淫羊藿苷基于雌激素受体对糖皮质激素诱导的MC3T3-E1成骨抑制的影响

目的 研究淫羊藿苷(icariin,ICR)对雌性激素受体(estrogen receptor,ER)与地塞米松(dexamethasone,DEX)诱导的MC3T3-E1成骨抑制效应的影响。方法 分别以DEX 10^-5 mol·L^-1、ICR 10^-6 mol·L^-1、雌激素(E2)10^-8 mol·L^-1及ICI182780(IN)10^-5 mol·L^-1干预MC3T3-E1成熟分化过程,并通过real-time RT-PCR、Westen blot、MTT和茜素红染色法分别测定对应组各指标变化情况。结果 ICR和E2一样能够明显提高成骨细胞ALP、OPG、OC和Runx2的表达,并能够显著降低RANKL和Dickkopf的表达,对应的OPG和RANKL蛋白的表达量与mRNA的表达量相一致。ALP活性、细胞增殖能力以及Ga²⁺结节数量与对照组相比也有明显提高。同时ICR和E2都能够有效回复DEX诱导的成骨抑制效应,这种调节效应能够被IN有效的阻断。结论 ICR具有促成骨细胞增殖分化和抑制破骨细胞激活效应,并能够有效的缓解DEX诱导的成骨抑制效应;其促成骨效应具ER依赖性。     

蛇床子素对体外培养骨髓基质干细胞增殖与成骨性分化的影响

目的研究蛇床子素对体外培养大鼠骨髓基质干细胞(bone marrow stromal stem cells,BMSCs)增殖与成骨性分化的影响。方法取大鼠股骨及胫骨全骨髓,利用全骨髓培养法培养单核层细胞,培养于含10%FBS的DMEM-F12培养液中,3d后首次换液,9d后传代培养。培养基中蛇床子素终浓度分别为1×10-4、1×10-5、1×10-6、1×10-7mol·L-1。增殖分析采用MTT法,于成骨性诱导培养d4、8、12、16测碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性、钙盐沉积量、骨钙素分泌量,d15进行钙化结节组织化学染色及计数。成骨性诱导后不同时间点提取Total RNA,RTReal-Time PCR法检测bFGF、IGF-1、Osterix与Runx-2的基因表达情况。结果蛇床子素剂量依赖性抑制BMSCs增殖,但能明显促进其向成骨性分化,表现为提高BMSCs的ALP活性、促进骨钙素分泌、钙盐沉积量、增加钙化结节数量、提高bFGF、IGF-1、Osterix和Runx-2的mRNA表达水平。结论终浓度为1×10-5mol·L-1蛇床子素能明显促进BMSCs的成骨性分化,证明蛇床子素是中药蛇床子抗骨质疏松的有效成分。     

8-异戊烯基柑橘素促进体外骨髓基质干细胞成骨性分化的研究

目的研究8-异戊烯基柑橘素对体外培养大鼠骨髓基质干细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)的增殖与成骨性分化的影响。方法取大鼠股骨及胫骨全骨髓,利用全骨髓培养法培养于含体积分数为10%FBS的DMEM-F12培养液中。以碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)为指标,96孔板梯度筛选作用最佳浓度。增殖分析采用MTT法。以1×10-6 mol.L-1的最佳浓度作用并成骨性诱导(1×10-7mmol.L-1地塞米松、10 mmol.L-1β-甘油磷酸钠和50 mg.L-1抗坏血酸)培养的d 4、8、12、16测ALP活性、钙盐沉积量,d 16进行ALP和钙化结节组织化学染色及计数。成骨性诱导后不同时间点提取Total RNA,RT Real-Time PCR法检测bFGF、IGF-1、Osterix、Runx-2、BMP-2及COL-Ⅰ的基因表达情况。结果 8-异戊烯基柑橘素不能促进BMSCs增殖,但8-异戊烯基柑橘素在1×10-6 mol.L-1时能促进其向成骨性分化,表现为提高BMSCs的ALP活性、促进钙盐沉积、增加钙化结节数量、提高bFGF、IGF-1、Osterix、Runx-2、BMP-2及COL-Ⅰ的mRNA表达水平。结论 8-异戊烯基柑橘素可诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化,作为促进骨修复和抗骨质疏松的有效成分具有较大的药用价值。     

