肺炎链球菌触发人肺Ⅱ型上皮细胞F-actin细胞骨架重排与TPK信号转导的相关性研究

目的:通过体外实验,研究Streptococcus pneumoniae(S.pn)是否通过肺Ⅱ型上皮细胞(A549)酪氨酸蛋白激酶(TPK)信号转导途径触发微丝肌动蛋白(Filamentous actin,F-actin)细胞骨架重排,进而导致S.pn对A549细胞的侵袭.方法:采用F-actin特异性FITC-phalloidin荧光染料,观察S.pn作用A549细胞前后的F-actin细胞骨架重排情况,依照重排百分率得分标准以(%)表示;用F-actin细胞骨架重排抑制剂细胞松驰素D预处理A549细胞,观察S.pn对A549细胞的侵袭率;使用TPK信号转导抑制剂Genistein预处理A549细胞,观察其与F-actin细胞骨架重排百分率间是否存在剂量依赖关系.结果:S.pn作用A549细胞后,经FITC-phalloidin荧光染色,F-actin细胞骨架呈块状、丝状聚集;F-actin细胞骨架重排抑制剂细胞松驰素D可明显降低S.pn对A549细胞的侵袭率,在其浓度为0.25μg/ml时,未得到可测的细菌数;TPK信号转导途径抑制剂可部分抑制A549细胞F-actin细胞骨架重排,并与F-actin细胞骨架重排百分率间存在量效关系,其相关系数分别为rTpK=-0.91(P＜0.05).结论:上述结果提示S.pn可通过TPK细胞信号转导途径触发A549细胞F-actin细胞骨架重排,进而导致S.pn侵袭A549细胞.     

肺炎链球菌触发肺Ⅱ型上皮细胞F-actin细胞骨架重排

目的：通过体外实验,研究肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae,S.pn)是否可触发肺Ⅱ型上皮细胞（A549）信号转导途径触发微丝肌动蛋白（filamentous actin,F-actin)细胞骨架重排,进而侵袭A549细胞,并初步分析触发A549细胞F-actin细胞骨架重排的细菌亚组分。方法：采用F-actin特异性FITC-phalloidin荧光染料,观察S.pn作用A549细胞前后的F-actin细胞骨架重排情况,依照重排百分率得分标准以（%）表示;用F-actin细胞骨架重排抑制剂细胞松弛素D预处理A549细胞,观察S.pn对A549细胞侵袭的改变情况;用变溶菌素提取S.pn细胞壁以观察其对F-actin细胞骨架重排的影响。结果：S.pn作用A549细胞后,经FITC-phalloidin荧光染色,F-actin细胞骨架呈黄绿色块状聚集,对照细胞呈现均匀黄绿色荧光外观;F-actin细胞骨架重排抑制剂细胞松弛素D可明显降低S.pn对A549细胞的侵袭,在其浓度为0.25μg/ml时,未得到可测的细菌数;S.pn细胞壁作用A549细胞后,经FITC-phalloidn荧光染色,F-actin细胞骨架呈黄绿色块状聚集,二者存在剂量依赖性。结论：S.pn及其细胞壁亚组分可触发A549细胞F-actin细胞骨架重排,进而侵袭A549细胞。     

肺炎链球菌二元信号转导系统研究进展

肺炎链球菌是引起细菌性肺炎的主要病原菌。透彻地了解肺炎链球菌的信号转导对于系统地认识该菌的致病机制和靶标药物的设计具有重要意义。二元信号转导系统作为在病原菌中普遍存在的一种跨膜信号转导机制,在细菌响应外界环境变化并作出适应性反应的过程中起着主要作用。随着大规模基因组测序、信号标签诱变、差异荧光诱导以及DNA微阵列等技术的蓬勃发展,关于肺炎链球菌的二元信号转导系统已经取得了许多重要的研究成果。本文就肺炎链球菌二元信号转导系统的研究进展作一综述。     

