乏氧诱导因子1α在电离辐射诱导人乳腺癌细胞自噬性死亡中的作用

目的 探讨乏氧诱导因子1α(HIF-1α)在辐射诱导人乳腺癌MCF-7细胞自噬性死亡中的作用。方法 将人乳腺癌MCF-7细胞分为对照组(常氧组,21%氧气)、照射组(8 Gy X射线)、乏氧组 (150 μmol/L CoCl₂)、乏氧加照射组 (150 μmol/L CoCl₂+8 Gy)。150 μmol/L CoCl₂处理细胞模拟乏氧条件。Western blot法检测HIF-1α及MAPLC3蛋白表达;MDC及Hoechst染色方法分别用于检测细胞自噬和凋亡变化情况;克隆形成方法检测细胞辐射敏感性。构建携带人靶向HIF-1α-siRNA的反转录病毒载体,建立MCF-7 HIF-1α Ri沉默细胞模型,将细胞分为对照组(常氧组)、照射组(8 Gy)、乏氧组(CoCl₂处理)、乏氧加照射组(CoCl₂+8 Gy),检测细胞辐射敏感性、自噬及凋亡情况。结果 与对照组和照射组相比,HIF-1蛋白在乏氧组和乏氧加照射组表达明显增加,分别为0、0、1.00和1.89。与对照组相比,MAPLC3蛋白在照射组、乏氧组、乏氧加照射组的表达均明显上调,LC3II/LC3I比值分别为1.15、1.73、2.38和3.60。细胞辐射敏感性顺次降低,常氧+三甲基腺嘌呤(3MA)组>常氧组>乏氧+3MA组>乏氧组。成功构建HIF-1α沉默模型(pSUPER-HIF-1α Ri)与空载体对照模型(pSUPER),并检测了2种细胞的辐射敏感性。与常氧组相比,乏氧组MCF-7-pSUPER细胞存活分数显著增加(t=3.080、6.946、6.658、6.380,P<0.05),辐射敏感性降低。而MCF-7-pSUPER-HIF-1α Ri细胞,常氧与乏氧条件下细胞存活分数无明显改变。不同处理组(照射组、乏氧组和乏氧加照射组)的MCF-7-pSUPER-HIF-1α Ri细胞与MCF-7-pSUPER细胞相比较,自噬百分率分别降低21.1%、25.5%和15.5%(t=-4.635、-4.738、-6.354,P<0.05),但凋亡百分率差异无统计学意义。结论 在人乳腺癌MCF-7细胞中HIF-1α可增加辐射诱导的自噬,同时降低辐射敏感性,对细胞凋亡无影响。     

beclin1在辐射诱导的乳腺癌细胞自噬发生中表达的变化

目的 研究不同剂量X射线诱导乳腺癌细胞株MCF-7自噬发生过程中beclin 1表达的变化和作用。 方法 采用实时荧光定量PCR方法检测自噬相关基因MAP1LC3B表达,RT-PCR方法检测beclin 1基因变化,X射线Western blot方法检测beclin 1蛋白表达。结果 MAP1LC3B mRNA量效研究表明,8、16和32 h量效研究均发现表达上调,8、16 h在12 Gy,32 h在8 Gy达到表达峰值,总体表现为表达升高(F =13.831、10.996、17.019, P＜0.05);时程研究表明,2 Gy时程研究发现MAP1LC3B于16 h升高达至峰值(F =16.284, P＜0.01),8 Gy时程研究中32 h升高达至峰值(F =9.030, P＜0.05),12 Gy时程研究中16 h升高达至峰值(F =20.315, P＜0.05)。beclin 1 mRNA量效关系表明,照射后4 h beclin 1在2、4和8 Gy阶段呈剂量依赖增加趋势;8 Gy时间效应关系中发现照射后beclin 1 mRNA的变化呈时间依赖性增加。16 h蛋白量效关系表明,照射后beclin 1表达增加;2 Gy时效关系表明照射后蛋白表达增加。 结论 X射线照射能够诱导乳腺癌细胞株MCF-7发生自噬,beclin 1基因上调表达的变化提示其发挥重要作用。     

