沙门菌、产单核细胞李斯特菌多重PCR检测方法的建立及应用

目的建立沙门菌、产单核细胞李斯特菌多重PCR检测方法,提高检测效率和敏感性。方法选择沙门菌组氨酸转运操纵子基因、产单核细胞李斯特菌溶血素基因序列设计引物,在单一PCR方法基础上,建立检测两种病原菌的多重PCR技术。结果在495bp和850bp处分别出现预期的特异性DNA扩增条带,敏感性试验显示该体系能检测出32pg的沙门菌DNA和274pg的李斯特菌DNA,样品检测表明该方法与单一PCR和国标方法的符合率达100%。结论本研究建立了能同时检测沙门菌和产单核细胞李斯特菌的多重PCR技术,为主要食源性病原菌快速检测提供了新方法。     

牛结核病荧光定量PCR快速检测方法的建立及初步应用

目的建立牛结核病荧光定量PCR快速检测方法。方法根据分枝杆菌的插入序列IS1081设计引物和探针,优化反应条件,建立标准曲线,进行特异性、敏感性、重复性实验,并用所建立的方法对临床样品进行检测。结果该方法的敏感性达到了10个拷贝,且特异性高,重复性好。对30份PPD试验和巢式PCR检测都为阳性的临床样本进行荧光定量PCR检测的结果全部为阳性;而对PPD检测阳性,巢式PCR检测为阴性的15份临床样本进行检测时,2份为阳性;在对2份PPD检测阴性而巢式PCR检测阳性的临床样本的检测结果也为阳性。结论成功建立了牛结核病荧光定量PCR快速检测方法,对临床样品的快速检测和牛结核病的早期诊断具有重要意义。     

二聚体蝎型探针荧光定量PCR快速检测志贺菌方法的建立及初步应用

目的 利用二聚体蝎型荧光探针法,建立一种可广泛应用且敏感、特异的检测志贺菌的荧光定量PCR技术。方法 根据编码志贺菌ipaH基因的核苷酸序列设计引物和荧光探针,采用基因重组技术构建用于志贺菌检测的定量标准品,通过对荧光定量PCR反应体系和反应条件的摸索,建立了检测志贺菌的二聚体蝎型探针定量PCR方法。结果 成功构建了志贺菌重组质粒标准品和志贺菌实时荧光定量PCR方法;通过特异性、敏感性、稳定性和重复性验证,结果表明具有较好的特异性、敏感性、稳定性和重复性;对比分离培养标本,二者符合率为100％;对比TaqMan方法,本方法具有更敏感、省时、成本低的特点。结论 建立了一种以二聚体蝎型荧光探针技术为基础的志贺菌荧光定量PCR检测法,为研制新型的检测试剂盒奠定了基础,可应用于食品卫生监管以及传染病诊断等。     

肠炎血清型沙门菌多重PCR检测方法的建立及应用

摘 要：目的 为临床确诊及基层实验室快速准确鉴定肠炎血清型沙门菌提供实验室支持,同时为沙门菌传统血清学鉴定方法提供技术补充。方法 根据沙门菌菌体抗原A/D1群基因、鞭毛抗原基因（fliC-HG）及肠炎沙门菌特异性基因片段（sdf I）设计引物,建立多重PCR体系并进行反应条件优化。对所建立的体系的特异性进行检测,并将该体系应用于浙江省2009-2010年分离的共计53株样本的检测。结果 建立并优化了肠炎沙门菌检测的多重PCR体系,该体系具有高特异性,可准确快速鉴定肠炎血清型沙门菌,也可区分A群及D群血清群的沙门菌,并能检测鞭毛抗原为HG的沙门菌,对实际样本检测符合率达100%。结论 该体系能正确鉴定肠炎血清型沙门菌,可作为沙门菌传统血清学分型的辅助方法,可弥补商品化血清质量层次不齐的缺陷。并为肠炎沙门菌的监测与实验室诊断提供了一种简单快速、重复性好的新方法。     

