人骨髓间充质干细胞与脐血单个核细胞对混合淋巴细胞反应及PHA诱导转化的抑制

为研究和比较人骨髓间充质干细胞 (MSC)和脐血单个核细胞在体外的免疫调控能力 ,从人骨髓分离培养间充质干细胞 ,用Ficoll分离得到脐血单个核细胞 ,分别以不同剂量加入到外周血混合淋巴细胞培养体系和植物血凝素 (PHA)刺激的外周血淋巴细胞转化体系中 ,用MTT还原法测定细胞增殖 ,分别观察MSC和脐血单个核细胞对混合淋巴细胞反应和淋巴细胞转化的影响。结果显示 ,5× 10 4 ,1× 10 4 MSC以及 2× 10 5脐血单个核细胞均抑制混合淋巴细胞反应和PHA诱导的淋巴细胞增殖 ,而 <1× 10 4 MSC和 <2× 10 5脐血单个核细胞对混合淋巴细胞反应和PHA诱导的淋巴细胞增殖的抑制作用均不明显 ;5× 10 4 MSC对淋巴细胞增殖的抑制能力明显强于 2× 10 5脐血单个核细胞。结论 :大剂量的骨髓间充质干细胞和脐血单个核细胞在体外对混合淋巴细胞反应和PHA诱导的淋巴细胞转化均具有抑制作用 ,而且间充质干细胞的抑制能力强于脐血单个核细胞。     

脐血间充质干细胞与骨髓间充质干细胞对淋巴细胞增殖的抑制效果比较

目的:比较脐血间充质干细胞和骨髓间充质干细胞对植物血凝素诱导的淋巴细胞增殖的抑制作用。方法:实验于2005-07/2006-03在南昌大学第二附属医院血液病研究所及江西省医学分子重点实验室完成。①实验材料:脐带血9份,由南昌大学第二附属医院妇产科提供,产妇及其家属均知情同意。正常骨髓9份,由南昌大学第二附属医院血液科门诊及住院患者提供,均附有捐赠同意书。外周血9份,取自正常自愿者。本实验经医学伦理委员会批准。②实验方法:无菌条件下采集脐血、骨髓和正常人外周血,分离单个核细胞。脐血及骨髓单个核细胞以1×109 L-1接种于培养瓶中,加入含体积分数为0.1的小牛血清、1×10-3mol/L氢化可的松的IMDM培养液,7d后换液,去除悬浮细胞,以后每3～4d换液1次,待细胞90%融合后,胰蛋白酶 乙二胺四乙酸混合消化,传代培养,取第3代细胞用于实验。正常人外周血单个核细胞以1×109 L-1接种于培养瓶中,加入含体积分数为0.1的小牛血清、10mg/L植物血凝素的IMDM液,培养3d后收集细胞用于实验。③实验评估:采用流式细胞术检测脐血间充质干细胞及淋巴细胞表面分子。取第3代的脐血和骨髓间充质干细胞,体外诱导培养后以脂肪染色液鉴定其向脂肪细胞的分化情况。将不同细胞浓度的脐血和骨髓间充质干细胞分别加入到植物血凝素诱导的外周血淋巴细胞增殖体系中,比较两种不同来源的间充质干细胞对淋巴细胞增殖的调控作用。结果:①脐血间充质干细胞和骨髓间充质干细胞的培养及鉴定:第3代脐血间充质干细胞表面分子标记率CD29为85.18%,CD166为72.52%,CD54为33.70%,CD45为6.70%,CD13为1.51%,CD34为0.23%。正常人外周血单个核细胞中的CD3 T细胞为60%～70%,CD20 B细胞为3.5%～4.5%。脐血间充质干细胞诱导培养3周,可见呈桔黄色的脂肪细胞。②脐血间充质干细胞及骨髓间充质干细胞对淋巴细胞增殖的抑制:淋巴细胞:间充质干细胞为1∶1,1∶0.5,1∶0.1,1∶0.05,1∶0.02,1∶0.01时,脐血间充质干细胞对淋巴细胞增殖的抑制率分别为(49.5±4.8)%,(58.4±6.0)%,(38.1±4.0)%,(31.4±3.2)%,(24.3±3.2)%,(12.6±6.7)%,而骨髓间充质干细胞对淋巴细胞增殖的抑制率分别为(52.4±8.4)%,(65.1±9.7)%,(34.7±4.5)%,(13.0±6.4)%,(-10.7±12.6)%,(-43.9±9.4)%。后3种细胞浓度比例脐血间充质干细胞对淋巴细胞的抑制作用明显强于骨髓间充质干细胞(t=7.72,8.14,14.68,P均<0.05)。结论:脐血间充质干细胞与骨髓间充质干细胞一样,也具有抑制植物血凝素诱导淋巴细胞增殖的作用,抑制效果与间充质干细胞数量有关。低浓度的脐血间充质干细胞对淋巴细胞的抑制作用明显强于骨髓间充质干细胞。     