电离辐射诱导乳腺癌细胞自噬相关基因DRAM表达的研究

目的 研究电离辐射对乳腺癌细胞株MCF-7自噬相关基因DRAM表达变化的影响.方法 采用GFP-LC3转染法检测自噬泡,实时荧光定量PCR方法检测DRAM基因表达,Western blot方法检测LC3和DRAM蛋白的表达,采用磷酸钙共转染法构建DRAM沉默细胞模型.结果 与假照组相比,8 GyX射线照射后细胞中GFP-LC3表达升高;时间-效应关系表明,在8 Gy照射后,自噬溶酶体蛋白LC3表达在2、4、8、16、24和32 h上升变化显著,各组均高于假照组(F=5.38、8.72、10.63、15.23、20.78和55.23,P＜0.05);DRAM蛋白表达在8 Gy照射后以时间依赖性增加,从2h开始上升,32 h达至最高值(F=116.34,P＜0.05).DRAM沉默细胞模型组中LC3和DRAM蛋白的表达明显低于假照组(F=20.36和40.35,P＜0.05);对DRAM沉默细胞模型组进行8 Gy照射后,DRAM蛋白表达与假照组相比虽有所增加,但仍低于8 Gy照射组;DRAM沉默细胞模型组LC3蛋白的表达也低于照射组,沉默前后差异均有统计学意义(F=50.34,P＜0.05).结论 X射线可能通过激活DRAM基因来促进乳腺癌细胞株MCF-7发生自噬.     

自噬研究新进展

自噬是广泛存在于真核细胞内的一种溶酶体依赖性降解途径,是细胞进行自我保护的一种重要机制,在维持细胞存活、更新、物质再利用和内环境稳定中起着重要作用.近年来,针对自噬的研究日益深入,本文对新提出来的受损自噬(frustrated au-tophagy)概念及意义、自噬与凋亡间分子联系的新发现,以及雷帕霉素靶蛋白(mamalian target of mpamycin,mTOR)自噬调节的新动态概述如下.     

自噬抑制剂磷酸氯喹增加鼻咽癌CNE-2细胞株的放射敏感性

目的 探讨自噬现象在照射致人鼻咽低分化鳞癌(CNE-2)细胞死亡过程中的作用。方法 采用Western blot技术检测CNE-2细胞经射线照射后自噬标志物LC3、P62的变化,透射电镜检测自噬小体;流式细胞术检测CNE-2细胞凋亡率;MTT法检测CNE-2细胞照射后不同时间的存活率;细胞克隆形成实验检测CNE-2细胞的存活能力及放射敏感性。结果 透射电镜检测示自噬抑制剂磷酸氯喹(CDP)抑制照射所致自噬体的形成,自噬诱导剂雷帕霉素(RAPA)增加照射致自噬体数量(F=105.15,P<0.05);CDP抑制射线引起的LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的转化,而RAPA促进LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的转化(F=231.68,P<0.05);CDP使P62表达上调,RAPA使P62表达下调(F=117.52,P<0.05);CDP+照射组和RAPA+照射组的CNE-2细胞凋亡率明显高于单纯照射组(F=143.72,P<0.05);CDP、RAPA降低了照射后CNE-2细胞的存活率(F=25.88,P<0.05);二次线性模型拟合剂量存活曲线示自噬抑制剂CDP、RAPA可增加CNE-2细胞株的放射敏感性(F=167.32,P<0.05)。结论 照射联合自噬抑制剂CDP显著增加了CNE-2细胞株对射线的敏感性,提示自噬抑制剂或可用于鼻咽癌的辅助治疗。     

