小鼠骨髓间质干细胞的生物学特点及分化潜能鉴定

目的：建立一种体外分离，培养和鉴定小鼠骨髓间质干细胞的方法，探讨体外培养中间质干细胞的一些生物学特点，为利用MSCs促进创伤修复提供实验基础，方法：分离5－6周龄的小鼠胫骨，股骨，用预冷的IMDM培养基冲洗出骨髓，经密度梯度离心得到骨髓单个核细胞，接种后12－16d形成意志贴壁的成纤维状细胞，体外多向诱导分化鉴定分离的细胞，用传代的细胞进行生长曲线的测定，观察其接种贴壁率，检测细胞周期和超微结构。结果：体外传代培养的MSCs具有分化形成成骨和成脂细胞的能力；MSCs倍增时间约为38h，传代后12h贴壁达90％以上，细胞周期显示有80％细胞处于G0／G1期，并用电镜照片显示其超微结构。结论：在本实验条件下，体外培养的MSCs具有多向分化潜能,体外生长稳定，传代后的细胞适应性强，增殖较快，超微结构和细胞周期表现出较早期细胞特点，可望用于自体创伤促愈。     

体外培养的婴幼儿MSCs生物学特性研究

目的 探讨体外分离和培养的婴幼儿骨髓间充质干细胞（MSCs）的基本生物学特性。方眭无菌条件下抽取先心病婴幼儿骨髓,经密度梯度离心、接种获得MSCs,观察其形态、贴壁率、克隆形成能力、超微结构和生长曲线,流式细胞仪检测细胞表面标记物。结果体外培养的MSCs3～4h后开始贴壁,贴壁率为65％～80％;2～3d可见集落形成,10d左右融合90％以上,随着传代次数增加,克隆形成率逐渐降低。透射电镜观察显示体外培养的MSCs具有MSCs典型的超微结构,其表面标记物CD29、CD44、CD71、CD90表达阳性。结论体外分离培养的先心病婴幼儿MSCs生长稳定且增殖较快,可作为体外构建工程化先心病修复材料的种子细胞来源。     

大鼠骨髓间充质干细胞的分离与培养

目的 观察体外培养的大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）的生物学特性。方法 通过贴壁法培养、鉴定大鼠骨髓MSCs，观察其生长规律及光镜结构特点。结果 大鼠MSCs 7代以前增殖速度较快，细胞接种后1～2d为滞留期，3d后达对数生长期，第6天进入平台期。免疫组织化学染色显示MSCs表达CI）44，不表达CD45；光镜下可见MSCs呈梭形、纺锤形和多角形，核居中，有1～2个核仁。结论 培养的细胞为骨髓MSCs；在体外培养条件下细胞生长性状稳定，可作为组织工程的种子细胞。     

大鼠骨髓间质干细胞的分离培养及生物学特性研究

目的建立大鼠骨髓间质干细胞(MSCs)最佳的体外分离培养方法,并研究其基本的生物学特性。方法采用密度梯度离心和贴壁培养两种方法分离大鼠的MSCs,进行形态学观察及增殖生长方面的测定;免疫细胞化学染色鉴定表面标志。结果大鼠MSCs体外培养呈梭形;细胞生长曲线为“S”型;密度梯度离心法原代培养15d达到80%～90%的融合,而改良的直接贴壁法只需要5d;细胞周期显示G0/G1期88.29%;免疫细胞化学染色显示CD44表达阳性,CD34、CD45为阴性。结论两种方法均可获得骨髓间质干细胞,但贴壁培养法操作更简便、快速,具有对细胞活性影响较小,更利于其贴壁和增殖的优点。MSCs体外培养条件下生长性状稳定,适于做组织工程的种子细胞。     

