR-144的生物学功能.方法:通过miRanda、PicTar和Target Scan软件预测并验证miR-144可能的靶基因;构建双荧光素酶报告基因,验证miR-144与靶基因的直接结合,并明确其结合位点;利用siRNA干扰沉默无脑回致病基因LIS1后检测LIS1...     

过表达miR-29a对人椎间盘退变髓核细胞凋亡的影响

目的 探讨miR-29a在人椎间盘退变髓核(NP)细胞凋亡的调控作用.方法 体外培养椎间盘退变NP细胞,构建重组真核表达质粒cherry/miR-29a,脂质体Lipofectamine转染进入NP细胞,应用反转录实时定量PCR(RT-qPCR)检测NP细胞中miR-29a的表达变化,Western blot法检测凋亡相关蛋白Caspase-3前体的表达变化,流式细胞仪检测NP细胞凋亡水平变化.结果 NP细胞转染重组质粒cherry/miR-29a 48 h后,NP细胞中miR-29a的表达水平较NP细胞和转染空质粒的NP细胞中的miR-29a明显升高(P＜0.05);凋亡相关蛋白Caspase 3前体的水平则明显下降(P＜0.05);NP细胞凋亡水平明显升高(P＜0.05).结论 在椎间盘NP细胞中过表达miR 29a能促进NP细胞凋亡,其机制可能是通过Caspase3途径起作用.     

miR-133过表达对结肠癌细胞SW480凋亡、增殖和裸鼠成瘤的影响

目的:探究miR-133过表达对结肠癌细胞SW480凋亡、增殖和裸鼠成瘤的影响。方法:将miR-133 mimic转染至SW480细胞,将细胞分为3组:对照组、Scramble组和miR-133 mimic组。RT-PCR检测miR-133表达水平;流式细胞仪检测细胞凋亡;Western 印迹检测Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-9、c-Myc蛋白表达水平;CCK-8法检测细胞增殖倍数;克隆形成实验检测细胞克隆形成率;裸鼠右侧腋窝处皮下注射SW480细胞悬液建立裸鼠移植瘤模型,检测肿瘤重量,RT-PCR检测肿瘤组织miR-133表达水平,免疫组化检测Caspase-3、Ki67阳性细胞数。结果:与对照组相比,miR-133 mimic组miR-133表达升高（F=136.70,P＜0.05）,细胞凋亡率升高（F=59.995,P＜0.05）,Bax/Bcl-2、cleaved Caspase-3/Caspase-3、cleaved Caspase-9/Caspase-9表达升高（F=726.85、138.76、55.85,均P＜0.05）,c-Myc蛋白表达水平降低（F=88.98,P＜0.05）,细胞活力降低（F=48.50,P＜0.05）,克隆形成率降低（F=42.63,P＜0.05）,肿瘤重量降低（t=1.788,P＜0.05）,肿瘤组织miR-133表达水平升高（t=1.043,P＜0.05）,Caspase-3阳性细胞数升高（t=1.167,P＜0.05）,Ki67阳性细胞数降低（t=1.557,P＜0.05）。结论:miR-133过表达诱导SW480细胞凋亡,抑制SW480细胞增殖和裸鼠肿瘤的形成。     

P53和PCNA在辐射诱导犬胆管增殖平滑肌细胞凋亡中的表达及意义

目的探讨在辐射诱导犬胆管增殖平滑肌细胞凋亡中,P53和PCNA的表达及意义。方法12只犬随机分两组,每组6只犬,在犬胆管内分别植入103pd(103钯)放射性支架和普通胆管支架,术后30d取出胆管标本采用ABC法进行PCNA免疫组化染色,核出现棕色反应为阳性细胞;原位杂交进行P53细胞染色,细胞浆出现棕褐色反应为阳性细胞;又行平滑肌细胞凋亡染色,阳性细胞为细胞核有棕黄色颗粒即为凋亡细胞。结果103Pd支架组PCNA蛋白阳性表达率明显低于普通支架组,两组之间比较差异有非常显著性(P<0.01),103Pd支架组P53蛋白阳性表达率明显高于普通支架组,两组之间比较差异有非常显著性(P<0.01)。103Pd支架组平滑肌细胞凋亡数较普通支架组明显增多,两者有显著差异(P<0.05),103pd放射性支架组犬胆管腔无明显狭窄,而普通支架组犬胆管腔有明显狭窄。结论以上结果证实103Pd支架组犬胆管平滑肌组织PCNA表达较弱,而普通支架组犬胆管平滑肌组织PCNA表达却增高,说明辐射可以抑制平滑肌细胞增殖,辐射可激活P53基因而诱导犬胆管平滑肌细胞凋亡,同时抑制犬胆管损伤后胆管狭窄。     