芫花素对于MC3T3-E1细胞向成骨细胞分化的影响

目的探索芫花素对于MC3T3-E1细胞向成骨细胞分化的影响。方法采用芫花素1、5、10、15μmol/L处理MC3T3-E1细胞14 d,采用MTS法检测芫花素对MC3T3-E1细胞增殖的抑制作用;实时定量PCR和Western blotting法检测测芫花素对MC3T3-E1细胞中ALP、HDAC1和Runx2 m RNA和蛋白表达的影响。结果芫花素5、10、15μmol/L可以显著促进MC3T3-E1细胞中ALP、Runx2 m RNA和蛋白表达水平的提高(P0.05),HDAC1 m RNA和蛋白表达水平的下调(P0.05),表明芫花素可以促进MC3T3-E1向成骨细胞分化。结论芫花素具有促进MC3T3-E1细胞可以促进成骨细胞分化,对成骨细胞的分化过程有一定的调节作用。     

蛇床子素通过抑制小鼠心肌成纤维细胞TGF-β1/Smad信号通路降低胶原表达的研究

目的 研究蛇床子素降低真核载体pcDNA3.1(+)-TGF-β1转染的小鼠心肌成纤维细胞(cardiac fibroblasts，CFs)胶原的表达是否与抑制TGF-β1/Smad信号通路相关。方法 用真核表达载体pcDNA3.1(+)-TGF-β1转染小鼠CFs，然后在TGF-β1受体抑制剂SB431542预处理或不预处理的情况下，用不同浓度的蛇床子素处理CFs 24 h。ELISA检测上清TGF-β1水平，Western blotting检测细胞内α-SMA、collagen Ⅰ、collagen Ⅲ、Smad2/3、p-Smad2/3、Smad4和Smad7的蛋白表达。结果 真核表达载体pcDNA3.1(+)-TGF-β1转染CFs后，TGF-β1释放量增加，提示建立了TGF-β1过表达的细胞模型。TGF-β1过表达的CFs经蛇床子素(5~20 μmol·L^-1)处理24 h后，TGF-β1、α-SMA、collagenⅠ、collagenⅢ、p-Smad2/3和Smad4蛋白表达降低，Smad7蛋白表达上升。TGF-β1受体抑制剂SB431542预处理2 h后，蛇床子素对α-SMA、collagen Ⅰ、collagen Ⅲ、Smad2/3、p-Smad2/3和Smad4蛋白表达的抑制作用进一步增强。结论 蛇床子素可以通过直接抑制TGF-β1的产生和Smad通路下调α-SMA和胶原蛋白的表达，这可能是其抗纤维化的机制之一。     

蛇床子素对体外培养破骨细胞骨吸收及细胞凋亡的影响

研究蛇床子素对破骨细胞骨吸收的影响及其分子机制。采用体外分离、培养兔破骨细胞, 与盖玻片及骨磨片共同培养, 使用1×10⁻⁵ mol·L⁻¹蛇床子素刺激破骨细胞, 观察活体细胞并依据HE、TRAP、骨陷窝甲苯胺蓝染色鉴定破骨细胞; 进行骨吸收陷窝和面积定量分析, 吖啶橙染色统计凋亡细胞; real time PCR及Western blotting法检测相关基因和蛋白。与空白对照组比较, 1×10⁻⁵ mol·L⁻¹蛇床子素能够明显提高破骨细胞凋亡率并通过抑制RANKL和TRAP等相关基因及JNK1/2磷酸化水平抑制其骨吸收。结果提示, 蛇床子素可以通过RANK+RANKL/ TRAF6/Mkk/JNK途径刺激破骨细胞凋亡并抑制骨吸收。     

人甲状旁腺素(1-34)对新生大鼠成骨细胞碱性磷酸酶活性影响

目的：研究外源性hPTH(1-34)对原代培养成骨细胞ALP活性影响。方法：新生大鼠头盖骨中取成骨细胞,改良Gomori氏钙钴法染色鉴定,磷酸苯二钠法测定ALP活性,RT-PCR检测ALP mRNA表达。结果：10^-8 mol.L^-1 hPTH(1-34)以48 h为一循环,在每一循环的前12 h作用于细胞时,可使成骨细胞ALP活性较对照组增加最明显,hPTH(1-34) 48 h作用组,与对照相比细胞ALP活性无显著差异。hPTH(1-34) 12 h作用组,成骨细胞ALP mRNA表达最高。结论：hPTH(1-34)刺激成骨细胞内ALP活性升高与给药方式及药物浓度有关,间歇性给药成骨细胞内ALP活性升高。     