肺炎链球菌磷壁酸胆碱成分介导细菌的侵袭

分析肺炎链球菌细胞壁胆碱成分在其侵袭宿主细胞的过程中的作用。通过肺炎链球菌对人脐静脉内皮细胞的侵袭实验 ,观察血小板活化因子受体 (PAF R)拮抗剂BN 5 2 0 2 1对肺炎链球菌侵袭率的变化 ,以及乙醇胺取代细胞壁胆碱后肺炎链球菌侵袭率的变化。研究发现受体拮抗剂BN 5 2 0 2 1处理活化血管内皮细胞后 ,肺炎链球菌的侵袭率显著降低 (P <0 0 1 ) ,乙醇胺取代肺炎链球菌细胞壁成份中的胆碱同样降低了细菌对活化内皮细胞的侵袭 (P<0 0 1 )。实验表明肺炎链球菌可能是通过脂磷壁酸和磷壁酸的胆碱成分与内皮细胞表面的血小板活化因子受体结合来介导侵袭作用的     

肺泡Ⅱ型上皮细胞转分化

哺乳动物肺泡上皮细胞主要由肺泡Ⅱ型上皮细胞（AECⅡ）和肺泡Ⅰ型上皮细胞（AECⅠ）组成。在肺发育和肺损伤修复过程中,AECⅡ可转分化为AECⅠ,体外原代培养的AECⅡ有这种转分化的特性。现对AECⅡ转分化的标志、影响及调控因素及其在肺损伤中的作用进行综述。     

表面活性蛋白A启动子指导Cre重组酶在转基因小鼠Ⅱ型肺上皮细胞中表达

Ⅱ型肺上支细胞合成和分泌肺表面活性物质（PS）,与肺损伤后的修复有关,很多肺相关疾病的发生伴随有Ⅱ型肺上皮细胞功能不全及PS系统缺陷。Ⅱ型肺上皮细胞在肺的发育、机体免疫及疾病的发生发展过程中的具体功能尚不明确．对调控Ⅱ型肺上皮细胞功能的遗传机制也知之甚少。为了利用Cre-loxP系统研究调节Ⅱ型肺上皮细胞功能的遗传机制,研制了表面活性蛋白A（SP—A）启动子指导Cre重组酶基因在转基因小鼠Ⅱ型肺上皮细胞中表达的转基因小鼠。将整合有Cre重组酶基因的首建者小鼠与Smad4条件基因打靶小鼠及ROSA26报告小鼠交配,利用基因组PCR和LacZ染色检测Cre重组酶表达的组织分布及其钵内介导loxP位点间重组的活性。多组织基因组PCR显示Cre重组酶在转基因小鼠肺、脑和消化道组织中表达。LacZ染色显示仅在Ⅱ型肺上皮细胞中检测到Cre重组酶的活性。以上结果表明本研究研制的pSP—A—Cre转基因小鼠可用于在Ⅱ型肺上皮细胞中进行条件基因打靶和细胞谱系分析。     

人胚肺成纤维细胞WI-38中AngⅡ信号转导途径的研究

本文采用免疫荧光染色、凝胶阻滞电泳(EMSA)和Western blot等方法,观察AngⅡ刺激人胚肺二倍体成纤维细胞WI-38细胞前后,细胞中信号转导子和转录激活子STAT3、STAT1的活化状态,进而了解AngⅡ的信号转导通路.结果显示AngⅡ通过其AT1受体诱导WI-38细胞中STAT3、STAT1的磷酸化,形成以磷酸化的STAT3同源二聚体SIF-A为主的复合物,并转位入核与DNA结合,参与调控基因的表达;AngⅡ的作用存在量效及时效效应,10-3mmol/L的AngⅡ刺激60min能最强诱导WI-38细胞STAT3、STAT1的活化.因此JAK/STAT途径参与介导了An-gⅡ在WI-38中的信号转导.     