灵芝酸A对人骨肉瘤细胞增殖、凋亡和迁移的影响

目的探讨灵芝酸A对骨肉瘤细胞增殖、凋亡和迁移的影响。方法体外培养人骨肉瘤HOS和mg-63细胞与0.1、0.25 和
0.5 mmol/L的灵芝酸A孵育,采用CCK8检测HOS和MG-63细胞的增殖,流式细胞仪检测细胞凋亡,Transwell检测细胞的迁移
和侵袭。Western blot 检测细胞中p-STAT3、STAT3、p-p38、p38和NF-ΚB1蛋白的表达变化。结果灵芝酸A能够显著抑制人类
骨肉瘤HOS和MG-63细胞的增殖,促进细胞凋亡以及抑制细胞迁移,并且这种效应存在剂量依赖性。与0.5 mmol/L 灵芝酸A
孵育能够显著降低HOS和MG-63细胞中STAT3的磷酸化水平,增加p38磷酸化水平,同时增加NF-κB1的表达水平。结论灵
芝酸A能够杀死人类骨肉瘤HOS和MG-63细胞,可以作为抗骨肉瘤的药物进行开发。
     

Rab26诱导宫颈癌HeLa细胞凋亡并抑制其迁移

目的 研究调控Rab26蛋白表达对宫颈癌HeLa细胞凋亡及迁移的影响.方法 常规培养HeLa细胞,分别将含有Rab26 cDNA全长的真核表达载体(过表达组)、含有Rab26 siRNA序列的真核表达载体(siRNA组)瞬时转染HeLa细胞,同时设立正常细胞组及空载体转染组作为对照.转染48 h后,分别用RT-PCR和Westem blot检测各组细胞中Rab26的mRNA及蛋白表达水平;采用流式细胞仪(FCM)检测各组细胞的凋亡率;同时采用划痕实验检测各组细胞迁移速度.结果 与正常细胞组及空载体转染组相比,过表达组HeLa细胞中Rab26 mRNA及蛋白表达水平显著上调(P＜0.05),而siRNA组细胞中Rab26 mRNA及蛋白表达水平显著下调(P＜0.05),过表达组HeLa细胞凋亡率增高并抑制细胞迁移速度(P＜0.01),siRNA组则促进细胞迁移(P＜0.05).结论 Rab26与HeLa细胞的凋亡及细胞迁移有关,故调控Rab26的表达有望成为治疗宫颈癌的新靶点.     

