实验性病毒性心肌炎心肌颗粒酶B表达的研究

目的 探讨颗粒酶B(GzmB)在病毒性心肌炎(VMC)心肌损伤过程中的作用及其发病机制.方法 将36只5-6周龄雄性BALB/c小鼠随机分成两组:正常组1O只,模型组26只.于第11天处死小鼠取出心脏观察心肌病变,并以半定量RT-PCR和免疫组化方法检测心肌GzmB的表达.结果 模犁组小鼠心肌组织中均检测到GzmB阳性细胞和GzmB mRNA的表达,且小鼠心肌浸润细胞中GzmB阳性细胞数与心肌病理积分呈显著正相关(r=O.859,P=O.000),而正常组小鼠心肌中未检测到GzmB的表达.结论 心肌浸润细胞中GzmB的表达在病毒性心肌炎心肌损伤中起一定作用,其介导的细胞毒效应是导致病毒性心肌炎心肌损伤的重要机制之一;心肌浸润细胞中GzmB的表达量与心肌损害严重程度成显著正相关.     

人颗粒酶B基因的克隆、蛋白纯化及表达分析

TIL具有抗肿瘤的活性 ,其中颗粒酶B在杀伤肿瘤细胞的过程中起了最重要的作用。本实验拟扩增GrB全序列 ,构建GrB的原核表达载体 ,从而建立其原核表达体系 ,获得高效表达的重组GrB ,纯化蛋白。用淋巴细胞分离液分离肿瘤组织中的淋巴细胞 ,并抽提RNA ,RT PCR方法获得GrB的全长 ,并重组到pGEX 4T 1中 ,用限制性内切酶酶切和DNA测序法进行鉴定 ,IPTG诱导pGEX GrB转化的BL2 1菌 ,大量纯化表达产物 ,并通过SDS PAGE、Westernblot分析表达产物 ,用MTT法体外检测GrB对Hep2细胞的作用。结果 :限制性内切酶酶切和DNA测序分析证实成功获得GrB基因片段 ,GrB准确克隆入pGEX 4T 1 ,成功的构建pGEX GrB ,经诱导表达出与GST融合的蛋白 ,经凝血酶酶切后获得与GrB相符的条带 ,并能与GrB特异性抗体结合。体外实验表明 ,GrB能抑制Hep2细胞的增殖。成功构建了pGEX GrB ,并成功表达、大量纯化GrB蛋白 ,其能够抑制Hep2细胞的增殖。     

颗粒酶B:有力的细胞免疫杀伤因子

丝氨酸蛋白酶家族成员颗粒酶B是细胞毒淋巴细胞介导的颗粒胞吐免疫效应中有力的杀伤因子。近年来,颗粒酶B与穿孔素协同作用的靶细胞摄取机制受到质疑,“受体内化”及“静电交换”等新模型被相继提出。颗粒酶B在靶细胞内能够诱导caspase依赖及非依赖性的凋亡,还能直接作用于死亡底物发挥细胞毒作用,同时具有基质重塑等重要的细胞外功能。颗粒酶B与自身免疫疾病及抗病毒感染密切相关,在恶性肿瘤细胞杀伤方面的应用价值正日益受到关注。     

诱导表达人活性型颗粒酶B的Hela细胞系的建立

目的 :构建人颗粒酶B基因的可诱导表达载体 ,并将其在Hela细胞中诱导表达 .方法 :用PCR法获取人活性型颗粒酶B基因序列 ,克隆入pIND诱导表达载体中。将其与辅助质粒pVgRXR通过脂质体法共转染Hela细胞后 ,用G4 18和zeocin筛选建系。通过免疫细胞化学染色法 ,确定蜕皮激素A最佳的诱导浓度及诱导时间 ,并通过MTT比色法检测及细胞骨架染色等方法观察 ,表达的活性型颗粒酶B对Hela细胞形态和生长的影响。结果 :获得可诱导表达人活性型颗粒酶B基因的Hela细胞系。免疫细胞化学染色表明 ,30 μmol/L蜕皮激素诱导 5d时目的蛋白表达最强 ,同时观察到Hela细胞的形态发生变化 ,出现多核大细胞及固缩小细胞 ,并且细胞生长受到抑制。骨架分析进一步显示 ,多核大细胞的骨架发生异常。结论 :活性型颗粒酶B的可诱导表达系统的建立 ,为进一步研究颗粒酶B的生物学效应功能奠定了基础     

IL—2激活的淋巴细胞中穿孔素和颗粒酶的表达

ＩＬ－２激活的淋巴细胞中穿孔素和颗粒酶的表达李成文严文伟郝玉书韩明哲邱录贵韩俊领刘汉芝近年来对免疫效应细胞杀伤肿瘤机制提出多种作用模式，其中颗粒外排、Ｆａｓ抗原启动程序性细胞死亡是二条主要途径。颗粒外排模式为效应细胞和靶细胞接触后，含有穿孔素和颗粒酶...     