Percoll密度梯度离心法分离大鼠肺Ⅱ型上皮细胞

目的建立大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞（AT-Ⅱ）的改良体外原代培养法。方法采用循环冲洗、支气管灌洗、胰蛋白酶消化、滤网过滤并用轻比重及重比重PercolL密度梯度离心,分离AT-Ⅱ。原代培养后通过碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,AKP）法和电镜鉴定AT-Ⅱ。结果经AKP染色和电镜鉴定所得的AT-Ⅱ纯度为（80．2±6．3）％,每只大鼠可分离出1×10^7AT-Ⅱ。结论采用Percoll密度梯度离心法能分离出较高纯度的AT-Ⅱ。     

与成纤维细胞共培养的肺泡Ⅱ型上皮细胞的生物学特性

建立胎鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞（AECⅡ）与肺成纤维细胞（LF）共培养模型,观察与LF共培养下AECⅡ的生物学特性。倒置相差显微镜观察AECⅡ形态和基本生长情况：RT-PCR和流式细胞术分别检测肺泡表面活性蛋白-C（SP-C）、水通道蛋白5（AQPS）mRNA及蛋白质表达;流式细胞术检测细胞周期及Ki67表达。结果显示,与LF共培养时,AECⅡ能较好地保留其细胞形态。SP-C mRNA及其蛋白质表达明显增加,而AQP5mRNA及其蛋白质表达则明显减少;LF促进AECⅡ增殖,使G2／M、S期细胞及表达Ki67^＋细胞的比率明显增多。结果提示,AECⅡ与LF共培养时,能更好地保留其细胞形态、分化及增殖特性。     

浙江地区青霉素耐药肺炎链球菌PBPs基因及氨基酸序列研究

为阐明温州地区青霉素耐药肺炎链球菌（PRSP）的青霉素结合蛋白（PBPs）的基因和氨基酸序列的变异特点,对温州医学院自2000年11月～2004年1月收集的26份肺炎链球菌进行分离、鉴定及青霉素药敏实验,并对每株链球菌的PBP1A、PBP2B、PBP2X基因进行PCR扩增和直接测序,通过序列比对与生物信息学分析。结果表明,研究中的PBP1A的主要突变位点是保守基序KTG之后的4个连续氨基酸替换Thr574Ala、Ser575Thr、Gln576Gly、Phe577Tyr和保守序列STMK内的氨基酸替换Thr371Ser;PBP2B的主要突变位点是保守序列SSN之后的氨基酸替换Thr451Ala;PBP2X的主要突变位点是保守基序STMK 内的氨基酸替换Thr338Ala。以上突变类型以及菌株的青霉素耐药水平与文献报道相符。研究检测的PRSP的PBPs基因中暂未发现本地区特有的（新的）基因突变,也未检测出文献报道的某些与青霉素抗性相关的氨基酸替换。     

肺炎链球菌假想蛋白SPD0414亚细胞定位及对细菌黏附侵袭的影响

目的 为研究肺炎链球菌假想蛋白SPD0414在肺炎链球菌（S.pn）的亚细胞定位,并初步研究其在S.pn黏附和定植中的作用.方法 通过分别在SPD0414的N端和C端融合绿色荧光蛋白（GFP）,共聚焦荧光显微镜观察定位情况.用203野生菌和203△spd0414缺陷菌对鼻咽癌细胞CNE和肺腺癌细胞A549细胞的黏附侵袭实验.体内实验中用203和203△spd0414滴鼻感染BALB/c,在6 h和12 h观察细菌在鼻腔和肺中的载量.结果 无论N端或C端融合的GFP都显示绿色荧光,且整个菌体都显示荧光.与203野生菌相比,203△spd0414缺陷菌对CNE和A549的黏附和侵袭能力均显著下降（P＜0.05）.滴鼻感染BALB/c小鼠,在6 h和12 h,203△spd0414在鼻腔和肺中的细菌载量也明显低于203野生菌（P＜0.05）.结论 肺炎链球菌假想蛋白SPD0414定位于细菌的胞质.该蛋白在细菌的定植和侵袭中发挥了重要的作用.     