西替利嗪对皮肤细胞炎症中单核趋化蛋白-1表达的干预作用

目的考察西替利嗪(CET)对皮肤细胞炎症模型中单核趋化蛋白-1(MCP-1)表达的干预作用。方法组胺(HIS)和IFN-γ刺激真皮成纤维细胞(DF)和人角质形成细胞株HaCaT细胞，采用RT-PCR和ELISA法考察两种细胞MCP-1 mRNA和蛋白表达水平。结果与对照组比较，HIS(10 μmol·L^-1)和IFN-γ(20 ng·mL^-1)组显著上调两种细胞(DF和HaCaT) MCP-1 mRNA表达，同时分别使DF的MCP-1蛋白分泌量增加3.5倍和8.4倍，对HaCaT细胞也有相似的影响趋势； CET (1和10 μmol·L^-1) 显著地抑制了它们对细胞MCP-1蛋白产生的增强作用。结论CET可能通过抑制MCP-1的表达而发挥抗皮肤炎症作用。     

四环素-哌嗪雌酚酮上调骨中c-Myc蛋白表达水平

目的研究四环素-哌嗪雌酚酮(XW630)对长骨原癌基因c-myc蛋白表达的影响,探讨其对骨的作用机制。方法取16 d孕龄的雌性胚胎小鼠,剥取前肢尺骨,在特制的培养装置上于BGbJ培养基中培养48 h,培养基中XW630终浓度分别为1×10^-7,1×10^-8和1×10^-9 mol·L^-1。用免疫组织化学方法测定长骨骺板c-Myc蛋白的表达。图象分析系统下测定静止区、增殖区、肥大区c-Myc蛋白免疫反应阳性细胞面积。结果当培养基中XW630浓度为1×10^-9 mol·L^-1时,增殖区阳性细胞面积与同浓度雌酚酮组相比增加,静止区阳性细胞面积与对照组相比也增加,此浓度的雌酚酮组静止区阳性细胞面积与对照组无差异。XW630浓度为1×10^-8和1×10^-7 mol·L^-1时,各区阳性细胞面积均比对照组及同浓度雌酚酮组增加。结论XW630对骨的雌激素活性强于雌酚酮。XW630可能通过促进骺板软骨细胞表达c-Myc蛋白而促进了软骨细胞的增殖和分化,从而促进了软骨内成骨。     

黄连素对高糖环境下成骨细胞MC3T3-E1的影响

目的:研究黄连素在高糖环境下对成骨细胞MC3T3-E1的影响作用。方法:建立体外细胞高糖培养环境,用黄连素进行干预,通过碱性磷酸酶试剂盒分别检测细胞内和细胞分泌的ALP水平;通过实时荧光定量PCR技术检测成骨细胞相关矿化基因RUNX2、ALP、OCN、COL-1的mRNA表达量。结果:高糖显著抑制了细胞的ALP活性和分泌;黄连素干预促进了成骨细胞ALP的活性和分泌,并可以显著提高成骨细胞相关矿化基因RUNX2、 ALP、 OCN、COL-1的mRNA表达量。结论:黄连素对高糖环境下的成骨细胞的ALP分泌和成骨相关基因的表达有显著促进作用,可逆转高糖导致的细胞成骨能力的降低。     

蛇床子素通过激活过氧化物酶体增殖物激活受体α调节肝细胞内脂肪酸代谢

目的探讨蛇床子素是否通过激活过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)α调节肝细胞内的脂肪酸代谢。方法 大鼠肝细胞在用蛇床子素12.5～100μmol.L-1作用24 h后,用比色法测定细胞内甘油三酯(TG)和游离脂肪酸(FFA)含量,用逆转录聚合酶链反应法测定PPARαmRNA表达的变化。PPARα抑制剂MK886 1μmo.lL-1预处理肝细胞2 h后,观察蛇床子素100μmo.lL-1作用24 h后对细胞内TG和FFA含量以及PPARα调控的靶基因包括固醇调节元件结合蛋白(SREBP)-1/2、脂肪酸合酶(FAS)、二脂酰甘油酰基转移酶(DGAT)、肉碱软脂酰转移酶(CPT)-1a、脂肪酸转运蛋白(FATP)4和肝脂肪酸结合蛋白(L-FABP)mRNA表达的影响。结果 蛇床子素12.5～100μmol.L-1可明显降低肝细胞内TG和FFA的含量(P<0.01),同时也能明显增加肝细胞内PPARαmRNA的表达(P<0.01)。在用PPARα抑制剂MK886预处理后,蛇床子素降低肝细胞内TG和FFA的作用则明显被减弱(P<0.01),同时抑制SREBP-1/2,FAS和DGAT mRNA表达的作用明显减弱或完全消失(P<0.01),增加CPT-1a,FATP4和L-FABPmRNA表达的作用也明显减弱或完全消失(P<0.01)。结论 蛇床子素通过激活肝细胞中PPARα后可降低细胞中的TG和FFA含量,其机制与激活PPARα后随后抑制SREBP-1/2,FAS和DGAT的基因表达以及增加CPT-1a,FATP4和L-FABP的基因表达有关。     