大鼠骨髓间充质干细胞生物学特性及分化潜能研究

目的建立一种体外分离、培养和扩增大鼠骨髓间充质干细胞的方法.探讨体外培养骨髓间充质干细胞的一些生物学特性,为利用MSCs进行多种疾病的细胞治疗提供实验基础. 方法分离6～8周龄的大鼠胫骨、股骨,用DMEM/F12培养基冲出骨髓,采用Percoll淋巴细胞分离液获得骨髓中的单个核细胞,并结合MSCs的贴壁特性,获得大鼠MSCs,体外扩增.体外进行多向诱导分化鉴定分离的细胞,并测定传代细胞的生长曲线、观察其接种贴壁率、检测细胞周期和超微结构.结果体外培养的MSCs生长状况良好,并能迅速扩增,具有分化形成成骨和成脂肪细胞的能力;MSCs倍增时间约为28.8h;传代后10h贴壁达95.5% 以上;细胞周期显示有92%细胞处于G0/G1期;电镜显示的结果进一步证实MSCs具备了干细胞的结构特点.结论在本实验条件下,体外培养的MSCs具有多向分化潜能,体外生长稳定,传代后的细胞适应性强,增殖较快,超微结构和细胞周期表现出较早期细胞特点.使干细胞用于移植治疗、基因治疗成为可能.     

体外培养的婴幼儿MSCs生物学特性研究

目的探讨体外分离和培养的婴幼儿骨髓间充质干细胞(MSCs)的基本生物学特性. 方法无菌条件下抽取先心病婴幼儿骨髓,经密度梯度离心、接种获得MSCs,观察其形态、贴壁率、克隆形成能力、超微结构和生长曲线,流式细胞仪检测细胞表面标记物.结果体外培养的MSCs 3 ～ 4 h后开始贴壁,贴壁率为65% ～ 80%;2 ～ 3 d可见集落形成,10 d左右融合90%以上,随着传代次数增加, 克隆形成率逐渐降低.透射电镜观察显示体外培养的MSCs具有MSCs典型的超微结构,其表面标记物CD29、CD44、CD71、CD90表达阳性.结论体外分离培养的先心病婴幼儿MSCs生长稳定且增殖较快,可作为体外构建工程化先心病修复材料的种子细胞来源.     

大鼠骨髓间充质干细胞体外分离培养的实验研究

目的:探讨大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)体外分离、培养的适宜条件。方法:采用密度梯度离心法结合贴壁分离法分离培养大鼠骨髓MSCs,观察其形态,流式细胞仪检测细胞表面标记,MTT法观察不同浓度的胎牛血清(FBS)对MSCs生长曲线的影响及不同代MSCs的生长曲线和细胞贴壁率。结果:大鼠MSCs呈梭形或纺锤形,CD34、CD45表达阴性,CD44表达71.5%、CD166表达83.2%;MSCs用10%的FBS培养,其增殖明显高于用无血清、5%及20%的FBS培养;第1、3、5、10代MSCs的生长曲线及细胞贴壁率无明显差异(P>0.05)。结论:密度梯度离心法结合贴壁分离法适于大鼠MSCs的分离;10%的FBS适合MSCs的培养;早期传代对MSCs的增殖无影响。     

大鼠骨髓间质干细胞体外分离培养及生物学特性研究

目的：建立大鼠骨髓间质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)体外分离培养方法，并对大鼠MSCs的生物学特性进行研究。方法：分离5～8周龄的大鼠股骨骨髓进行体外培养，取5代以后的MSCs观察形态特征，绘制生长曲线，进行细胞化学染色，并用流式细胞仪检测其表面标志和进行细胞周期分析。结果：大鼠MSCs细胞形态呈长梭形或多边形，细胞生长曲线呈S形，群体倍增时间为30h，细胞化学染色显示碱性磷酸酶(ALP)、过氧化物酶(POX)、苏丹黑B(SB)阴性，而*醋酸萘酚醋酶(α-NAE)与糖原(PAS)阳性，流式细胞仪检测结果显示CD29、CD44、CD90表达阳性，而CD34、CD38、CD45表达阴性；细胞周期分析显示，G0／G1期：79．48％，G2／M期：6．10％，S期：14．42％。结论：本方法分离纯化出的是MSCs，其在体外具有生长稳定，增殖较快的特点，是组织工程研究中良好的细胞来源，也是转基因研究优良的载体细胞。     