临床肺炎链球菌常见序列型青霉素耐药性的流行病学研究

从菌种的水平研究和阐述临床分离的肺炎链球菌青霉素耐药机制存在一定的局限。为探讨以序列型(Sequence type,ST)为基础研究肺炎链球菌青霉素耐药机制的可行性,本研究分析了1997~2014年间北京常见STs肺炎链球菌488株和2015年重庆酉阳县、四川中江县常见STs菌株88株的青霉素最低抑菌浓度(Minimun inhibitory concentration,MIC)的分布及年份分布。结果显示北京分离株中除了ST342外,属于某一种ST的所有分离株的青霉素MIC值具有一定分布范围,或者<0.25 mg/L,或者≥0.25 mg/L。青霉素MIC <0.25 mg/L的分离株多分布于2001年以前,此年份后≥0.25 mg/L的分离株出现,并逐渐成为主要种群。但这个年份分布规律对于某一种ST并不明显,某一种ST在最初发现的几个年份中就具有不同青霉素MIC水平的分离株。重庆酉阳县和四川中江县常见STs型青霉素MIC分布于0.25~2.0 mg/L(≥0.25 mg/L),包括ST271、ST320和ST81。本研究从流行病学角度揭示了肺炎链球菌临床分离株常见STs的青霉素MIC值分布规律,支持以STs为基础研究其青霉素耐药机制。     

应用whaF基因序列鉴定20型肺炎链球菌血清型

目的应用wha F基因测序方法,对20型肺炎链球菌进行血清型鉴定。方法采用血清凝集法和用20型肺炎链球菌型特异性基因(wci L基因)合成的引物进行PCR扩增,对中国医学细菌保藏管理中心所保藏的20型肺炎链球菌进行血清学鉴定;根据Gen Bank上发表的wha F基因设计合成引物,PCR扩增wha F基因,利用测序获得基因序列,分析wha F基因多态性。结果 7株20型肺炎链球菌菌株均能与20型血清产生血清凝集反应,wci L基因PCR扩增产物,可见与预期相符大小500 bp的特异性条带。wha F基因PCR扩增产物,除20-3外,其余6株菌均可见1 000bp大小与预期相符的PCR扩增产物。wha F基因测序和分析显示:20-2、20-4、20-5、20-7与20B亚型(Gen Bank accession No.:CR931679和JQ653093)的wha F基因序列相同;20-6与20A亚型(Gen Bank accession No.:JQ653094)的wha F基因序列相同;20-1与CR931679和JQ653093相比,在898有点突变(A→C)。20-3的wha F基因比20A亚型和20B亚型的wha F基因均少了约600 bp。结论 20-6为20A亚型肺炎链球菌,20-2、20-4、20-5、20-7均为20B亚型肺炎链球菌。     

OCT4 介导卵泡刺激素对永生化人卵巢上皮细胞株增殖、 凋亡和侵袭能力的影响

目的:探讨OCT4基因对卵泡刺激素作用下的永生化人卵巢上皮细胞株(Moody细胞)增殖、凋亡和侵袭能力影响。方法:将不同浓度的FSH(0、25、50、100mIU/ml)作用于Moody细胞48小时,应用Western-blot技术检测OCT4表达情况。采用慢病毒介导将重组质粒OCT4稳定转染至人卵巢上皮细胞株中,应用Western-blot法鉴定OCT4蛋白表达情况。FSH以50 mIU/ml作为工作浓度,实验对象分为4组:①siCon组,转染空载体的阴性对照组;②OCT4组:稳定转染OCT4基因的Moody细胞组;③FSH+siCon组:以FSH处理的siCon组;④FSH+OCT4组:以FSH处理的OCT4组。采用MTT比色法检测各组细胞的增殖情况,流式细胞仪检测各组细胞凋亡情况,Transwell侵袭实验检测各组细胞侵袭能力的变化。结果:(1)随着FSH浓度的增加,Moody细胞中OCT4蛋白表达逐渐增高,在FSH浓度为50 mIU/ml时达最高;(2)OCT4基因成功转染至Moody细胞中,经Western-blot检测该基因在细胞中进行蛋白高表达;(3)FSH+OCT4组细胞增殖活性明显增高,同时凋亡率降低,与另外三组相比差异具有统计学意义(P<0.05);(4)在FSH作用下,转染OCT4后明显增强了细胞的侵袭能力,与另外三组相比差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:OCT4介导了FSH对人卵巢上皮细胞增殖、凋亡、侵袭活性的调控。     