细胞自噬在病原体感染过程中的作用研究进展

细胞自噬是一种通过降解蛋白质和细胞器维持细胞内平衡的细胞机制。细胞自噬具有很多重要的生理功能,包括清除病原体的感染。但是由于细胞自噬在进化过程中具有高度的保守性,某些病原体通过进化,具有逃避细胞自噬的能力,甚至利用细胞自噬为病原体复制和发育提供有利条件。本文综述了细胞自噬与病原体相互作用的研究进展。     

雷帕霉素激活M2巨噬细胞自噬影响大肠癌放射敏感性的研究

目的 探讨雷帕霉素(RAP)激活M2巨噬细胞(type-Ⅱ macrophage)自噬对大肠癌移植瘤放射敏感性的影响。方法 经佛波酯(PMA)单独及联合人重组白介素4(IL-4)诱导人单核白血病细胞THP-1分化为M0和M2型巨噬细胞。使用RAP激活M2自噬,设置巴弗洛霉素(bafilomycin A1)下调M2已被激活的自噬作为对照。将大肠癌LoVo细胞接种于BALB/c-nu/nu裸鼠,待形成直径10 mm瘤体后,利用随机数表法,将18只裸鼠分为M2自噬未激活组、激活组和激活后下调组,LoVo细胞单独成瘤为阴性对照组,每组6只。对荷瘤鼠行2次8 Gy X射线局部照射,分析各组间移植瘤放射敏感性的变化。结果 M2巨噬细胞标志物Arg-1、CCL-22的相对表达量显著高于M0巨噬细胞(t=78.77、60.02,P＜0.05)。M2自噬未激活组瘤体质量、体积和微血管密度(MVD)[(1.93±0.05)g、(2.14±0.06) cm³、36.37±1.04]较阴性对照组[(1.35±0.05) g、(1.77±0.02) cm³、25.69±1.34]显著提高(t=20.07、14.56、10.92,P＜0.05);激活M2自噬后,瘤体重量、体积和微血管密度均显著下降[(0.89±0.03) g、(1.24±0.01) cm³、13.60±1.52](t=44.37、40.32、21.43,P＜0.05)。利用巴弗洛霉素下调M2自噬后,瘤体质量、体积和微血管密度有所回升[(1.02±0.07) g、(1.37±0.02) cm³、21.06±1.41](t=4.67、13.79、6.23,P＜0.05)。与阴性对照组相比,自噬未激活的M2能够抑制Livin和Survivin在瘤体组织中的表达(t=2.64、7.90,P＜0.05);RAP激活M2自噬后,可进一步下调上述蛋白的表达(t=5.43、9.39,P＜0.05)。利用巴弗洛霉素下调M2自噬后,Livin、Survivin表达量均有所回升(t=2.80、3.17,P＜0.05)。结论 利用RAP激活M2自噬,可抑制M2促进肿瘤微血管形成的能力,从而抑制移植瘤生长;同时,通过下调大肠癌移植瘤中抗凋亡基因Livin与Survivin的表达,诱导大肠癌移植瘤放疗后凋亡的发生,提高大肠癌的放射敏感性。     