人骨髓间充质干细胞的分离培养及部分生物学特性的实验研究

目的 建立一种体外分离和培养人骨髓间充质干细胞(MSCs)的方法，并探讨其部分生物学特性。方法 无菌条件下抽取正常健康人骨髓3-5ml，经密度梯度离心得到单个核细胞，接种入含10％胎牛血清的IMDM培养液，测定其生长曲线，并观察其贴壁率、细胞周期和超微结构变化。结果 培养的MSCs3-4h开始贴壁，贴壁率为60％-80％，2-3d即可见集落形成，14d左右融合90％以上，基本上为梭形成纤维细胞状形态，流式细胞检测显示有70．03％的细胞处于G0/G1期，电镜观察表现出早期细胞的特点。结论 成功地建立了一种分离培养人骨髓MSCs的方法，获得的细胞形态单一、生长稳定、增殖较快，为进一步应用MSCs促进创伤修复提供了实验基础。     

大鼠骨髓间充质干细胞的超微结构观察

目的 研究体外培养的大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）的生物学特性。方法 通过贴壁法培养、鉴定大鼠骨髓MSCs,观察其生长规律及光、电镜结构特点。结果 大鼠MSCs 7代以前增殖速度较快,细胞接种后1～2d为滞留期,3d后达对数生长期,第6天进入平台期。免疫组织化学染色显示MSCs表达CD44,不表达CD45;光镜下可见MSCs呈梭形、纺锤形和多角形,核居中,有1～2个核仁;透射电镜下可见MSCs胞质较丰富,有线粒体、粗面内质网和高尔基复合体等细胞器,核呈圆形或椭圆形,有明显核仁。结论 培养的骨髓MSCs有独特的超微结构特点;在体外培养条件下细胞生长性状稳定,可作为组织工程的种子细胞。     

兔骨髓间充质干细胞培养与多向分化潜能鉴定的实验研究

目的原代培养兔骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs),观察体外培养中MSCs的生物学特性及多向分化潜能。方法通过密度梯度离心联合贴壁培养法,体外分离、纯化、扩增兔骨髓间充质干细胞,观察形态学特点,测绘传代MSCs生长曲线,检测细胞周期及表面标记,体外诱导MSCs向成骨细胞、成脂肪细胞分化并鉴定。结果原代及传代MSCs为长梭形成纤维细胞样细胞;生长曲线显示传代细胞具有类似的生长规律;流式细胞仪分析MSCs CD44表达阳性,CD45表达阴性;细胞周期分析显示87%以上细胞处于G0/G1期;经成骨细胞诱导,细胞碱性磷酸酶染色阳性;经成脂肪细胞诱导,细胞内出现红染脂滴。结论通过密度梯度离心联合贴壁培养法可大量扩增、纯化MSCs,所获细胞具有高度自我更新和多向分化潜能。     

人脐血间充质干细胞的体外培养及生物学特性

目的:建立一种体外纯化增殖人脐血源性间充质干细胞(MSCs)的实验方法,并观察其生物学特性。方法:从正常分娩的足月胎儿脐血中分离出MSCs进行原代培养,培养瓶预先用自体血浆包被处理。72-96 h半量更换培养液,弃去未贴壁细胞,以后每3-5 d半量换液1次。待细胞达到80%-90%融合时,按1∶2的比例进行传代。倒置或相差显微镜下每日观察原代和传代细胞的生长情况及形态学特征。取第3代脐血MSCs用流式细胞仪检测细胞周期和细胞表面抗原CD29、CD34、CD44、CD45的表达。结果:脐血经分离、培养5-7 d后有间充质样细胞贴壁,3-4周后,细胞生长达80%-90%融合,形态学类似骨髓源性MSCs。连续传至5代以后,增殖能力未见明显减弱。脐血MSCs的大部分细胞(>90%)处于G0/G1期,且均一稳定地表达间充质干细胞表面抗原CD29、CD44,但不表达CD34、CD45。结论:脐带血内含有MSCs,并可在体外纯化增殖,该技术可为实验研究和临床应用提供足够的干细胞来源。     