地塞米松和吲哚美辛对基质金属蛋白酶-9的抑制作用及其机制研究

目的研究地塞米松和吲哚美辛对U937细胞中基质金属蛋白酶-9(MMP-9)活性的影响及抗炎作用机理。方法明胶酶谱法测定MMP-9的活性;Western blot法测定细胞培养上清液中MMP-9蛋白;RT-PCR法测定MMP-9 mRNA的表达。结果地塞米松和吲哚美辛可显著抑制PMA诱导的U937细胞培养上清液中MMP-9的活性,且抑制强度随浓度的增大而增加;地塞米松和吲哚美辛可显著抑制PMA诱导的的U937细胞MMP-9蛋白分泌及mRNA表达,且变化趋势与活性变化一致。结论对MMP-9活性的抑制作用可能是地塞米松和吲哚美辛抗炎作用的机理之一。     

芒柄花素对体外培养成骨细胞缺氧损伤的保护作用

目的研究芒柄花素在缺氧培养条件下对成骨细胞增殖、细胞周期、凋亡和成骨分化等的影响。方法采用酶消化法分离培养SD大鼠颅骨成骨细胞,并用三气培养箱建立缺氧模型。将细胞分为常氧对照组、缺氧对照组和缺氧加药组,其中缺氧加药组进一步分为10-6、10-5和10-4 mol·L-1组,分别加入10-6、10-5和10-4 mol·L-1芒柄花素。于缺氧处理36 h后分析各组的细胞存活率、LDH漏出率、细胞凋亡、细胞周期等,并用RT-PCR法检测缺氧诱导因子-1α、Bcl-2及Caspase-3的基因表达情况。缺氧处理48 h后检测ALP活性、钙化结节面积等成骨分化指标。结果与缺氧对照组比较,芒柄花素可提高细胞存活率,降低LDH漏出率,减少细胞凋亡并提高G1期细胞百分比,提高HIF-1α和Bcl-2mRNA的表达水平,抑制Caspase-3 mRNA的表达水平,对ALP活性和钙化结节面积等也有提高作用,且均呈现出剂量依赖性特点。结论芒柄花素对成骨细胞缺氧损伤具有明显保护作用。     

知母皂苷元通过上调PI3K/Akt信号通路减轻淀粉样β蛋白诱导的乳大鼠海马神经元突触损伤

目的 探讨知母皂苷元(Sar)减轻淀粉样β蛋白(Aβ)诱导的海马神经元突触损伤的信号转导机制。方法 取出生0~24 h SD乳大鼠海马神经元,体外培养7 d。海马神经元分别加入磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)特异性阻断剂LY294002 30 μmol·L^-1或蛋白激酶B(Akt)特异性阻断剂曲西立滨1 μmol·L^-1 1 h后,加Sar 30和100 μmol·L^-1作用1 h,再加Aβ_1-42 50 nmol·L^-1作用24 h。应用突触囊泡蛋白(SYP)免疫荧光染色观察突触的改变。Western蛋白质印迹法检测海马神经元SYP、磷酸化Akt(p-Akt)和磷酸化糖原合成酶3β(p-GSK3β)表达水平的改变。结果 与正常对照组相比,Aβ_1-42组培养的海马神经元SYP, p-Akt和p-GSK3β表达水平明显减低(P<0.01)。与Aβ_1-42组相比,Aβ_1-42+Sar 30和100 μmol·L^-1组海马神经元SYP, p-Akt和p-GSK3β表达水平明显增加(P<0.01)。给予LY294002作用后,SYP和p-Akt表达水平明显降低(P<0.05)。给予曲西立滨作用后,SYP和p-GSK3β表达水平明显降低(P<0.05)。单独给予LY294002,海马神经元SYP表达无变化,p-Akt表达水平明显降低(P<0.01)。单独给予曲西立滨,海马神经元SYP和p-GSK3β蛋白表达水平明显降低(P<0.01)。结论 Sar通过上调PI3K/Akt/GSK3β信号通路对抗Aβ_1-42诱导的海马神经元突触损伤。     

