扇贝精液超低温冷冻保存技术的研究

于１９９７年３月￣１９９７年５月,取山东长岛和青岛太平角海区的虾夷扇贝和栉孔扇贝,采用自然排放法和解剖法取精液,用自然海水作基础溶液,采用不同的抗并保护剂、冷冻速度、平衡时间,对精子的存活率、受精率和孵 进行了研究。结果表明,两种扇贝的精子以自然海水为基础溶液,加８￣１０％的ＤＭＳＯ作为抗冻保护剂,距液氮表面２５ｃｍ、２０ｃｍ、１０ｃｍ各停留８ｍｉｎ,移入液氮中保存;解冻时,距液氮表面１０ｃｍ、１     

日本蟳精子获取和超低温冷冻保存技术研究

本文比较了胰酶消化法、网搓法和机械研磨法3种方法对获得游离日本蟳精子的效果。对获得的精子进行超低温冷冻保存,用曙红Y进行染色,检测精子的存活率。使用7种不同稀释液、不同浓度的二甲基亚砜(DMSO)、甘油(GLY)、1,2-丙二醇(PG)为抗冻保护剂,在6种不同的降温程序下,对日本蟳精子进行超低温冷冻保存,后在不同的温度下解冻复苏精子。实验结果表明:3种精子获取方法中以搓洗法的实验效果最好,胰酶消化法的效果次之,最差的是机械研磨法。其中搓洗法中以500目的筛绢效果最好,精子密度达2.56×10~(13)个/mL。日本蟳精子冷冻保存实验结果表明,稀释液以去钙人工海水、抗冻保护剂以5%DMSO、平衡时间20 min、降温程序P-1(0℃平衡20 min;-5℃/min降至-80℃;-80℃平衡5 min;-20℃/min降至-180℃;然后置于液氮中保存),水浴解冻37.5℃的效果最好,精子存活率最高。     

太平洋牡蛎精液的超低温保存

利用解剖法采集太平洋牡蛎精液 ,用自然海水做基础溶液 ,配制不同浓度的 DMSO(二甲亚砜 )作为超低温保护剂 ,在液氮 (L N2 )面上不同高度进行预处理 ,投入 LN2 内保存 ,升温解冻后 ,检测精子成活率。结果表明 ,DMSO处理浓度、预处理温度及时间和升温方式对超低温保存成活率均具有显著影响。其中 ,用 10 % DMSO在 LN2 面上 17cm预处理 6 min,采用 16～ 17℃流水不完全解冻 ,效果最好 ,超低温保存精子成活率可达 70 %。与新鲜精子相比 ,在 L N2 内保存一天的精子 ,授精能力没有明显变化。     

花鲈精子生理特性及其精液超低温冷冻保存

以精子的活率、寿命和运动状态为参数,探讨了花鲈鲜精在不同盐度、酸碱度和离体条件下的生理特性,并对花鲈精液进行超低温冷冻保存研究.结果表明:盐度和酸碱度主要影响精子的寿命,对精子的活率影响不大;精子离休后置于室温(15～17℃)下8h,其活率和寿命随时间的延长而呈下降趋势,运动状态也逐渐减弱;不同组成成分的基础溶液以及抗冻保护剂的种类、浓度和使用方法均影响精液超低温冷冻保存效果;精液冷冻前经30min降温平衡(0～2℃),效果好于直接冷冻;冻精采用水浴快速解冻法(38～40℃)的效果优于室温(15.5～17.5℃)解冻法.     

美洲黑石斑精子超低温保存研究

作者采用2 mL 的冷存管和程序降温仪高效超低温保存美洲黑石斑(Centropristis striata L.)精子.分析比较了4种不同浓度抗冻剂15%DMSO(二甲基亚砜)、15%EG(乙二醇)、15%PG(丙二醇)和10%Meth(甲醇),5种降温速率(10,15,20,25,30℃/min)和5种解冻温度(30,35,40,45,50℃)对美洲黑石斑精子超低温保存效果的影响.实验结果表明,采用 Hanks’作为稀释液,15% DMSO、15% EG、15% PG 作为抗冻剂,30℃/min 的降温速率对精液进行超低温保存35℃水浴解冻,冻精激活后获得理想的运动率(>60%).通过对抗冻剂、降温速率、解冻温度的筛选,作者建立了美洲黑石斑精液高效超低温保存的方法,并对冻精进行长期保存.美洲黑石斑精子超低温保存方法的建立对于海水鱼类精子库的建立以及种质资源的保存和生物多样性的保护具有重要意义.     