大鼠骨髓间质干细胞的体外分离培养及初步鉴定

目的探讨并建立一种简便有效的体外分离纯化及扩增大鼠骨髓间质干细胞的方法,并研究其生物学特性,对其进行初步鉴定,为进一步诱导分化为胃黏膜上皮细胞奠定基础。方法利用贴壁培养法分离纯化SD大鼠骨髓间质干细胞,体外培养,传代扩增,在倒置显微镜下连续观察细胞的形态变化,并用免疫组化方法鉴定骨髓间质干细胞表面CD29,CD44,CD34的表达。将加入成骨、成脂肪诱导剂的骨髓间质干细胞体外培养2～3周,观察细胞形态变化,并做油红0染色,鉴定成骨及成脂肪分化的结果。结果原代培养8—10d后可分离得到骨髓间质干细胞,且骨髓间质干细胞体外培养生长状况良好,呈均一的成纤维细胞样,传代周期为3～4d。免疫组化显示90％以上的骨髓间质干细胞CD29、CD44阳性,CD34阴性,且可以将其定向诱导为脂肪细胞和成骨细胞。结论利用贴壁培养法可分离培养出大量大鼠骨髓间质干细胞,且此方法简便易行。     

犬骨髓间充质干细胞的分离、培养、纯化及鉴定

[目的]探讨分离、培养、纯化和鉴定犬骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）方法,观察MSCs体外生长特征。[方法]自犬髂后上棘抽取骨髓约10ml,1．073g／ml的Percoll分离液梯度离心,培养皿培养、换液除去非贴壁细胞,获得MSCs,通过及时、反复传代对MSCs进行纯化和扩增培养,测定生长曲线,并进行形态学观察。流式细胞仪检测扩增后MSCs细胞周期及表面抗原特性。[结果]MSCs在含10％小牛血清的IMEM中生长性状相对稳定,1、3、5代细胞生长曲线基本一致,增殖速度快。流式细胞仪检测表明MSCs强表达干细胞标记CD44,而不表达造血干细胞特异抗原CD34、CD11a、CD14和HLA-DR。第2代（P2）末MSCs周期显示有82．4％的细胞处于G0／G1期。[结论]密度梯度离心结合贴壁培养法能有效分离、纯化和培养犬骨髓MSCs。     

绿色荧光蛋白标记大鼠间充质干细胞的实验研究

目的研究重组腺病毒载体介导绿色荧光蛋白基因转染大鼠间充质干细胞（MSCs）的方法。方法 用密度梯度离心法分离纯化大鼠MSCs并进行鉴定，以携带绿色荧光蛋白基因的重组腺病毒载体Ad-GFP转染MSCs，流式细胞仪检测即时、15 d和30 d的标记率；通过流式细胞仪检测细胞周期、凋亡率，CCK-8法检测增殖能力，明确标记后细胞的生长特性；通过流式细胞仪检测标记后细胞表面标志（CD29、CD34、CD44和CD45）表达的变化。结果 Ad-GFP对大鼠MSCs的即时标记率高达89.71%，15 d和30 d的标记率分别为：85.10%、82.92%。标记后细胞周期的分布、凋亡率、增殖能力与未标记细胞相比，差异无显著性（P>0.05）。标记后细胞表面标志的表达亦不受影响。结论 重组腺病毒载体Ad-GFP能高效标记MSCs，且标记后细胞的增殖能力不受影响，表面标志的表达不发生改变。     