颗粒酶B抑制剂的研究进展

颗粒酶B是细胞毒淋巴细胞发挥免疫杀伤作用的重要效应因子,不仅在靶细胞内快速诱导凋亡及其它细胞毒作用,还具有重要的胞外生物学功能.颗粒酶B在机体内的自稳调节主要通过与丝氨酸蛋白酶抑制剂超家族成员相互作用而实现.这种内源抑制剂是细胞毒淋巴细胞及某些抗原递呈细胞保持其免疫内稳态的重要调控者,在临床上还能缓解与颗粒酶B死亡路径相关的自身免疫性疾病及移植排斥反应.多种肿瘤细胞已被发现有颗粒酶B抑制剂的表达,可能与其逃避促凋亡作用有关.为抵制抗感染效应,各种病毒亦进化产生了不同作用机制的颗粒酶B抑制剂.研究各种天然及人工合成的颗粒酶B抑制剂有助于在对抗人类自身免疫性疾病及癌症方面提供基于选择性调控的新型治疗方法 ,在抗病毒药物研制方面也具有潜在的临床应用价值.     

颗粒酶B直接裂解部分断裂的基因组DNA--颗粒酶B诱导细胞凋亡新途径

目的：颗粒酶B(Granzyme B，GraB)对核内物质具亲和力，体外除去核膜的细胞核中可观察到大量GraB聚积，观察GraB是否直接作用于基因组DNA。方法：通过抽提人外周血淋巴细胞总RNA，进行RT-PCR克隆GraB cDNA，构建GraB原核表达载体，用限制性酶切和DNA测序进行鉴定；异丙基-1-硫代-β-呋喃半乳糖苷(IPTC)诱导表达，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析表达产物。表达产物经亲和层析纯化后，观察其对基因组DNA的功能。结果：表达产物以可溶性分子形式存在于菌体中，具有良好的抗原性和特异性，特异性底物检测有活性，且具有直接作用于部分断裂的基因组DNA，使其发生进一步裂解的活性。结论：Grab直接作用于部分断裂的基因组DNA，这可能是GraB诱导细胞凋亡新的作用途径。     

人外周血NK细胞在细胞因子刺激下扩增后穿孔素、颗粒酶B基因表达的变化

目的 探讨经过纯化及在多种细胞因子的作用下扩增后的NK细胞,其穿孔素(per-furin)、颗粒酶B(granzyme B)表达水平的改变与细胞杀伤率的关系.方法 应用竞争性定量RT-PCR方法 检测了8例供者纯化、扩增后NK细胞的穿孔素、颗粒酶B基因表达水平,同时检测其对K562细胞的杀伤率.结果 经纯化、扩增后的NK细胞,在多种细胞因子作用下穿孔素和颗粒酶B的基因表达水平明显提高,且.IL-2+IL-15组、IL-2+IL-12+IL-15组基因的表达量均显著高于其他组,NK细胞对K562的杀伤率结果 与基因表达水平一致.结论 应用细胞因子后可使NK细胞的穿孔素、颗粒酶B基因表达水平明显提高,同时提高了NK细胞的杀伤功能.     

颗粒酶研究进展

穿孔素 /颗粒酶是细胞毒细胞发挥效应的主要途径 ,是分子免疫学研究的内容之一。本文综述了有关颗粒酶的生物学的特性 ,细胞毒作用 ,细胞毒作用机理研究 ,颗粒酶的分泌与贮存及其研究应用方面的进展。     

人源性抗HBc单链抗体真核表达载体的构建及其细胞内表达

目的：构建人源性抗HBc单链抗体的真核表达载体并在细胞内表达。方法： 采用DNA重组技术将特异性人源性抗HBc单链抗体基因插入真核表达载体pEGFP-c1；转染HepG2细胞，经G418筛选细胞，荧光倒置显微镜观察细胞内抗HBc单链抗体与绿色荧光蛋白融合表达情况，并用ELISA法检测HBc单链抗体基因的细胞内表达。结果： 成功地构建了人源性抗HBc单链抗体的真核表达载体。转染HepG2细胞并筛选后，经荧光倒置显微镜观察，细胞内有绿色荧光蛋白表达；ELISA检测细胞内表达的单链抗体片段具有HBcAg结合活性。结论： 人源性抗HBc单链抗体的真核表达载体的构建并在细胞内成功表达，为胞内抗HBc单链抗体的进一步研究奠定了基础。     