3种对虾精子超低温冷冻保存技术研究

作者以日本囊对虾(Marsupenaeus japonicus)、中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)和南美白对虾(Penaeus vannamei)作为实验材料,研究3种稀释液(天然海水,人工无钙海水,Hank’s平衡盐溶液)、3种抗冻剂(二甲基亚砜、丙二醇和丙三醇)、3种稀释比例(5%、10%和15%)、3种不同的降温程序对3种对虾精子超低温冷冻保存效果的影响。冻精解冻后通过台盼蓝染色的方法计算其存活率。结果显示,对于3种对虾,以天然海水作为稀释液,10%PG作为抗冻剂,4℃平衡20 min,以–2℃/min降温至–40℃,–40℃平衡10℃,以–15℃/min降温至–150℃,然后投入液氮作为降温程序进行超低温冷冻保存效果最好,冻精解冻后存活率分别为75.33%±2.56%、69.00%±3.00%和23.33%±8.55%。     

大黄鱼精子生理特性及其冷冻保存

研究了大黄鱼精子的生理特性及其冷冻保存技术。实验结果表明,大黄鱼精液pH值为6.72—7.25。精子平均密度为14.45×109·ml-1。精子离体后在精液中3.5h(25℃)仍有80.5%可以存活。在精子激活液中,不同的盐度和酸碱度对精子的活力、存活时间和运动状况影响很大。精子适宜的盐度为20—35,pH值为6.60—8.50。在海水中精子的直线快速运动仅持续3min。使用筛选出的精液稀释液和抗冻剂组成精子冷冻保存液。采用快速冷冻保存方法在液氮中保存精子。经保存1a,采用室温(21—23.5℃)自然解冻冻精,精子活力可达到89.5%±4.2%。利用冻精进行大黄鱼的人工授精试验,受精率达82.7%±5.5%,孵化率达85.7%±5.8%,与鲜精对照组相近。     

太平洋牡蛎(Crassostrea gigas)精液的超低温保存研究

筛选了六种抗冻保护剂(GLY[甘油],DMSO[二甲基亚砜],PG[丙二醇],EG[乙二醇],DMA[二甲基乙酰胺],MeOH[甲醇])及其五种不同浓度(6%,8%,10%,12%,14%,V/V)、三种稀释液(HBSS溶液,人工海水[ASW],过滤海水[FSW])、四种稀释比例(1︰1,1︰2,1︰4,1︰6)、三种添加剂(蔗糖,葡萄糖,海藻糖)、三个分步降温程序(程序A,程序B,程序C)对太平洋牡蛎(Crassostrea gigas)精液冷冻保存的影响,成功建立了太平洋牡蛎精液超低温保存方法:以10%DMSO为抗冻保护剂,HBSS溶液为稀释液,1:4的稀释比例,添加海藻糖,采用分布降温法冷冻保存太平洋牡蛎的精液,37°C水浴解冻后精液运动率达到71.27%±3.24%,显著高于其它实验组(P0.05),受精率和孵化率分别达到95.04%±1.99%、93.33%±1.33%,与鲜精(88.89%±15.16%,94.90%±0.95%)、程序冷冻前精液(95.96%±2.15%,92.67%±14.83%)差异不显著(P0.05),证明该太平洋牡蛎精液超低温保存方法可以应用于生产实践和科学研究中。     

脊尾白虾精子体外保存的研究

采用精子存活率和顶体酶活力两种评价精子质量方法,研究了不同稀释剂与抗冻保护剂对脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)精子体外保存效果的影响。结果表明：稀释剂Ⅰ-壬氏液为脊尾白虾精子体外保存的最佳稀释剂,4℃下保存4 d后,稀释剂Ⅰ组精子存活率为71.50%,顶体酶活力为1.803μIU/106,两种指标值均高于其他实验组,各组精子存活率与顶体酶活力之间相关性显著γ=0.846(P<0.05);在液氮-196℃下保存2 d后,稀释剂Ⅰ组精子存活率达83.50%,顶体酶活力为2.507μIU/106,两种指标值均高于其他各组以及4℃下稀释剂Ⅰ组同期保存效果,各组精子存活率与顶体酶活力之间相关性极显著,γ=0.862(P<0.01)。15%DMSO为脊尾白虾精子超低温保存的最佳抗冻保护剂,此条件下超低温保存2 d后,精子存活率为81.32%,顶体酶活力为1.385μIU/106,各组精子存活率与顶体酶活力之间相关性极显著,相关系数γ=0.864(P<0.01)。     