实时荧光定量PCR在登革热病毒快速检测中的应用

目的应用实时荧光定量PCR快速检测登革热病毒感染。方法采集疑似登革热患者血清,采用实时荧光定量PCR检测登革热病毒,同时采用ELISA检测血清登革热IgM抗体。结果患者发病第7d血清登革热IgM血清抗体A值为0.236和0.237(临界值0.250),高度疑似阳性,第13d血清IgM抗体阳性。患者发病第2d,通用型核酸检测显示血清登革热病毒核酸含量较多,经过治疗,于第7d病毒拷贝下降。发病第2d,核酸检测确定感染病毒为登革热Ⅲ型;发病第13d血清登革Ⅲ型病毒核酸检测阴性。结论实时荧光定量PCR法具有准确性好、灵敏度高等优点,可用于登革热病毒感染的快速检测。     

贝氏柯克斯体实时荧光定量PCR方法的建立及对云南鼠标本检测

目的 建立贝氏柯克斯体荧光定量PCR方法并应用于云南省鼠标本的检测.方法 根据贝氏柯克斯体ISlllla基因设计引物和探针,以克隆的ISlllla基因片断(485 bp)作标准DNA模板,建立实时荧光定量PCR检测方法,并与普通巢式PCR方法进行比较.采用2种方法对云南玉溪自然界采集的鼠各类标本进行检测分析,计算2种方法的检出率.结果 实时荧光定量PCR标准曲线的循环阈值(cycle threshold,Ct)与模板拷贝数呈良好的线性关系(r=-0.999),重复性测试Ct变异系数(coefficient of variation,CV)为0.25%～3.98%,灵敏度为巢式PCR的10倍.以其他立克次体和常见病原菌共26种DNA为模板进行特异性检测,结果均为阴性.实时荧光定量PCR检测鼠血、肝脏、脾脏中的贝氏柯克斯体,阳性率分别为32.31%、61.29%、85.19%;巢式PCR法检测相应标本阳性率分别为27.69%、11.29%、74.07%;间接免疫荧光试验检测鼠血清中贝氏柯克斯体IgG抗体阳性率为26.15%.结论 本实验建立的实时荧光定量PCR比巢式PCR敏感,且具有良好的特异性,可用于人群和动物贝氏柯克斯体感染监测及临床标本的检测.     

嗜水气单胞菌双重荧光定量PCR检测方法的建立与初步应用

目的建立快速准确检测致病性嗜水气单胞菌的双重荧光定量PCR方法。方法针对嗜水气单胞菌的16S rDNA和气溶素基因aerA的序列设计特异性引物及TaqMan探针,优化双重荧光定量PCR反应条件,并结合常规PCR方法及分离培养鉴定对临床样品进行检测和对比验证。结果荧光定量PCR反应体系对质粒标准品的敏感性为10拷贝/反应,是常规PCR检测方法的100倍;该方法检测12种其他种属细菌时未出现假阳性;对实际样品的检测结果其敏感性同样高于普通PCR,定量检测目的基因的拷贝数与样品中目的菌的分离率成正比。结论本方法敏感性高,特异性好,可用于致病性嗜水气单胞菌感染的诊断、疾病防控及流行病学研究。     

TaqMan-rRT-PCR检测猪霍乱沙门菌方法的建立和实验室评价

目的 基于猪霍乱沙门菌血清型特异性基因,建立TaqMan逆转录实时聚合酶链反应(TaqMamrRT-PCR)检测猪霍乱沙门菌的方法.方法 利用基因组序列比对筛选到猪霍乱沙门菌特有的基因SC0358,通过普通PCR及利用多种血清型沙门菌及非沙门菌菌株共计145株,评价该方法的菌株特异性,针对该基因设计TaqMan-rRT...     