乙肝病毒X蛋白连接蛋白抑制辐射诱导的乳腺癌细胞自噬调节的研究

目的 探讨乙肝病毒X蛋白连接蛋白（HBXIP）对电离辐射诱导的乳腺癌细胞自噬的影响。方法 将实验细胞分为对照组、HBXIP转染组、si-HBXIP转染组、HBXIP和si-STAT3共转染组。各处理组给予4 Gy γ射线照射后,0、24、48和72 h采用流式细胞技术检测含嗜酸性自噬体的乳腺癌细胞数;Western blot方法检测LC3-I/II、HBXIP、STAT3蛋白和STAT3（Y705）磷酸化蛋白表达水平的改变。结果 与对照组相比,外源性过表达HBXIP明显减少含有辐射诱导的嗜酸性自噬体的乳腺癌MDA-MB-231细胞数（t_{24 h}=3.67,P<0.05;t_{48 h}=9.74,P<0.01;t_{72 h}=10.15,P<0.01）和自噬相关蛋白LC3-II蛋白的表达;相反,采用siRNA降低HBXIP表达则明显增加含有嗜酸性自噬体的细胞数（t_{24 h}=3.5,P<0.05;t_{48 h}=4.15,P<0.05;t_{72 h}=12.12,P<0.01）和LC3-II的表达。提高HBXIP表达导致剂量依赖性的辐射诱导的STAT3（Y705）磷酸化水平提高;反之,降低HBXIP表达可降低受照细胞中STAT3（Y705）磷酸化水平的表达。采用siRNA-STAT3降低STAT3表达水平,明显降低了HBXIP对辐射诱导的自噬（t_{24 h}=5.57,P<0.05;t_{48 h}=13.65,P<0.01;t_{72 h}=12.47,P<0.01）和LC3-I/II表达调节能力。结论 HBXIP可通过调节p-STAT3（Y705）磷酸化的表达从而调节辐射诱导的乳腺癌细胞自噬。     

细胞自噬与肿瘤发生发展

自噬是真核生物中一种高度保守的胞内降解途径.其主要通过溶酶体或液泡进行饥饿状态下的营养动员,清除受损蛋白质、细胞器和胞内病原体.自噬主要包括巨自噬、分子伴侣介导自噬(CMA)和微自噬.自噬已被证实与多种人类疾病相关,其在肿瘤发生发展中具有重要意义.近年研究中,对于自噬和肿瘤关系有了进一步的认识,该文就自噬分子机制、调控...     

DNA依赖性蛋白激酶催化亚基在电离辐射诱发HeLa细胞自噬中的作用

目的：了解DNA依赖性蛋白激酶催化亚基（ DNA-PKcs）在电离辐射诱发细胞自噬中的作用。方法通过慢病毒载体（ pSicoR ）构建DNA-PKcs短发夹RNA （ shRNA ）表达载体,并转染HeLa细胞敲低DNA-PKcs表达。CCK-8实验检测细胞增殖活性及细胞放射敏感性,免疫印迹检测自噬相关蛋白表达,免疫荧光实验检测自噬标志物GFP-LC3的表达。结果成功构建shRNA敲低DNA-PKcs表达的HeLa细胞模型,通过该细胞模型观察到抑制DNA-PKcs蛋白表达导致细胞增殖能力降低、放射敏感性增高。 P62和LC3蛋白表达变化,以及细胞内绿色荧光蛋白（ GFP）-LC3免疫荧光斑检测结果显示,DNA-PKcs基因敲低后,明显增加X射线诱发细胞自噬。抑制DNA-PKcs导致哺乳动物西罗莫司（雷帕霉素）靶蛋白（ mTOR）第2481位丝氨酸磷酸化水平降低。结论抑制DNA-PKcs增强受照射宫颈癌HeLa细胞的自噬及放射敏感性,mTOR信号通路可能参与DNA-PKcs对自噬的调节作用。     

沉默Rev1基因对人结肠癌细胞放射敏感性的影响

目的 探讨沉默Rev1基因对人高分化结肠癌细胞THC8307 X射线照射后增殖、凋亡的影响。方法 利用RNA干扰技术将Rev1基因的特异性片段转染THC8307细胞,用实时荧光定量PCR和Western blot检测转染后细胞中目的基因的表达;实验分空白对照组、阴性对照组、Rev1 siRNA组。分别给予0、6 Gy X射线照射,运用四甲基偶氮唑盐（MTT）法检测不同时段（0、24、48、72、96 h）细胞增殖情况,并绘制增殖曲线;流式细胞仪（FCM）检测不同剂量X射线处理后的细胞凋亡;Western blot检测各组PCNA、γ-H2AX、P53、Bax、Bcl-2蛋白的表达。结果 与空白对照组相比,6 Gy X射线照射后,沉默Rev1基因组细胞增殖速率明显降低（t=7.53,P<0.05）,凋亡明显增加（t=6.23,P<0.05）,增殖细胞抗原（PCNA）表达下降（t=4.39,P<0.05）,γ-H2AX表达升高（t=5.48,P<0.05）,P53表达升高（t=5.09,P<0.05）、Bax表达升高（t=3.32,P<0.05）、Bcl-2表达降低（t=6.13,P<0.05）。结论 沉默Rev1基因,抑制了X射线作用下的结肠癌细胞THC8307的增殖,促进了凋亡,增加了其对X射线的放射敏感性。     