大黄鱼精液的高效超低温保存

采用2 mL的冷存管和程序降温仪高效超低温保存大黄鱼(Pseudosciaena croce)精液。分析比较了5种不同浓度抗冻剂(二甲基亚砜、乙二醇、丙二醇和甘油和甲醇)、3种降温速率(10,20和30℃/min)和2种解冻温度(28℃和43℃)对大黄鱼精液超低温保存效果的影响。实验结果表明,采用Hanks’作为稀释液,10%～20%甘油或10%DMSO作为抗冻剂,20℃/min的降温速率对精液进行超低温保存43℃水浴解冻,冻精激活后获得理想的运动率(76.6%±11.4%～80.0%±12.6%),而且对10%甘油保存的冻精进行人工授精实验获得了与新鲜精液相似的受精率和孵化率。     

点带石斑鱼精子超低温冷冻保存研究

为建立点带石斑鱼(Epinephelus malabaricus)精子冷冻保存技术,保存点带石斑鱼种质资源,作者通过选用TS-19、TS-2、Hank’s、MPRS、Cortland、0.75%NaCl等作为稀释液及10%~25%二甲亚砜、甘油、甲醇作为抗冻液,对繁殖季节中3个不同时期的点带石斑鱼精液进行超低温冷冻保存研究。研究结果表明:(1)Hank’s溶液为点带石斑鱼精子冷冻保存最适冷冻稀释液;(2)Hank’s溶液与10%~15%DMSO溶液为点带石斑鱼精子保存的最适冷冻保护液组合,可以获得60%以上的冻精成活率,而使用不同浓度的MeOH作为抗冻液时,冻精成活率均为0%;(3)以10%~25%Gly作为抗冻液时,冷冻前未加天然海水时均能激活点带石斑鱼精子正常运动,其效果与天然海水相似,加入天然海水后精子运动效果急剧下降,精子冷冻保存后也存在同样现象;(4)为保证获得更高的冻精成活率,点带石斑鱼精液冷冻保存样品的最佳获取时期是在亲鱼自然繁殖期前进行为宜。     

小黄鱼(Larimichthys polyactis)精子的生理特性及超低温冷冻保存研究

为了解养殖小黄鱼精子的生理特性及超低温冷冻保存效果,用计算机辅助精子分析系统(CASA)检测了小黄鱼精子的运动参数及盐度、pH、葡萄糖、离子等环境因子的变化对其精子活力的影响;探究了稀释液、抗冻剂、稀释比及降温高度等对精子冷冻保存效果的影响。结果显示:小黄鱼精液的精子密度为(6.92±1.20)×109/mL。精子经自然海水激活后,运动率、运动时间及寿命分别为(59.31±4.85)%、8.44±0.87min及12.20±0.50min,直线运动速率(VSL)、曲线运动速率(VCL)及平均路径运动速率(VAP)分别为11.96±5.21、25.38±7.19和22.33±6.88μm/s。精子运动适宜的盐度范围为25—30、适宜的pH范围为7.5—8.5,精子在盐度25或pH8.0的海水中活力较好。精子激活效果较好的葡萄糖浓度为0.7—0.9mol/L;浓度0.9mol/L时,精子活力较好。精子激活效果较好的KCl、NaCl、MgCl2及CaCl2溶液浓度分别为0.4—0.5、0.4—0.6、0.7—1.0和0.2—0.3mol/L;精子在KCl及CaCl2溶液中活力相对较差,运动率等参数显著低于对照组;精子在不同人工海水中的运动率显著低于自然海水中的运动率,但精子在单一离子缺陷型人工海水及全人工海水中的运动率无显著差异。以0.25mL麦细管为冻存管, 6种稀释液、不同浓度的4种抗冻剂、5种稀释比及5种降温高度对小黄鱼精子冷冻保存效果的影响试验发现,以HBSS液1︰3稀释精液,添加10%DMSO及15%PG为抗冻剂,液氮面上3.5cm处降温5min后投入液氮中保存效果较好,冻精解冻后运动率达(43.57±2.59)%及(43.06±6.77)%。     

