nNOS基因在慢性吗啡作用的SK-N-SH细胞的表达及调控

cAMP和转录因子CREB磷酸化水平升高是慢性吗啡依赖及耐受形成的基础.对于CREB与其调控的下游基因在其中的表达变化研究较少.首次研究了在慢性吗啡诱导的SK-N-SH细胞CREB的DNA结合活性及nNOS基因表达变化.该细胞株以1.5∶1的比例表达μ及δ受体,故实验结果更可靠.     

慢性吗啡处理对大鼠交感神经节pCREB和CREB mRNA表达的影响

目的观察慢性吗啡(Mor)处理对大鼠交感神经节-颈上神经节(SCG)环腺苷酸反应元件结合蛋白(cAMP responseelement binding protein,CREB)磷酸化和mRNA表达的影响。方法 Wistar大鼠随机分成4组(正常对照组、吗啡急性给药组、吗啡依赖组、吗啡戒断组),免疫组织化学方法及RT-PCR法分别检测磷酸化的CREB(phosphorylated CREB,pCREB)和CREB mRNA在SCG中的表达。结果 (1)与正常对照组相比,吗啡急性给药组大鼠SCG中pCREB含量明显降低(P<0.05);(2)吗啡依赖组大鼠SCG中pCREB含量回到正常对照组水平,并有增高趋势(与正常对照组比较,P>0.05;与吗啡急性给药组比较,P<0.01);(3)吗啡戒断组大鼠SCG中pCREB含量明显高于正常对照组(P<0.01);(4)各组大鼠SCG的CREBmRNA表达无差异(P>0.05)。结论慢性吗啡处理大鼠交感神经节CREB磷酸化水平存在适应性上调现象。     

凝血酶通过AP-1信号途径刺激人肾小球系膜细胞表达MMP-9 mRNA(英文)

目的:利用体外培养人肾小球系膜细胞观察凝血酶对系膜细胞表达MMP-9 mRNA的诱导作用及其可能的细胞内信号传导机制。方法:体外分离并培养人肾小球系膜细胞,以不同浓度凝血酶(500,1500和4500u/L)刺激后采用Northern杂交及凝胶阻滞试验(EMSA)分别观察MMP-9 mRNA表达水平及转录因子AP-1活性变化;同时观察了凝血酶特异性抑活物(水蛭素)、AP-1药理阻断剂(curcumin)和c-fos反义寡核苷酸对凝血酶上述作用的影响。结果:Northern分析表明凝血酶可以剂量依赖性地提高人系膜细胞表达MMP-9 mRNA,与对照组相比,分别提高1.1,3.3和4.8倍;EMSA实验结果发现凝血酶在促进MMP-9 mRNA表达的同时,系膜细胞AP-1的结合能力也相应地提高,与对照组相比分别增加2.5,4.9和6.1倍,与MMP-9 mRNA呈平行性变化;凝血酶抑活物水蛭素可明显地抑制凝血酶上调MMP-9mRNA及AP-1的DNA结合活性;同时AP-1药理阻断剂curcumin和c-fos反义寡核苷酸在有效抑制AP-1结合活性的同时,也明显地抑制MMP-9 mRNA表达水平。结论:凝血酶在体外培养的人肾小球系膜细胞具有上调MMP-9 mRNA表达的作用,转录因子AP-1介导了凝血酶的这一作用。     

M_5受体参与激活吗啡奖赏大鼠腹侧背盖区nNOS表达

目的　研究不同毒蕈碱受体亚型 (M4,M5)对吗啡诱发大鼠奖赏效应的影响 ,同时观察腹侧背盖区 (ventraltegmentalarea ,VTA)神经型一氧化氮合酶 (nNOS)表达的变化。方法　实验通过侧脑室置管给药 ,采用反义寡核苷酸技术 ,免疫组织化学技术和条件位置偏爱 (conditionedplacepreference,CPP)程序 ,研究M4,M5反义寡脱氧核苷酸干预下吗啡的奖赏行为 ,以及VTA内nNOS表达情况。结果　吗啡 (5mg·kg-1)皮下注射 ,可以建立起稳定的大鼠对伴吗啡环境的位置偏爱 ,同时VTA内nNOS阳性神经元表达也显著增加。而M5反义寡脱氧核苷酸 (M5 AS) (2nmol)侧脑室预注射则可阻断吗啡诱发CPP的形成 ,同时也显著减少VTA内nNOS表达。在吗啡诱发的CPP形成后 ,侧脑室单次注射M5 AS(2nmol)也可以逆转大鼠对伴吗啡环境的位置偏爱 ,同时也明显减少VTA内nNOS表达。相比之下 ,M4反义寡脱氧核苷酸 (M4 AS)对吗啡诱发的CPP形成以及VTA内nNOS表达的影响均不明显。实验前后所有大鼠的运动活性并未发生显著改变 ,可排除运动活性对实验的影响。结论　M5毒蕈碱受体在大鼠吗啡诱发的条件位置偏爱形成过程中起重要作用 ;M5毒蕈碱受体可能是通过激活大鼠VTA内nNOS的表达 ,参与调控吗啡奖赏效应的。     