人脐血间充质干细胞培养及对异体外周血T淋巴细胞增殖的影响

目的:研究发现间充质干细胞具有独特的免疫调节特性,体外能够抑制混合淋巴细胞培养或有丝分裂原刺激中的T淋巴细胞增殖.实验观察体外分离培养的脐血间充质干细胞对异体外周血T淋巴细胞增殖的抑制效果.方法:实验于2004-10/2006-06在解放军兰州军区兰州总医院完成.①对象:足月正常分娩产妇脐血及健康志愿者外周血分别由解放军兰州军区兰州总医院妇产科、血液科提供,产妇与志愿者对实验均签署知情同意书,实验经医院医学伦理委员会批准.②实验方法:Percoll法分离脐血单个核细胞,贴壁纯化,达80%～90%融合时胰蛋白酶消化,按2.0×108L-1密度传代,取第4-5代细胞用于实验.密度梯度法分离外周血单个核细胞,以含体积分数为0.2胎牛血清的RPMI 1640培养基调整细胞浓度至1×109 L-1时加入尼龙棉柱内,用培养基冲出非黏附细胞即为T淋巴细胞.脐血间充质干细胞分为2×108,1×108,0.5×108 L-1组,各100 μL接种于96孔培养板,加入2×108 L-1 T淋巴细胞悬液100 μL,再给予植物血凝素刺激T淋巴细胞转化.以T淋巴细胞 植物血凝素为阳性对照.③实验评估:观察体外培养的脐血间充质干细胞形态,应用流式细胞仪检测细胞表面抗原的表达.MTT法测定脐血间充质干细胞对异体外周血T淋巴细胞增殖的影响.结果:①形态特征与表面抗原表达:原代培养10～18 d形成平行排列、辐射状或旋涡状的成纤维样细胞,即为脐血源性的间充质干细胞,传代7 d左右细胞达90%融合.流式细胞仪检测90%细胞稳定表达间充质干细胞相关抗原CD13,CD29,CD44,CD166,不表达造血细胞系的表面抗原CD34,CD45.②脐血间充质干细胞对异体T淋巴细胞增殖的抑制:与阳性对照比较,经脐血间充质干细胞共培养后植物血凝素刺激T淋巴细胞的增殖作用受到抑制,增殖指数明显降低(P＜0.01).间充质干细胞与T淋巴细胞比值为1:1,1:2和1:4时的增殖抑制率分别为(48.16±2.31)%,(34.47±3.09)%,(22.15±2.63)%.结论:脐血间充质干细胞可显著抑制异体外周血T淋巴细胞的增殖,该抑制作用呈剂量依赖性.     