应用MSAP技术研究扇贝全基因组DNA甲基化水平

DNA甲基化作为真核生物基因组重要的表观遗传学修饰,对生物体基因的表达有重要的调控作用。为获得扇贝基因组DNA甲基化修饰水平及模式等表观遗传学信息,以栉孔扇贝(Chlamys farreri)、海湾扇贝(Argopecten irradians)、虾夷扇贝(Mizuhopecten yessoensis)以及本课题组培育的"海大金贝"为材料,建立了甲基化敏感扩增多态性方法(Methylation-sensitive amplified polymorphism,MSAP)的反应体系,利用该方法对其基因组DNA CCGG区域的甲基化水平进行分析。结果表明,本研究筛选得到的引物组合可用于贝类DNA甲基化的研究,在栉孔扇贝、海湾扇贝、普通虾夷扇贝和"海大金贝"的甲基化比例分别为32.08%、25.99%、32.88%和34.97%。几种扇贝基因组CCGG序列中,胞嘧啶的全甲基化率要高于半甲基化率,推测扇贝基因组中主要的甲基化模式是CpG型。通过对"海大金贝"和普通虾夷扇贝闭壳肌甲基化谱进行比较,筛查得到46个差异位点,这些位点可能参与"海大金贝"闭壳肌积累类胡萝卜素的调控。     

流式细胞术比较研究4种双壳贝类血细胞的分群

应用流式细胞术对太平洋牡蛎(Crassostrea gigas)、海湾扇贝(Argopecten irradians)、虾夷扇贝(Patinopecten yessoensis)和毛蚶(Scapharca subcrenata)4种双壳贝类的血细胞分类进行了比较。根据其血细胞的前向角散射光(FSC)和侧向角散射光(SSC)特性的不同将血细胞分群,FSC和SSC二维图分析发现太平洋牡蛎、海湾扇贝和虾夷扇贝的血细胞都可分为3个亚群,即透明细胞、小颗粒细胞和大颗粒细胞,而毛蚶的血细胞只可区分为透明细胞和颗粒细胞2个亚群。同时还对这4种双壳贝类各种血细胞所占比例进行了比较研究,发现各亚群细胞所占比例差异很大。     

中国北方沿海3种养殖扇贝碳、氮稳定同位素的组成特征

应用元素分析和稳定同位素质谱联用技术(EA-IRMS)对中国北方不同养殖地区的虾夷扇贝(Patinopecten yessoensis)、栉孔扇贝(Chlamys farreri)和海湾扇贝(Argopecten irradians)闭壳肌的碳、氮稳定同位素进行了测定,分析3种养殖扇贝的碳、氮稳定同位素组成特征。结果显示,青岛和獐子岛虾夷扇贝闭壳肌的?13C和?15N均差异性显著,长岛和旅顺栉孔扇贝闭壳肌的?15N差异性显著,莱州、牟平和旅顺海湾扇贝闭壳肌的?13C和?15N均差异性显著。闭壳肌的碳、氮稳定同位素组成能有效区分不同产地来源的3种养殖扇贝。     

太平洋牡蛎(Crassostrea gigas)担轮幼虫的超低温保存研究

本文研究了六种抗冻保护剂GLY(甘油)、DMSO(二甲基亚砜)、PG(丙二醇)、EG(乙二醇)、DMA(二甲基乙酰胺)和Me OH(甲醇)在三种不同浓度下(5%、10%、15%,v/v)对太平洋牡蛎(Crassostrea gigas)担轮幼虫的毒性作用及冷冻保存的影响。太平洋牡蛎担轮幼虫毒性实验证明:抗冻保护剂的种类和浓度对太平洋牡蛎担轮幼虫产生的毒性强弱不同,在抗冻保护剂浓度为5%时,GLY、DMSO、PG、EG对太平洋牡蛎的毒性作用显著低于其他抗冻保护剂(P0.05);随着抗冻保护剂浓度增加到10%,GLY、DMSO、EG、Me OH对太平洋牡蛎担轮幼虫的毒性作用显著低于其他抗冻保护剂(P0.05);而抗冻保护剂浓度为15%时,GLY、DMSO对太平洋牡蛎担轮幼虫的毒性作用显著低于其他抗冻保护剂(P0.05),且随着抗冻保护剂浓度的升高,其对太平洋牡蛎担轮幼虫的毒性作用也增大。太平洋牡蛎担轮幼虫的超低温冷冻保存实验证明:以10%DMSO作为抗冻保护剂,采用分布降温法冷冻保存太平洋牡蛎担轮幼虫,28°C水浴解冻后担轮幼虫运动率达到(73.00±2.00)%,显著高于其他实验组(P0.05),其次为GLY组,且各浓度间差异不显著(P0.05)。该研究为太平洋牡蛎及其他贝类胚胎保存提供了科学依据,在贝类遗传育种和生物技术等方面具有一定的应用前景,具有重要的生产实践价值。     