ATP敏感性钾通道在U50488H抑制去氧肾上腺素诱导的乳大鼠心肌细胞肥大中的作用

目的研究ATP敏感性钾通道(KATP)在κ-阿片受体激动剂U50488H抑制乳大鼠心肌细胞肥大中的作用。方法以原代培养的新生大鼠心肌细胞为模型,应用去氧肾上腺素(PE)10μmol.L-1诱导心肌细胞肥大。细胞处理分为正常对照组、PE10μmol.L-1模型组、5-羟基癸酸(5-HD)100μmol.L-1组,格列本脲(Gli)50μmol.L-1组、PE10μmol.L-1+U50488H1μmol.L-1组、PE10μmol.L-1+Gli50μmo.lL-1+U50488H1μmo.lL-1组和PE10μmo.lL-1+5-HD100μmo.lL-1+U50488H1μmol.L-1组,细胞培养液中先加入Gli50μmol.L-1或者5-HD100μmol.L-1,30min后再加入U50448H1μmol.L-1,30min后最后加入PE10μmol.L-1,48h后进行指标检测,Lowry等法检测心肌细胞蛋白质含量;消化分离法及计算机图像分析系统检测心肌细胞体积;Western印迹法测定KATP通道Kir6.2亚基的表达。结果与正常对照组相比,PE10μmol.L-1模型组使心肌细胞总蛋白质含量比正常细胞增加了52.2%,细胞体积增加了95.0%,而Kir6.2的表达没有明显变化。与PE10μmol.L-1模型组相比,细胞加入U50488H1μmol.L-1后,心肌细胞总蛋白质含量和细胞体积分别降低了42.3%和47.9%,但是Kir6.2表达增加了39.2%。与PE10μmo.lL-1+U50488H1μmol.L-1组相比,在非选择性KATP通道阻滞剂Gli50μmol.L-1或线粒体KATP通道阻滞剂5-HD100μmol.L-1存在的情况下,Kir6.2表达分别减少了49.3%和52.1%,U50488H抑制PE诱导的心肌细胞肥大作用减弱,并且两组之间没有显著差异。结论 U50488H可能是通过开放KATP通道,主要是线粒体KATP通道来抑制PE诱导的乳大鼠心肌细胞肥大。     

大黄素对体外培养新生大鼠颅骨成骨细胞的影响

目的　观察大黄素(emodin)对体外培养新生大鼠颅骨成骨细胞增殖、分化作用特点及量效关系,并观察大黄素对骨保护蛋白(Osteoprotegerin,OPG)mRNA表达的影响。方法　在新生大鼠颅骨成骨细胞体系中加入不同浓度的大黄素,加药后 1、2、3d用MTT法检测细胞增殖, 3、5、7、9d用PNPP法检测细胞内碱性磷酸酶含量,加药后 7d检测细胞内OPGmRNA表达的量, 24d检测细胞上清中钙和细胞内羟脯氨酸含量。结果　大黄素能促进大鼠颅骨成骨细胞ALP活性,实验中最佳作用浓度为 1×10-6 mol·L-1,最佳作用时间是 7d。大黄素能增加细胞内羟脯氨酸含量,促进OPGmRNA的表达。结论　大黄素可促进成骨细胞分化,增加OPGmRNA的表达。     

槲皮素通过调节TGF-β1/Smad抑制增生性瘢痕的形成

目的：探讨槲皮素对人增生性瘢痕成纤维细胞（HSFb）及其介导的TGF-β₁/Smad信号通路中相关蛋白表达的影响。方法：提取人增生性瘢痕成纤维细胞进行原代培养并鉴定;采用CCK-8法检测不同浓度的槲皮素（50~600 μmol·L^-1）处理后的HSFb细胞活力;Western blot检测α-SMA、COL-Ⅲ、TGF-β₁、Smad2、Smad7的蛋白表达,免疫荧光检测α-SMA的表达以及HSF和HSFb中波形蛋白的表达。结果：与模型组相比,槲皮素（250,500 μmol·L^-1）可降低α-SMA蛋白的表达（P<0.05）并显著下调COL-Ⅲ蛋白的表达（P<0.05或P<0.01）,其中500 μmol·L^-1槲皮素组对HSFb细胞Ⅲ-型胶原分泌的抑制作用最强,并显著降低TGF-β₁和Smad2的蛋白表达;显著上调Smad7蛋白表达并且呈浓度依赖性,差异均具有统计学意义（P<0.05或P<0.01）。结论：槲皮素主要通过抑制COL-Ⅲ、α-SMA、TGF-β₁/Smad通路的活化从而抑制增生性瘢痕的形成。