维甲酸对高氧暴露下原代培养的胎鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞和成纤维细胞增殖与凋亡的影响

探讨高氧暴露对原代培养的胎鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞（AECⅡ）、成纤维细胞（LFs）增殖和凋亡的影响以及维甲酸（RA）的保护作用机制。通过建立高氧暴露原代培养的胎鼠AECⅡ和LFs模型,以RA作为干预方式,采用流式细胞术（膜联蛋白V—PI双标记）检测AECⅡ和LFs凋亡,Western印迹检测AECⅡ增殖细胞核抗原（PCNA）、p53及caspase-3表达和LFs PCNA表达。结果发现：（1）与空气对照比较,高氧暴露12h,膜联蛋白V（＋）PI（-）和膜联蛋白V（＋）PI（＋）标记AECⅡ数均显著升高（14．41±1．15 vs 2．80±0．19,P＜0．01;61．07±3．06 vs 1．49±0．11,P＜0．01）;RA对空气暴露下AECⅡ坏死、凋亡无明显影响,但明显下调高氧暴露下膜联蛋白V（＋）PI（-）和膜联蛋白V（＋）PI（＋）标记AECⅡ数（8．04±0．79 vs 14．41±1．15,P＜0．01;27．57±2．32 vs 61．07±3．06,P＜0．01）。（2）高氧、RA对LFs坏死、凋亡无明显影响。（3）高氧暴露12h,明显降低AECⅡPCNA表达（P＜0．01）,显著提高其p53（P＜0．01）和caspase-3活性片段（P＜0．01）表达;RA显著上调高氧暴露下AECⅡPCNA表达（P＜0．01）,下调其p53和caspase-3活化片段表达（P＜0．01）。（4）高氧、RA对LFs PCNA表达无明显影响。由此提示,高氧暴露,导致AECⅡ大量凋亡、坏死,增殖受到抑制,同时,LFs所受影响较小,两种细胞对高氧暴露的差异性行为可能是导致未成熟肺组织异常重构的重要原因;RA通过降低AECⅡ凋亡、坏死从而对高氧肺损伤具有保护作用。     

M41型A群链球菌的Ⅰ型胶原样蛋白与人低密度脂蛋白的相互作用

【目的】检测M41型A群链球菌(GAS)ATCC12373中Ⅰ型胶原样蛋白(Scl1)与人低密度脂蛋白(LDL)的相互作用。【方法】克隆了M41型GAS ATCC12373的Ⅰ型胶原样蛋白(Scl1)及其V区(Scl1-V)基因,并表达、纯化重组蛋白rScl1(C176)和rScl1-V(C176V)。通过重组蛋白与人血浆的亲和色谱层析、Western blot及酶联免疫吸附试验(ELISA)检测C176、C176V与LDL的相互作用;通过GAS与LDL的ELISA试验和人血浆与GAS的共孵育试验,检测GAS与LDL的相互作用。【结果】结果证明C176和C176V可以与LDL特异性结合;表达Scl1的M41型GAS可以与LDL相结合。【结论】M41型GAS的Scl1可以与LDL特异性结合。     

Tb(Ⅲ)与Ⅱ型胶原的相互作用

提取并分离纯化了Ⅱ型胶原,研究了Ｔｂ（Ⅲ）与Ⅱ型胶原的相互作用,结果表明Ⅱ型胶原对Ｔｂ（Ⅲ）有配位作用,并能极大地增强其荧光强度．用荧光滴定法和Ｓｃａｔｃｈａｒｄ作图法确定了Ⅱ型胶原与Ｔｂ（Ⅲ）的结合常数和结合部位数,结果表明Ⅱ型胶原与Ｔｂ（Ⅲ）有两类结合部位．其结合部位数和结合常数分别为０．７;３．１×１０５和１．３;１．０×１０５．     