神经元型一氧化氮合酶反义寡脱氧核苷酸抑制大鼠吗啡戒断症状

目的　观察鞘内或侧脑室注射神经元型一氧化氮合酶 (nNOS)反义寡脱氧核苷酸对大鼠吗啡戒断症状的影响。方法　根据基因结构设计nNOS或eNOS反义寡脱氧核苷酸片段 ,用逆转录聚合酶链反应 (RT PCR)测定nNOSmR NA表达。结果　吗啡依赖大鼠在纳洛酮激发前 2 4h鞘内注射nNOS反义寡脱氧核苷酸抑制所有大鼠吗啡戒断症状如湿狗摇动、扭体及激惹、腹泻、体重减少、咬牙和流涎。eNOS反义寡脱氧核苷酸对吗啡戒断症状总评分值没有影响 ,但减少腹泻、体重减轻值和咬牙等评分值。侧脑室注射nNOS反义寡脱氧核苷酸减少吗啡戒断症状 ,eNOS反义寡脱氧核苷酸对吗啡戒断症状没有影响。鞘内注射nNOS反义寡脱氧核苷酸后脊髓nNOSmRNA的相对表达几乎消失 ,iNOS的表达增加 ;而eNOS反义寡脱氧核苷酸处理后对nNOS和iNOS的表达没有影响。结论　nNOS基因表达介导了吗啡戒断反应过程 ,抑制nNOS基因表达可增加脊髓i NOS基因的表达。     

MG132诱导人血管平滑肌细胞凋亡及对caspase3表达的影响

目的观察蛋白酶体抑制剂MG132对人脐静脉血管平滑肌细胞(VSMC)的致凋亡作用及其对凋亡相关的天冬氨酸特异的半胱氨酸蛋白酶3(caspase3)表达的影响。方法采用多个浓度(2.5,5,10μmol/L)的蛋白酶体抑制剂MG132处理人脐静脉VSMC48h;DNA琼脂糖凝胶电泳检测细胞凋亡;流式细胞术分析细胞周期和细胞凋亡率;反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测caspase3基因转录水平;免疫细胞化学检测细胞caspase3蛋白表达。结果蛋白酶体抑制剂MG132处理48h后细胞凋亡率增加;RT-PCR检测发现细胞内凋亡相关基因caspase3mRNA表达上调;免疫细胞化学检测细胞caspase3蛋白表达水平升高。结论蛋白酶体抑制剂MG132能够诱导人脐静脉VSMC凋亡,其作用呈量-效关系;MG132诱导VSMC凋亡的机制可能与MG132抑制泛素-蛋白酶体途径(UPP)活性,促进caspase3基因转录,使细胞内caspase3增加而促进细胞凋亡。     

褪黑素抗大鼠吗啡奖赏效应的表达与脑内CREB及其磷酸化

目的:观察褪黑素(melatonin,Mel)对大鼠吗啡诱导的条件性位置偏爱(CPP)效应表达的影响及此过程中脑内cAMP反应元件结合蛋白(CREB)及其磷酸化的变化。方法:(1)大鼠连续6 d给予吗啡(sc,5 mg.kg-1/d)建立CPP模型,于CPP测试前20 min ip Mel(50和25 mg.kg-1),观察Mel对大鼠吗啡诱导的CPP效应表达的影响。(2)大鼠同上建立吗啡CPP模型,d7上、下午,d8上午ip Mel 50 mg.kg-1,共3次,最后一次ip后6 h,采用免疫组化结合计算机图像处理技术测定脑内伏隔核、海马内CREB及磷酸化CREB(p-CREB)的免疫阳性反应强度。结果:Mel 50 mg.kg-1可显著翻转大鼠吗啡诱导的CPP评分升高(P<0.01),同时显著降低吗啡诱导的大鼠伏隔核、海马内p-CREB的上调(P<0.01)。结论:Mel抑制大鼠吗啡奖赏效应的表达,此作用可能与其抑制吗啡诱导的伏隔核、海马内p-CREB蛋白水平上调有关。     