冻存人脐血间充质干细胞向类肝细胞的诱导分化

目的分离培养人脐血间充质干细胞,观察其冻存复苏后向肝细胞定向分化的能力.方法实验于2004-01/2006-01在四川大学华西医院感染性疾病中心生物治疗国家重点实验室进行.采用密度梯度离心与直接贴壁相结合的方法,1×107 L-1和1×108 L-1两种接种密度进行人脐带血间充质干细胞的分离,观察细胞生长及检测其表面抗原.将第6代的人脐带血间充质干细胞采用梯度冷冻技术冻存6个月,复苏后培养至第8代时,加入肝细胞生长因子和成纤维细胞生长因子-4联合诱导28 d.将第8代人脐带血间充质干细胞爬片与诱导28 d后的类肝细胞爬片共培养,第8代人脐带血间充质干细胞爬片与未诱导培养28 d的人脐带血间充质干细胞爬片共培养作为阴性对照.检测加入肝细胞生长因子和成纤维细胞生长因子4后不同时间点及共培养28 d后的人脐带血间充质干细胞中CK8&18、白蛋白和糖原的表达.结果①密度梯度离心收获的单个核细胞培养传代后,能获得均-贴壁的间充质干细胞,第5代细胞中,CD44阳性的细胞达97.9%.②人脐血间充质干细胞冻存复苏后,活细胞约为70%,复苏后接种密度为1×107 L-1的生长状态优于1×108 L-1.③添加肝细胞生长因子和成纤维细胞生长因子4后,可以在细胞内检测到CK8&18、白蛋白及糖原的表达.④与类肝细胞共培养28 d后,人脐血间充质干细胞中小部分细胞中同时表达CK8&18和白蛋白,并有糖原的表达.结论人脐血间充质干细胞可采用密度梯度离心法结合直接贴壁法分离获得,并可冷冻保存;复苏后在肝细胞生长因和成纤维细胞生长因子4的联合诱导下,能定向分化为表达CK8&18,并合成白蛋白和糖原的类肝细胞,类肝细胞可能具有诱导人脐血间充质干细胞向肝系细胞定向分化的作用.     

人脐带沃顿胶间充质干细胞对人外周血T淋巴细胞的免疫调节作用

背景:骨髓源性间充质干细胞具有低免疫原性和免疫调节作用,但有关人脐带沃顿胶间充质干细胞的免疫调节作用及其机制研究较少.目的:观察脐带沃顿胶间充质干细胞对异体外周血T淋巴细胞的免疫调节作用及机制.方法:从人脐带沃顿胶组织块培养中分离出间充质干细胞.将脐带沃顿胶间充质干细胞及脐带沃顿胶间充质干细胞培养上清分别与植物凝集素刺激下的人外周血T淋巴细胞共培养,多功能酶标仪测量脐带沃顿胶间充质干细胞及脐带沃顿胶间充质干细胞培养上清与植物凝集素刺激下的人外周血T淋巴细胞共培养72 h后A值:ELISA试剂盒检测培养上清中转化生长因子β1、γ-干扰素的表达.结果与结论:沃顿胶间充质干细胞对植物凝集素刺激下的T淋巴细胞增殖有抑制作用,增殖抑制率为56%(P＜0.01),沃顿胶间充质干细胞培养上清对植物凝集素刺激下的T淋巴细胞增殖也具有抑制作用,且这种抑制呈剂量依赖性.含50%沃顿胶间充质干细胞培养上清组和100%培养上清组的增殖抑制率分别为8.3%、27%(P＜0.05);沃顿胶间充质干细胞能显著降低T淋巴细胞分泌的γ-干扰素(P＜0.05):可分泌转化生长因子β1,沃顿胶间充质干细胞与T淋巴细胞共培养组的转化生长因子β1分泌量低于沃顿胶间充质干细胞单独培养组(P＜0.05).提示沃顿胶间充质干细胞及沃顿胶间充质干细胞培养上清对植物凝集素刺激下的丁淋巴细胞增殖均有抑制作用,其作用机制可能与细胞间的接触及抑制T淋巴细胞分泌的γ-干扰素有关.     