海湾扇贝混交家系中优先受精以及自然选择压力下杂合子过剩的研究

以中国海湾扇(Argopecten irradians)贝养殖群体为亲本分别构建了5个配对混交的海湾扇贝混交系,通过5对微卫星分子标记为手段对海湾扇贝卵子在同一个体和不同个体精子间的优先受精问题和不同生命阶段的海湾扇贝混交系杂合子比例的变化进行了研究。结果发现在受精后6 h的担轮幼虫期3个混交系中有2个混交系杂合子显著过剩。5个混交系的1d D形幼虫、20d稚贝、40d稚贝、3个月稚贝以及成贝在自然选择压力下杂合子比例逐渐上升,以壳长计算的杂交优势率也呈逐渐上升趋势,并且各个阶段的杂合子比例同杂交优势率的变化成显著正相关。     

基于16S rDNA基因序列探讨引进物种紫扇贝(Argopecten purpuratus)在海湾扇贝属(Argopecten)中的分类地位

秘鲁紫扇贝(Argopecten purpuratus)于2008年被引进我国,与海湾扇贝(Argopecten irradians irradians)成功杂交。为探讨紫扇贝在海湾扇贝属中的分类地位及与相似种海湾扇贝的进化关系,随机选取紫扇贝和海湾扇贝各10个个体,利用通用引物进行16S rDNA基因片段扩增并双向测序。序列分析结果表明,紫扇贝和海湾扇贝扩增获得基因片段长度均为542bp,碱基组成A+T所占比例分别为紫扇贝54.2%和海湾扇贝55.1%。紫扇贝和海湾扇贝种内分别有6和10个变异位点,种间有41个变异位点,且种内和种间变异均为转换或者颠换,无插入/缺失类型。结合Gen Bank同源序列信息,对海湾扇贝属物种进行遗传距离分析及分子系统树的构建。结果表明:海湾扇贝属7种扇贝[紫扇贝(A.purpuratus)、A.irradians、墨西哥湾扇贝(A.i.concentricus)、A.i.irradians、A.nucleus、A.gibbus和A.ventricosus]在系统树上聚为2支,与紫扇贝亲缘关系最近的是A.ventricosus,且该两种扇贝单独聚为一支。其余5种扇贝中,A.irradians、A.i.concentricus和A.i.irradians最先聚为一支,支持A.i.concentricus和A.i.irradians为A.irradians两个亚种的结论;另外,A.nucleus与以上三者也有很近的亲缘关系。该研究结果为海湾扇贝属物种进化、迁移及其遗传育种研究提供了理论基础。     

黑鲷精子的超低温保存研究

对黑鲷精子的超低温保存技术进行了初步探讨，黑鲷（Sparus macrocephalus)精子经过超低温保存后复苏率，存活率最高可以达到61．37％和61．4％，保存黑鲷精子时发生冷冻伤害的温度范围是－21－－60℃，适宜的降温速率为20度／min；使用抗冻剂DMSO的适宜浓度为20％，样品体积对保存效果有相关性；利用自然海水激活冻精效果好于低盐度或高pH值的溶液；使用20％DMSO和20℃/min降温速率处理，在液氮中保存黑鲷精子66d后解冻，其复苏率和存活率分别为59．81％和58．45％。     

紫扇贝与海湾扇贝种间杂交的研究

为推动中国扇贝养殖业的进一步发展,作者于2008年从秘鲁引进了紫扇贝(Argopecten purpuratus),尝试将紫扇贝与海湾扇贝(Argopecten purpuratus)进行杂交,以期培育出具有优势性状的杂交子代.利用引进的紫扇贝与海湾扇贝进行种间杂交,培育出紫扇贝(雌)×海湾扇贝(雄)杂交扇贝.实验证明紫扇贝的卵子与海湾扇贝的精子可正常受精,受精卵发育正常.杂交扇贝的生长速度在幼虫阶段和成体阶段均快于海湾扇贝.至收获时,杂交贝比海湾扇贝平均壳高、壳长和壳宽分别大27.3%,25.2%和19.3%,体质量增加107.0%,杂种优势明显.