基于CREB通路研究3,6’-二芥子酰基蔗糖的神经保护分子机制

目的 3,6’-二芥子酰基蔗糖(DISS)是远志中的寡糖酯类成分,通过研究DISS对人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y的增殖作用和对环磷酸腺苷反应元件结合蛋白(CREB)通路的影响,探究其发挥神经保护作用的分子机制。方法采用四甲基噻唑蓝(MTT)法测定SH-SY5Y细胞生长曲线,筛选最佳种板密度和给药时间,并检测不同浓度DISS对细胞增殖的影响;采用Western blotting法检测细胞给予DISS后不同时间点CREB、磷酸化CREB(p-CREB)和脑源性神经生长因子(BDNF)的表达水平;给予调节CREB活性的相关上游通路拮抗剂U0126(MEK拮抗剂)、H89(PKA拮抗剂)、KN93(CaMK拮抗剂)拮抗CREB上游通路,并给予DISS保护,用Western blotting法检测DISS对拮抗前后细胞内CREB,p-CREB,BDNF蛋白表达的影响。结果 SH-SY5Y最佳中板密度为2×108L-1,DISS(60μmol·L-1,30μmol·L-1)对SH-SY5Y细胞具有明显的促增殖作用(P<0.05);与正常细胞相比,DISS给药15 min时可显著增加细胞内p-CREB,BDNF的表达(P<0.05);DISS可明显增加拮抗后SH-SY5Y细胞内CREB,p-CREB,BDNF的表达水平(P<0.05)。结论 DISS可以调节CREB活性并促进下游BDNF等相关因子的表达,其神经保护作用的机制可能与活化Ca2+/CaM/CaMK-CREB-BDNF信号通路有关。     

丙戊酸通过CREB上调脑红蛋白并保护N2a细胞免受双氧水诱导的神经损伤

目的研究丙戊酸对脑红蛋白表达的影响和机制,及其对双氧水诱导的神经损伤的保护作用。方法 Western blot、RT-PCR和荧光素酶活性实验检测丙戊酸对小鼠和人脑红蛋白表达的影响;荧光素酶活性实验分析CREB在丙戊酸诱导脑红蛋白启动子活性过程中的作用;MTT实验分析丙戊酸对双氧水诱导的神经损伤的保护能力。结果发现丙戊酸上调小鼠和人脑红蛋白的蛋白和mRNA水平,并能上调脑红蛋白基因的启动子活性;CREB特异性抑制剂KG-501和CREB显性负突变体KCREB均抑制丙戊酸诱导脑红蛋白基因的启动子活性;丙戊酸可保护N2a神经瘤母细胞免受双氧水诱导的损伤。结论 CREB介导了丙戊酸诱导的脑红蛋白表达上调;脑红蛋白可能在丙戊酸保护N2a细胞免受氧化应激诱导的神经损伤过程中扮演重要作用。     

Sp1反义寡核苷酸抑制Jurkat T细胞hTERT表达而抑制端粒酶活性(英文)

目的:研究转录因子Sp1反义寡核苷酸(ODN)对Jurkat T细胞端粒酶活性和端粒酶催化亚基hTERT表达的影响。方法:设计Sp1反义ODN并用脂质体转染细胞,用端粒酶PCR-ELISA方法检测端粒酶活性;用逆转录PCR方法检测Sp1和hTERT mRNA水平,用Western blot检测蛋白水平。结果:sp1反义ODN(1μmol/L)明显抑制Jurkat T细胞Sp1 mRNA和蛋白表达,抑制率分别为44.8％(P<0.05)和57％(P<0.01),并抑制hTERT mRNA表达,抑制率为43.7％(P<0.01);当浓度从0.25到2.0μmol/L,Sp1反义ODN对端粒酶活性抑制率从27.1％到64.6％,呈明显的剂量依赖性关系。结论:Sp1反义寡核苷酸通过抑制hTERT mRNA表达而抑制端粒酶活性。     