MicroRNA-340在肝细胞肝癌中抑制细胞增殖并促进凋亡

目的 探讨微RNA-340(miR-340)在肝细胞肝癌中的表达特点及其对细胞生物学行为的影响.方法 收集重庆医科大学附属第一医院肝胆外科2015年3月至2016年9月收治的40例肝细胞肝癌患者手术后切除的癌组织和癌旁组织标本.通过qPCR检测组织标本中miR-340的表达,并分析miR-340表达与临床病理学指标的关系.分别培养肝癌细胞株Hep3B、Bel-7402、HepG2和SMMC-7721以及正常肝细胞株HL-7702,48 h后使用qPCR检测5种细胞中miR-340的表达水平.通过转染增加或抑制SMMC-7721细胞中miR-340的表达,然后分别于细胞培养24、48、72 h后采用CCK-8法检测SMMC-7721细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡.通过生物信息学软件预测miR-340的靶基因,并使用qPCR和蛋白质印迹法进一步验证miR-340对靶基因的作用.结果 癌组织中miR-340的表达低于癌旁组织(P＜0.01),并且miR-340的表达与乙肝表面抗原、HBV DNA载量、肿瘤大小以及临床TNM分期有关(P＜0.01).正常肝细胞HL-7702内miR-340的表达高于4种肝癌细胞Hep3B、Bel-7402、HepG2和SMMC-7721(P＜0.05,P＜0.01).增加miR-340表达可抑制SMMC-7721细胞的增殖(P＜0.05,P＜0.01),而抑制miR-340的表达则促进SMMC-7721细胞的增殖(P＜0.05,P＜0.01);增加miR-340的表达可促进SMMC-7721细胞的凋亡(P＜0.01),而抑制miR-340则减少凋亡(P＜0.01).生物信息学分析显示S期激酶相关蛋白2(SKP2)基因是miR-340下游的一个靶基因.qPCR和蛋白质印迹分析结果显示增加SMMC-7721细胞中miR-340的表达可抑制SKP2的mRNA和蛋白表达,抑制miR-340表达则增加SKP2的mRNA和蛋白表达.结论 miR-340的异常表达可能与乙肝病毒的感染有关,其异常表达有助于评价病情以及预后.在肝癌细胞系SMMC-7721细胞中,miR-340能够抑制细胞增殖并促进凋亡,这一作用结果可能是通过miR-340对SKP2的抑制而实现的.     

海水浸泡对表皮细胞凋亡和增殖的影响

目的：探讨海水浸泡对裸鼠表皮角质细胞凋亡和增殖的影响及其意义。方法：24只雄性裸鼠随机分为4组,应用光镜、原位末端标记和免疫组化技术,研究海水浸泡后裸鼠表皮角质细胞凋亡和增殖的变化规律。结果：海水浸泡后,裸鼠表皮基底层和颗粒层角质细胞发生凋亡,表现为细胞体积变小,细胞核固缩深染,细胞质浓缩,嗜酸性增强,还可见核碎裂、溶解;原位末端标记显示,对照组仅见基底层极少数阳性细胞,海水浸泡6和12 h,表皮各层见大量散在的阳性细胞,与对照组相比有显著差异（P〈0.01）;Ki-67和细胞周期蛋白D1免疫组化结果显示,对照组裸鼠仅基底层见少数细胞核呈弱阳性。海水浸泡3和6 h,Ki-67基底层阳性细胞轻度增加（P〉0.05）,海水浸泡12 h,基底层和颗粒层可见阳性细胞明显增加（P〈0.01）;细胞周期蛋白D1表达增加在海水浸泡6和12 h组均有显著差异（P〈0.05或P〈0.01）。上述改变均与浸泡时间呈正相关。结论：长时间海水浸泡可导致表皮角质细胞的凋亡和增殖,两者共同参与了海水浸泡对皮肤损伤的病理生理过程。     

胶质瘤细胞外泌体通过miR-125b对细胞增殖凋亡的影响

目的探索胶质瘤细胞来源的外泌体对细胞增殖凋亡的影响,并探讨其作用机制。方法高速离心法提取胶质瘤细胞U251外泌体,通过电镜及纳米粒径分析外泌体形态,Western blot检测外泌体特征性蛋白表达。在U251细胞培养基中分别加入浓度为100μg/ml的外泌体悬液30μl(外泌体组)或等量不含外泌体培养基(对照组),通过双荧光染色法验证外泌体能否进入U251细胞;CCK-8及流式细胞法检测细胞增殖凋亡的变化。通过RT-PCR法筛选U251外泌体与人星型胶质细胞外泌体中差异性表达的miRNAs。最后,将miR-NC、miR-125b mimics或miR-125b inhibitor转染U251细胞,重新提取外泌体后加入细胞培养基,采用CCK-8及流式细胞法检测U251细胞增殖凋亡变化。结果 U251细胞分离的外泌体为圆形或卵圆形囊泡状小体,直径范围约100 nm,富含CD63和CD9蛋白。在U251细胞培养基中加入外泌体悬液后,外泌体能够被U251细胞吞噬。CCK-8及流式细胞法显示:外泌体组细胞增殖活性高于对照组,凋亡比例低于对照组。RT-PCR显示:U251细胞外泌体miRNA-12...     