氯喹对食管癌细胞系放射增敏的实验研究

目的 探讨氯喹对食管癌TE-1细胞系的放射增敏作用及其主要机制.方法 采用MTT法检测不同浓度氯喹对TE-1细胞的生长抑制作用.分别用单纯照射或照射前联合氯喹、照射后联合氯喹作用于TE-1细胞,作用6 h后用Western blot测定自噬相关蛋白LC3和Beclin1的表达,用Lyso-Tracker Red DND-99/Hochest 33258进行荧光染色,并用荧光显微镜观察细胞内酸性囊泡(AVOs)的变化.克隆形成实验分析细胞增殖的改变,拟合剂量-生存曲线并计算放射增敏参数.结果 氯喹对TE-1细胞的生长抑制作用呈浓度依赖性.辐射显著诱导TE-1细胞LC3和Beclin1的表达,并促进LC3-Ⅰ转换为LC3-Ⅱ.与单纯照射及照射前加药相比,照射后加药显著降低TE-1细胞内AVOs的荧光强度(F=16.44, P<0.05)和克隆形成率,照射前加药和照射后加药的SER_D0分别为1.037和1.439(t=8.30, P<0.05).结论 氯喹能增加食管鳞癌TE-1细胞的放射敏感性,其机制可能与抑制自噬作用相关.     

自噬活性的降低增加人鼻咽癌CNE-2细胞的放射敏感性

目的 研究自噬与人鼻咽癌CNE-2细胞放射敏感性之间的关系。方法 采用慢病毒介导的RNA干扰技术建立稳定沉默自噬相关基因ATG5的人鼻咽癌CNE-2细胞系,实验分为未转染的CNE-2细胞组(对照组)、转染NC-shRNA的CNE-2细胞组(NC组)及转染ATG5-shRNA的CNE-2细胞组(ATG5组),应用CCK-8法、流式细胞术及克隆形成实验检测细胞增殖、凋亡及放射敏感性的变化。结果 CCK-8实验结果显示,与对照组和NC组相比,各剂量点ATG5组的细胞存活率均显著降低(F=3.755、46.086、8.609、44.160,P<0.05),绘制细胞生存曲线可见下调ATG5的表达后可以增加CNE-2细胞的放射敏感性;流式细胞术结果显示,经6 Gy X射线照射后,ATG5组细胞的凋亡率较NC组及对照组明显升高(F=394.876,P<0.05);克隆形成实验结果提示沉默ATG5基因可增加鼻咽癌CNE-2细胞的放射敏感性。结论 降低鼻咽癌CNE-2细胞的自噬活性可以增强其放射敏感性。     