CRE—decoy ODN对大鼠吗啡戒断症状的抑制作用

目的研究以转录因子CREB为靶点的CRE-decoy ODN对大鼠吗啡戒断症状的影响。方法合成全硫代磷酸化ODN。实验分为5组：0．9％氯化钠溶液对照组,侧脑室0．9％氯化钠溶液注射对照组,吗啡依赖组,吗啡戒断组,吗啡戒断CRE-decoy ODN治疗组。制备吗啡身体依赖模型：采用递增剂量皮下注射吗啡建立大鼠吗啡身体依赖模型。0．9％氯化钠溶液对照组和侧脑室0．9％氯化钠溶液注射对照组大鼠注射等体积0．9％氯化钠溶液。对吗啡戒断治疗组大鼠在末次吗啡注射前30h,每只大鼠于左侧侧脑室内注射CRE．decoy ODN 20μg,侧脑室0．9％氯化钠溶液注射对照组、吗啡依赖组和吗啡戒断组每只大鼠则于左侧侧脑室内注射等体积0．9％氯化钠溶液。吗啡戒断大鼠的行为学评定：腹腔注射纳络酮后,由不知情的观测者随即观测大鼠的戒断行为,每15分钟为一时间段,连续观测1h内上述行为的发生频率,最后计算戒断0—60min的总评分。进行体重丢失的戒断评分：体重丢失百分率（△W）：纳络酮注射前与注射1h后的体重差／纳络酮注射前体重×100％。结果CRE—decoy ODN明显抑制吗啡戒断大鼠0～60min戒断症状的总评分,使其从（24．0±0．7）分降至（15．0±0．9）分（P〈0．01）。CRE-decoy ODN明显抑制吗啡戒断大鼠0～60min的体重丢失,反映戒断症状综合性指标的体重丢失百分率△W从（7．2±1．2）％降至（4．1±0．8）％（P〈0．01）。结论CRE—decoy ODN明显减轻吗啡戒断大鼠的戒断症状。     

丝裂素活化蛋白激酶反义寡核苷酸对血管紧张素Ⅱ诱导的大鼠心肌？…

AIM: To investigate the inhibitory effect of down-regulating mitogen activated protein kinase (MAPK) on c-myc gene expression and further on cardiac fibroblast proliferation. METHODS: Cultured neonatal rat cardiac fibroblasts was pretreated with a phosphorothioate-protected 17-mer antisense MAPK oligodeoxynucleotide (ODN) directed against the initiation of translation sites of the p42 and p44 MAPK isoforms by liposomal transfection. A 17-mer sense and mismatch sequence MAPK ODN were used as controls. After liposomal transfecting, cells were exposed to angiotensin II (Ang II) 10 nmol.L-1 for 5 min and then harvested in lysis buffer. MAPK activity was measured by Western blot and P-81 phosphocellulose filter paper method by using [gamma-32P]ATP and myelin basic protein as substrates. c-myc mRNA expression stimulated by Ang II for 30 min was measured by Northern blot. DNA synthesis and collagen protein synthesis induced by Ang II for 24 h were measured by [3H]thymidine incorporation and [3H]Proline incorporation, respectively. RESULTS: Antisense ODN 0.2 mumol.L-1 reduced Ang II-induced MAPK activities by 72%, MAPK protein expression by 80%, and suppressed c-myc mRNA expression by 97%, respectively. [3H]thymidine incorporation and [3H]proline incorporation in Ang II-induced cardiac fibroblast were inhibited by 59% and 58%, respectively. CONCLUSION: A 17-mer MAPK antisense oligonucleotide directed againsts the initiation of translation sites of MAPK could specifically inhibit Ang II-stimulated cultured neonatal rat cardiac fibroblast proliferation through down-regulating MAPK activity and further depleting c-myc mRNA expression.     