人脐血间充质干细胞对T淋巴细胞旁分泌的免疫调节作用

背景:相关研究表明脐血间充质干细胞具有一定的免疫调节作用,但具体机制不详。目的:观察脐血源间充质干细胞通过旁分泌机制对T淋巴细胞增殖的影响。方法:分离正常分娩产妇脐血间充质干细胞和健康志愿者外周血T淋巴细胞,按不同比例建立脐血间充质干细胞与T淋巴细胞非接触共培养体系,以单独培养T淋巴细胞作为对照组。结果与结论:脐血间充质干细胞形态学呈现成纤维梭型细胞样,呈旋涡状团集生长。流式细胞仪检测脐血间充质干细胞表面标记物:CD29(+),CD44(+),CD34(-),CD45(-),HLA-DR(-);与对照组相比,共培养组可明显抑制植物血凝素刺激T淋巴细胞的增殖作用(P<0.05),且呈剂量依赖性;ElISA法检测共培养组分泌的白细胞介素10水平较对照组明显升高(P<0.05);中和试验后脐血间充质干细胞对T淋巴细胞增殖的抑制作用明显减弱。结果说明脐血间充质干细胞可明显抑制异体外周血T淋巴细胞的增殖,可能是通过旁分泌白细胞介素10达到负向免疫调节作用。     

人脐血间充质干细胞对T淋巴细胞旁分泌的免疫调节作用

背景：相关研究表明脐血间充质干细胞具有一定的免疫调节作用,但具体机制不详。目的：观察脐血源间充质干细胞通过旁分泌机制对T淋巴细胞增殖的影响。方法：分离正常分娩产妇脐血间充质干细胞和健康志愿者外周血T淋巴细胞,按不同比例建立脐血间充质干细胞与T淋巴细胞非接触共培养体系,以单独培养T淋巴细胞作为对照组。结果与结论：脐血间充质干细胞形态学呈现成纤维梭型细胞样,呈旋涡状团集生长。流式细胞仪检测脐血间充质干细胞表面标记物：CD29（＋）,CD44（＋）,CD34（-）,CD45（-）,HLA-DR（-）;与对照组相比,共培养组可明显抑制植物血凝素刺激T淋巴细胞的增殖作用（P〈0.05）,且呈剂量依赖性;ElISA法检测共培养组分泌的白细胞介素10水平较对照组明显升高（P〈0.05）;中和试验后脐血间充质干细胞对T淋巴细胞增殖的抑制作用明显减弱。结果说明脐血间充质干细胞可明显抑制异体外周血T淋巴细胞的增殖,可能是通过旁分泌白细胞介素10达到负向免疫调节作用。     

不同质量浓度时转化生长因子β1将如何诱导大鼠骨髓间充质干细胞向平滑肌样细胞的分化

背景:在内膜损伤后炎症反应的过程中,间充质干细胞可以从骨髓释放到病灶处,参与损伤修复.但目前尚缺乏在细胞水平对转化生长因子β1如何促进骨髓间充质干细胞转化为平滑肌样细胞的分子机制研究.目的:揭示体外实验条件下,血管急性损伤时不同质量浓度转化生长因子β1如何诱导骨髓间充质干细胞向平滑肌样细胞分化.设计、时间及地点:随机对照动物实验,体外诱导细胞观察,于2008-01/2009-05在上海交通大学医学院附属第九人民医院SPF级实验动物中心和上海交通大学医学院附属第九人民医院组织工程实验室完成.材料:雄性SD大鼠24只,随机分为正常对照组、模型组,12只/组.另取4周龄雄性SD大鼠6只,用于分离制备骨髓间充质干细胞.方法:①模型组大鼠建立颈总动脉急性损伤模型.取正常对照组及模型组大鼠损伤后1,3,7 d的血清,运用双抗体夹心ABC-ELISA法检测血清中转化生长因子β1的水平.②第1次传代后的大鼠骨髓间充质干细胞以(1.0～3.0)×10~5个/100 mm培养皿的密度接种,设立2组:常规培养组仅加入含体积分数为20%的胎牛血清高糖DMEM基础培养液;转化生长因子β1诱导组在常规培养组基础上,分别给予1,3,5,10 μg/L转化生长因子β1诱导1周.主要观察指标:损伤后血清中转化生长因子β1的表达;相差倒置显微镜观察诱导后细胞形态学变化:平滑肌细胞标志物α-肌动蛋白的表达.结果:①正常对照组大鼠血清中转化生长因子β1的质量浓度较低;模型组大鼠损伤后1 d血清中转化生长因子β1的质量浓度即已升高,损伤后3 d达高峰,损伤后7 d明显下降,但仍未完全恢复到基础水平.②骨髓间充质干细胞经转化生长因子β1诱导1周后,细胞融合成片,形成峰谷样外观.③免疫细胞化学检测结果显示,与常规培养组比较,1,3,5,10 μg/L转化生长因子β1诱导组平滑肌细胞分化率均明显增加,尤其是5,10μg/L转化生长因子β1诱导组差异有显著性意义(P＜0.01).实时定量PCR结果与免疫细胞化学检测结果相似.结论:急性血管损伤后大鼠血清中转化生长因子β1呈高表达,并在损伤后3 d达高峰.在体外,经类似此高峰浓度的转化生长因子β1诱导后,对骨髓间充质干细胞向平滑肌样细胞分化有较好的促进效应.     