Et-DHA通过激活线粒体途径和T细胞granzyme B诱导HepG2细胞凋亡

 目的：本研究探讨了二十二碳六烯酸乙酯（Et-DHA）对人肝癌HepG2细胞凋亡的影响。方法：HepG2细胞用于检测Et-DHA的抑癌活性,MTT法检测Et-DHA对HepG2细胞的直接抑制作用,Hoechst 33258荧光染色观察细胞的形态特征,ELISA法检测Et-DHA处理后HepG2细胞的活性氧簇（ROS）释放量、总超氧化物歧化酶（SOD）和caspase-9活性,Western blotting法检测胞质和线粒体中Bax、Bak、Bid、Bcl-2、Smac和细胞色素C(Cyt C),以及胞质中cleaved caspase-8、cleaved caspase-9和cleaved caspase-3的水平;T细胞与HepG2细胞共培养,进一步观察Et-DHA处理后T细胞的增殖对HepG2细胞活性的影响,并检测了颗粒酶（granzyme）B的水平。结果：Et-DHA显著抑制HepG2细胞的生长（P＜0.05）,这种抑制作用具浓度效应和时程效应;Et-DHA处理后HepG2细胞的ROS释放量增加,但总SOD活性无明显变化,caspase-9活性显著上升（P＜0.05）;线粒体上的促凋亡蛋白Bax、Bak和Bid水平增加,而抑凋亡蛋白Bcl-2以及线粒体中Cyt C和Smac的水平降低,胞质中的Cyt C、Smac、cleaved caspase-8、cleaved caspase-9、cleaved caspase-3以及cleaved Bid水平呈剂量性升高。另外 T细胞和HepG2细胞共培养组在Et-DHA的诱导下,HepG2细胞的凋亡程度与Et-DHA单独作用时相比进一步增加。在Et-DHA刺激下,T细胞内granzyme B上调,释放到HepG2 细胞内的granzyme B明显增多。结论:Et-DHA可能主要通过线粒体内源性途径以及caspase-8途径,激活caspase-3,诱导HepG2细胞凋亡,以及通过间接活化T细胞,促使 granzyme B增多,从而增强对HepG2细胞的毒性作用。     

人穿孔素基因真核表达载体的构建与表达分析

早在十多年前,人们就发现肿瘤特异性杀伤细胞（Tumor-specific cytolytie T lymphocytes,CTL）含有很多颗粒,当CTL细胞的T细胞受体与靶细胞的MHC抗原结合后,通过Ca^2＋依赖途径使颗粒极化并向外释放,     

Decreased perforin and granzyme B expression in senescent HIV-1-specific cytotoxic T lymphocytes

Cytotoxic T lymphocyte (CTL) senescence may be an important mechanism of immune failure in HIV-1 infection. We find that senescence of HIV-1-specific CTL clones causes loss of killing activity, preventable by transduction with telomerase. Furthermore, senescence is associated with reduced expression of the effector molecules granzyme and perforin, suggesting CTL "exhaustion" can result in hypofunction. These results agree with other studies showing that HIV-1-specific CTL exhibit abnormal phenotypes in vivo, and suggest the possibility that chronic turnover is an important mechanism of antiviral failure in HIV-1 infection.     

顶体素结合蛋白真核表达载体的构建及其在肝癌细胞株的表达

目的:构建ACRBP真棱表达载体,建立稳定表达ACRBP的人肝癌细胞株,为后继研究该基因的功能奠定基础.方法:以pMAL-C2/ACRBP重组质粒作为模板进行PCR,扩增出ACRBP编码区cDNA,并与真核表达载体pEGFP-N1连接,构建pEGFP-N1/ACRBP重组质粒.通过Fugene HD将该重组质粒转染至ACRBP表达阴性的肝癌细胞株HepG2,经G418筛选阳性克隆获得稳定转染株.RT-PCR和免疫组织化学方法检测HepC-2细胞中ACRBP的表达情况.结果:pEGFP-N1/ACRBP真核表达载体经测序证实插入序列完全正确;ACRBP基因已经稳定转染至HepG2细胞中并获得表达.结论:成功构建了pEGFP-N1/ACRBP真核表达载体并将其转染HepG2后,能稳定地表达ACRBP.