上调miR-125b对肝癌Huh-7细胞系增殖及顺铂诱导凋亡的作用研究

目的 研究miR-125b在肝癌发生发展中的作用机制,及其表达对于肝细胞癌化疗耐受性的影响.方法 采用qPCR检测肝癌患者癌组织、癌旁组织、Huh-7细胞系(对照组)及转染miR-125b mimic的Huh-7细胞系(转染组)中miR-125b表达情况.采用流式细胞仪及MTT法检测对照组及转染组细胞周期及增殖情况.Western blot检测Huh-7细胞系转染后Mcl-1蛋白表达.设3组:对照组为正常培养细胞,miRNAcontrol组转染miRNA control,miR-125b mimic组转染miR-125b mimic.Western blot检测Mcl-1特异性siRNA阻断Mcl-1蛋白表达后,细胞凋亡相关蛋白caspase3的表达情况.设3组:对照组细胞正常培养;顺铂组加入顺铂,终浓度50 μg/mL培养;转染+顺铂组转染Mcl-1-siRNA,48 h后加入顺铂,终浓度50 μg/mL.结果 肝癌组织miR-125b表达较癌旁组织明显减低,为癌旁组织的(46.24±8.53)％,P＜0.05.miR-125b mimic转染Huh-7细胞后,转染组细胞G1/S比例较对照组明显增高(P ＜0.05);Mcl-1蛋白表达较对照及miRNAcontrol组下调(P＜0.05);转染+顺铂组中的Caspase3蛋白表达较对照组及顺铂组明显增高(P＜0.05).结论 上调miR-125b的表达可以抑制肝癌细胞增殖,抑制靶蛋白Mcl-1表达,促进顺铂诱导凋亡,具有抑癌基因的作用.     

姜黄素对髓母细胞瘤PI3K/Akt信号通路的作用

目的探讨姜黄素对髓母细胞瘤PI3K/Akt信号通路的作用。方法细胞培养至对数生长期后设对照组(Ct组)和姜黄素处理组(Cur组)。Cur组用20、40、60、80、100μmol/L姜黄素处理24、48、72 h。采用MTT法检测姜黄素对髓母细胞瘤Daoy细胞的生长抑制作用。流式细胞术分析Daoy细胞凋亡率;免疫细胞化学染色检测PI3K、p-Akt和Akt在细胞中表达情况;Western blot和RT-PCR分别检测PI3K、p-Akt和Akt蛋白及mRNA的表达水平。结果不同浓度姜黄素作用不同时间后,细胞受到不同程度的抑制,呈时间-剂量依赖关系(P<0.05)。姜黄素作用48 h抑制作用显著,差异有统计学意义(F=131.829,P<0.05),且IC50为35μmol/L,细胞凋亡也最明显(29.7%)。PI3K、Akt和p-Akt蛋白在Ct组中的阳性表达率分别为80.7%、84.8%和87.5%;Cur组阳性表达率均明显下降,分别为25.3%、58.8%和26.7%。两组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。Western blot显示Ct组PI3K、Akt和p-Akt蛋白灰度比值分别为(1.141±0.032)、(1.047±0.174)、(1.173±0.013);Cur组PI3K和p-Akt蛋白灰度比值降低,分别为(0.875±0.029)、(0.958±0.150)。两组比较,差异有统计学意义(t=15.530,33.482,P<0.05)。RT-PCR显示Ct组PI3K mRNA灰度比值显著高于Cur组[(1.166±0.031)vs(0.833±0.033),t=12.468,P<0.05]。结论姜黄素可能通过抑制PI3k/Akt信号通路,阻碍髓母细胞瘤Daoy细胞的增殖、诱导凋亡。