人脐带间质干细胞分离纯化及基本生物学特性研究

目的探讨人脐带间质干细胞（MSC）的分离、纯化、扩增方法,研究其基本生物学特性.方法无菌条件下收集剖宫产新生儿脐带,分别用组织块贴壁法和酶消化法获取脐带间质干细胞,进行原代培养.应用DMEM/F12培养液进行纯化和扩增培养.用流式细胞仪检测MSC的细胞表面标志.绘制细胞生长曲线并测定细胞周期.结果两种分离方法均可获得MSC,原代培养12～14 d后可达90%融合,细胞可传代20代以上.流式细胞仪检测结果显示,脐带MSC强表达CD13、CD29、CD44、CD105,弱表达CD106,不表达CD34、CD11a、CD14、CD31、CD45.结论脐带MSC在体外有较强的增殖能力,可作为组织工程的种子细胞.     

肝硬化患者骨髓间充质干细胞的体外培养及生长特性

目的 研究肝硬化患者骨髓间充质干细胞（MSCs）的体外扩增方法及其生长特性和特异性表面标记,为肝组织工程“种子细胞”的选择提供新的理论依据,为进一步研究自体骨髓间充质干细胞移植治疗肝衰竭时移植细胞在体内的调控机制打下基础。方法 无菌抽取4例肝硬化志愿者骨髓3～4mL,年龄30～40岁,利用密度梯度离心法联合贴壁筛选法逐步筛选MSCs,获取MSCs,倒置显微镜下逐日观察细胞生长特性,细胞计数,绘制细胞生长曲线,流式细胞仪检测细胞表面标志CD甜、CD45。结果 原代培养细胞生长潜伏期0～9d,对数增殖期为10～19d,生长平台期为20～24d;传代细胞生长周期较原代细胞快,细胞生长潜伏期为4～24h,对数增殖期为3～12d,13～15d进入生长平台期。肝硬化患者骨髓MSCs高表达CD44,低表达CD45。结论 肝硬化患者骨髓MSCs体外生长良好,性质稳定,可以作为“种子细胞”用于自体骨髓干细胞移植和生物人工肝系统。     

人脐带血间充质干细胞的体外培养及影响因素

目的:建立人脐带血的间充质干细胞(MSCs)体外培养、扩增的方法。方法:无菌条件下取正常足月的脐带血,分离单个核细胞,以含5%胎牛血清的低糖DMEM作为培养基进行培养和纯化获得贴壁细胞,测定MSCs的生长曲线,用流式细胞技术分析细胞的表面抗原。结果:脐血中的单个核细胞在适当的条件下分离、培养,获得的MSCs均一稳定地表达相关的抗原标记CD29、CD44、CD105,但不表达CD34、CD45、CD106和HLA-DR。结论:脐带血中含有的MSCs可在体外培养、扩增,能够作为间充质干细胞的一种有效来源。     

成人骨髓间充质干细胞的体外分离培养和生物学特性

目的：建立一种成人骨髓间充质干细胞体外分离、培养和扩增的方法，并探讨其部分生物学活性及向脂肪细胞诱导分化的方法，并以此鉴定所获细胞。方法：采用1．073g／ml的Percoll分离液分离成人骨髓间充质干细胞。接种于纤维连接蛋白包被，含有表皮生长因子和血小板原性生长因子BB的2％胎牛血清培养液中，并利用其贴壁性进行纯化；观察其形态学变化及超微结构，流式细胞仪检测其表面标记物；采用10％胎牛血清和尼克酰胺诱导其向脂肪细胞的分化。结果：原代和传代培养均保持较强的增殖能力，超微结构显示了干细胞的幼稚特性，流式细胞仪检测示CD34、CD45、CD19、组织相容性抗原-DR阴性，CD44、CD10、CD29、CD13阳性。体外能够分化成为脂肪细胞，油红O染色阳性。结论：采用该方法骨髓间充质干细胞生长稳定，扩增较快；一定条件下能够定向分化成为脂肪细胞；我们所获得的细胞具有间充质干细胞的特性。