反义磷脂酰肌醇3-激酶寡脱氧核苷酸抑制白介素-1诱导的NF-κB活化

目的　研究反义磷脂酰肌醇 3 激酶 (PI 3 激酶 )寡脱氧核苷酸 (oligodeoxynucleotides,ODN)对核因子 κB(NF κB)活化的影响。方法　Lipofectin介导反义PI 3 激酶ODN转染HepG2细胞 ,以逆转录PCR法检测PI 3 激酶mRNA表达水平 ,用SandwichELISA法检测NF κB的活化。结果　(1)反义PI 3 激酶ODN抑制PI 3 激酶mRNA表达。 (2 )反义PI 3 激酶ODN呈剂量 (1～ 8μg)和时间 (5～ 2 4h)依赖性地抑制NF κB活化 ,2 μg反义PI 3 激酶ODN与细胞共孵育 8h时抑制效果最好。结论　反义PI 3 激酶ODN通过阻断PI 3 激酶表达抑制NF κB活化 ,预示反义PI 3 激酶ODN可潜在抑制IL 1的炎症活性     

反义白介素-1受体相关激酶-1寡核苷酸抑制白介素-1诱导的NF-κB活化

目的 :研究反义白介素 1受体相关激酶 1(IRAK 1)寡核苷酸对核因子 κB(NF κB)活化的影响。方法 :Lipofectin介导反义IRAK 1寡核苷酸转染HepG2细胞 ,以逆转录PCR法检测IRAK 1mRNA表达水平 ,用SandwichELISA法检测NF κB的活化。结果 :反义IRAK 1寡核苷酸抑制IRAK 1mRNA表达 ;反义IRAK 1寡核苷酸呈剂量 (1～ 8μg)和时间 (5～ 2 4h)依赖性地抑制NF κB活化 ,反义IRAK 1寡核苷酸 4μg与细胞共孵育 8h时抑制效果最好。结论 :反义IRAK 1寡核苷酸通过阻断IRAK 1表达抑制NF κB活化 ,预示反义IRAK 1寡核苷酸可潜在抑制IL 1的炎症活性。     

反义脱氧寡核苷酸阻断IGF—I R通道可增强T24膀胱癌细胞对丝裂霉素的敏感性

目的：探讨IGF－I R信号旁路是否参与膀胱癌细胞的耐药性。方法：RT－PCR法检测T24膀胱癌细胞和正常尿路上皮细胞IGF－I,IGF－Ⅱ及IGF－I R mRNA的表达。流式细胞技术和MTT试验检测反义脱氧寡核苷酸能否增强T24细胞对丝裂霉素药物敏感性及凋亡易感性;免疫印迹技术检测反义脱氧寡核苷酸对T24膀胱癌细胞IGF－I R蛋白表达的影响。结果：IGF－I,IGF－Ⅱ及IGF－I R mRNA在无血清培养的T24细胞中高度表达,而正常尿路上皮细胞不表达或仅痕量表达这些生长因子或受体;反义脱氧寡核苷酸阻断IGF－I R通路可以显著抑制膀胱癌细胞的生长并可增强T24细胞对丝裂霉素的敏感性及凋亡易感性。结论：阻断IGF－I R信号通路可有望治疗对化疗不敏感的膀胱癌。     

Irinotecan activates p53 with its active metabolite, resulting in human hepatocellular carcinoma apoptosis

The topoisomerase I inhibitor irinotecan is widely used in anticancer therapy, although the detailed mechanism is still unclear. We investigated the apoptotic mechanisms of irinotecan in human hepatocellular carcinoma (HCC) cell lines (Huh7). SN-38 caused a significant decrease in cell proliferation and induced apoptosis in Huh7 cells and HepG2 cells. SN-38 significantly increased the expression of p53 protein and its phosphorylation at Ser(15) in the nucleus and apoptosis-inducing proteins Bax, caspase-9, and caspase-3, while it significantly decreased the antiapoptosis protein Bcl-xL of Huh7 cells. SN-38-induced apoptosis was recovered after p53 antisense oligodeoxynucleotide (AS ODN) pretreatment, while Huh7 cells were precultured with p53 AS ODN, followed by the addition of SN-38 for 24 h. Furthermore, increases in p53 DNA-binding activity were observed in the nuclei of Huh7 cells after SN-38 treatment as shown by electrophoretic mobility shift analysis. SN-38 binding motifs were detected in the proximal promoter of p53 (bases -433 to -317 and -814 to -711). These results suggest that the p53-mediated apoptosis pathway is important in the anticancer effects of irinotecan in hepatocellular carcinoma.