MT2A对脂多糖介导的人肺毛细血管内皮细胞损伤的保护作用

目的:探索不同浓度的金属硫蛋2A(Metallothionein 2A, MT2A)对脂多糖(Lipopolysaccharid, LPS)介导的人肺微血管内皮细胞损伤的保护作用。方法:培养人肺毛细血管内皮细胞株(Human lung microvascular endothelial cells, HPMVECs),经过一定浓度LPS溶液进行刺激后,利用不同浓度的MT2A与对照组共同培养,一段时间后观察炎性介质IL-6、TNF-α释放的量及荧光显微镜观察组HPMVECs骨架形态变化。结果:各组TNF-α浓度均在0 h最低,随之逐渐升高,到6 h达到高峰;从各时间点来看,除0 h各组TNF-α浓度无显著差异外(F=0.717, P=0.549),其余各时间点B1、B2、B3均显著高于A组(均P0.05)。各组中IL-6浓度均在0 h最低,A组在2 h达到高峰,随后逐渐下降;B1组在4 h达到高峰,随之下降;B2、B3组从0 h开始逐渐升高,到6 h达到峰值;从各时间点来看,除0 h各处理因素无显著差异外(F=2.341, P=0.092),其余各时间点B1、B2、B3均低于A组(均P0.05)。A组6 h小时后纤维状肌动蛋白(F-actin)明显解聚,分布明显减少,应力纤维排列紊乱或者消失;B1组、B2组、B3组6 h小时后,与A组相比,F-actin的分布明显较多,应力纤维排列较为整齐。结论:LPS刺激人肺毛细血管内皮细胞有明显损伤效应,加入MT2A后细胞相关炎性因子释放量、细胞骨架损伤情况明显减轻,表明一定浓度的MT2A对LPS介导的肺毛细血管损伤有明显保护作用。     

白术内酯Ⅱ逆转M2型巨噬细胞极化调控PDL1表达抑制A549细胞迁移

探究白术内酯Ⅱ(atractylenolideⅡ,AT-Ⅱ)对M2型巨噬细胞极化与A549细胞迁移能力的影响,并分析其潜在机制。利用PMA将THP-1细胞诱导成M0巨噬细胞,然后加入IL-4和IL-13继续诱导为M2型巨噬细胞。利用Transwell小室将M2型巨噬细胞与A549细胞共培养,分别给予0、2.5、5μmol/L的AT-Ⅱ进行作用。采用MTT实验测定共培养条件下AT-Ⅱ对A549细胞活力的影响;采用Real-time PCR检测M2型巨噬细胞Arg-1的mRNA表达水平;采用ELISA检测共培养体系中TNF-α、IL-1β的含量;采用WB检测A549细胞TLR4、p-p65、NF-κB(p65)、PDL1的蛋白表达水平;采用划痕实验检测A549细胞的迁移能力。结果显示,共培养条件下,与对照组相比,实验组(2.5、5μmol/L)A549细胞活力降低(2.5μmol/L组P>0.05、5μmol/L组P<0.01);M2型巨噬细胞特异性基因Arg-1的mRNA表达水平显著降低(P<0.01);M1型巨噬细胞相关炎性因子TNF-α、IL-1β含量增多但无显著差...     

小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞类器官三维培养体系的建立

本研究旨在建立小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞(type 2 alveolar epithelial cells, AT2)类器官三维(three-dimensional, 3D)培养体系的方法。采用酶消化与磁珠分选分离和纯化ICR小鼠肺AT2细胞,proSPC免疫荧光染色鉴定AT2细胞纯度;2维(two-dimensional, 2D)培养8 d,5-乙炔基-2’脱氧尿嘧啶核苷(5-ethynyl-2’-deoxyuridine, EdU)掺入和荧光染色法观察AT2细胞的增殖与分化;将AT2细胞与小鼠肺成纤维细胞(mouse lung fibroblasts, Mlg) 3D共培养,光学显微镜下观察类器官生长情况,收集生长13d的类器官,2%多聚甲醛固定后行HE染色,荧光染色观察类器官内部形态结构。结果显示,提取AT2细胞纯度超过95%;在体外培养1～8 d期间,AT2细胞EdU荧光染色阴性,未见增殖;AT2细胞形状逐渐趋向扁平鳞状、细胞表面积显著增大;在体外培养3 d后,有部分AT2细胞特异性标志物proSPC阳性细胞开始出现I型肺泡上皮细胞(type 1 alveolar epithelia...