无细胞接触条件下成人骨髓间充质干细胞培养上清对异体淋巴细胞增殖的负调控作用

背景:成人骨髓间充质干细胞对异体淋巴细胞增殖具有负调控作用的理论已公认,但证实其具体机制的资料有限。目的:在无细胞接触的条件下,观察成人骨髓间充质干细胞培养上清对异体淋巴细胞增殖的负调控效果。设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2005-10/2007-12在解放军兰州军区兰州总医院完成。材料:骨髓标本来源于行异基因造血干细胞移植的健康供者,外周血来源于健康志愿者。方法:无菌条件下采集成人骨髓,Percoll 贴壁法体外分离培养骨髓间充质干细胞。取新鲜肝素抗凝的外周血,Ficoll法分离出淋巴单个核细胞,调整浓度为2×109L-1,分别取100μL淋巴细胞悬液,置入96孔板中,设立4组:培养上清组加入培养3d的骨髓间充质干细胞培养上清,100μL/孔;培养上清 植物血凝素组在前组基础上加入1g/L植物血凝素5μL;空白对照组加入含体积分数0.1胎牛血清的LG-DMEM培养液100μL;植物血凝素组在空白对照组基础上加入1g/L植物血凝素5μL。置37℃、体积分数为0.05的CO2饱和湿度孵箱中培养3d。主要观察指标:骨髓间充质干细胞培养上清对异体淋巴细胞增殖转化的影响。结果:与空白对照组和植物血凝素组比较,加入骨髓间充质干细胞培养上清后淋巴细胞增殖活性明显下降(P<0.05),其增殖转化抑制率为9.00%。与培养上清组比较,在有植物血凝素刺激的情况下,淋巴细胞增殖活性进一步下降(P<0.01),其增殖转化抑制率达20.91%。结论:成人骨髓间充质干细胞培养上清能够抑制异体淋巴细胞增殖转化,且在外源性刺激源植物血凝素存在的情况下,其抑制效果明显增强,提示其负调控作用至少是部分通过分泌可溶性细胞因子而间接对淋巴细胞产生抑制的。     

人骨髓间充质干细胞对脐血T淋巴细胞转化的影响

为研究间充质干细胞（mesenchymal stem cell，MSC）的免疫调节作用，从人骨髓中分离培养间充质干细胞，并通过其形态的均一性及流式细胞术检测其表面标志以鉴定其纯度。将分离培养的间充质干细胞接种于96孔板中（分别为2000个/孔组与1000个/孔组），与经分离的脐血T淋巴细胞共培养3天，以单独培养的脐血T淋巴细胞为对照组，加入植物血凝素（PHA）刺激60小时，H^3-TdR标记后用液体闪烁计数仪检测，以观察MSC对脐血T淋巴细胞转化的影响。结果显示，当接种2000个MSC时，其对T细胞的增殖起抑制作用（抑制率为33.4％）；而接种1000个MSC时，其对T细胞的增殖起促进作用（促进率为22.5％）。由此得出结论，MSC免疫调控作用与其加入细胞数量相关，当MSC数量多时表现为负调控，而当MSC数量少时表现为正调控。