Enhanced autophagy protects hepatic cells from radiation injury

Objective To study the influence of radiation on autophagy and its protective effect on radiation injury of hepatic cells. Methods Autophagy in mouse liver tissues was examined by GFP-LC3 staining and Western blot. Radiation-induced hepatic injury was evaluated by ALT and AST in mouse serum, protein expressions, and H & E and TUNEL staining of liver tissue. L02 cells were used for in vitro study. Chloroquine and rapamycin were used to manipulate the level of autophagy. Results Total body irradiation (TBI) of 8 Gy caused an increase of autophagy in mouse liver tissue and AST level in serum(t=-7.47, P<0.05) at 12 h after irradiation. Irradiation significantly increased the apoptotic level in liver tissue as well. Inhibition of autophagy by chloroquine caused a further increases of AST[IR:(345.42±35.25)U/L vs. IR+CQ:(433.42±40.07)U/L, t=-2.86, P<0.05] and ALT[IR:(35.67±8.08)U/L vs. IR+CQ:(98.5±26.67)U/L, t=-3.09, P<0.05] in the serum, and it also promoted apoptosis in live tissue. However, rapamycin as an autophagy promoter showed protective effect for radiation-induced hepatic injury[AST:IR:(345.42±35.25)U/L vs. IR+Rap:(278.42±20.09)U/L, t=-2.86, P<0.05]. Similar changes of autophagy and apoptosis in L02 cells were also observed in the cells treated with chloroquine and rapamycin. Inhibition of autophagy by CQ caused an increase of ROS in vitro and in vivo and further increased ALT and AST levels in serum, reduced L02 cell viability. Activation of autophagy by Rap effectively reversed those changes. Conclusions Autophagy protects hepatic cells from radiation injury by decreasing ROS induction, which provides a potential target for the development of new clinical regimens against radiation induced liver injury.     

Assessment of the homogeneous efficacy of carbon ions in the spread-out Bragg peak for human lung cancer cell lines

Purpose The aim of this study was to assess the radiosensitivities and homogeneous efficacy in the spread-out Bragg peak (SOBP) for lung cancer cell lines exposed to carbon ions. Materials and methods The dose-dependent survival rates of seven cell lines exposed to carbon ions, fast neutrons, and photons were obtained using colony-forming assays in vitro. The relative biological effectiveness (RBE) of carbon ions and fast neutrons to photons was determined by comparing the doses at the 10% and 1% survival levels. Results The RBEs at 13, 40, 50, and 80 keV/μm were 1.20–1.29, 1.55–1.80, 1.57–2.00, and 1.69–2.58, respectively, at the 10% survival level. The RBE of 290 MeV carbon ions increased with increasing linear energy transfer. The biological dose (relative physical dose × RBE) distributions in the SOBP did not statistically differ at the proximal, mid, or distal points at the 10% (p = 0.945) and 1% (p = 0.211) survival levels, respectively; however, deviation of the biological dose at 10% and 1% survival were 3%–16% and 6%–24%, respectively. Furthermore, 290 MeV carbon ions at 80 keV/μm in the SOBP were nearly equivalent to 30 MeV fast neutrons. Conclusion Our results demonstrate nearly homogeneous effectiveness in the SOBP, although we are aware of the deviation in some cell lines.     

自噬在X射线照射所致心肌线粒体损伤中的作用

目的观察X射线照射对大鼠心肌线粒体功能的影响以及自噬在线粒体功能损伤中的作用。方法将135只实验大鼠分成假照射组（10只）、照射组（80只）和照射＋3．甲基腺嘌呤（3-MA）组（45只）,假照射组接受0GyX射线照射,照射组给予20Gyx射线照射,照射＋3-MA组接受20Gvx射线照射前30min腹腔注射2μl 3-MA。采用蛋白免疫印迹法和实时定量PCR法检测心肌细胞的LC3II及Beclin1蛋白表达及其mRNA水平变化,检测左心室舒张压及＋-dP／dtmax（左心室压力上升及下降的最大速率）等离体心功能指标。结果与假照射组相比,照射组大鼠经20GyX射线照射后离体心功能在21d时出现降低;而在1d时心肌组织线粒体功能便出现了损伤;同时,心肌细胞自噬水平在3h、6h、12h、1d、2d、4d及7d时出现明显上升,与假照射组之间的差异显著,且在6h达到最高值。与照射组相比,照射＋3一MA组大鼠心肌LC3II及Beclin1表达水平明显下降,且心功能出现异常的时间提前至14d。结论x射线照射损伤大鼠心肌线粒体功能并诱导自噬发生,可能是心肌保护的重要因素。