汉坦病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立

目的通过建立汉坦病毒实时荧光定量PCR检测方法,快速准确地检测汉坦病毒。方法根据汉滩型和汉城型汉坦病S片段基因的序列分别设计特异性探针引物,使用含有目的基因片段的重组质粒标准品绘制标准曲线,建立检测两型汉坦病毒的实时荧光定量PCR方法。结果建立的检测方法特异性良好,与其他常见病原不发生交叉反应;最低检测限为101copies/μl,灵敏度高;不同梯度定量模板的拷贝数的对数值与Ct值之间线性关系表达式分别为y=-3.4607x＋40.988（HTN）,y=-3.5307x＋39.356（SEO）,扩增效率分别为92.2%（HTN）和92.6%（SEO）,相关系数R2分别为0.9968（HTN）和0.9997（SEO）,呈良好的线性关系,且重复性好。结论建立的实时荧光定量PCR灵敏度高,重复性好,可用于汉坦病毒的快速检测,并可初步辨别汉滩型和汉城型汉坦病毒,对肾综合征出血热的病原早期诊断和流行病学调查有较好的应用价值。     

复合探讨PCR定量检测HBV方法的建立及临床应用

我们采用复合探针技术,设计、建立的实时、荧光定量检测ＨＢＶ ＤＮＡ的方祛,对实验条件进行了优化,并对临床提供的２０２份血清标本进行ＨＢＶ ＤＮＡ检测,与ＥＬＩＳＡ方法结果进行比较。 一、资料与方祛 １ 资料：２０２份血清标本由重庆医科大学附属第一医院提供;ＨＢＶ标准质粒由军事医学科学院放射研究所配制,定量;仪器为ｉＣｙｃｌｅｒ自动荧光ＰＣＲ仪（美国ＢＩＯ－ＲＡＤ公司生产）;ＨＢＶ ＥＬＩＳＡ试剂盒由上海科华实业有限公司提供;特异性引物的设计和合成为根据Ｐｒｉｍｅｒ３软件,自行设计并合成了以下引物序列：…     

人G1型轮状病毒TaqMan荧光定量检测方法的建立与应用

目的本研究旨在建立一种快速准确定量检测人G1型轮状病毒的TaqMan探针荧光实时PCR检测方法。方法以轮状病毒VP6基因为靶基因,分别设计2对引物及其相应的TaqMan探针,扩增目的片段,将目的片段克隆于PCDNA3.1+载体上,体外转录获得RNA,系列稀释后为标准品,建立TaqMan探针荧光定量实时PCR检测方法并对该方法进行验证。结果　设计实验找到最优条件下的引物浓度(250 nmol/L)、探针浓度(300 nmol/L);通过对引起腹泻的人柯萨奇病毒、呼肠孤病毒等进行检测,结果均为阴性,表明该方法具有很好的特异性。该方法的最低检测量为5 copies/μL。对该方法进行重复性实验,发现变异率均小于1%,重复性好。用已建立的方法对4份粪便临床样品进行3次重复试验,病毒RNA的检出率为100%。结论本实验初步建立了人G1型轮状病毒TaqMan探针荧光实时PCR检测方法,为G1型轮状病毒的诊断、检测和分子流行病学研究提供了一种新的方法。     

细粒棘球绦虫TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

目的 为建立高效、特异的细粒棘球绦虫(Echinococcus granulosus,Eg)检测方法。方法 本研究设计了一组基于Eg线粒体基因的特异性引物和TaqMan探针,通过反应体系及条件的优化,建立了Eg荧光定量PCR检测方法。结果 该方法线性关系好,灵敏度高,在10⁹~10²拷贝/μL相关系数达0.998,灵敏度达10²拷贝/L;在特异性试验中,与其他病原虫株无交叉反应,特异性较好;重复性试验变异系数均低于3%。应用该方法对50份临床样品进行检测,发现6份为Eg感染阳性。结论 由此可见,建立的荧光定量PCR方法可快速、灵敏、特异地检测细粒棘球绦虫,具有一定的实际应用价值。     

猪巨细胞病毒TaqMan荧光定量PCR检测的建立

目的 建立一种特异、灵敏、快速检测猪巨细胞病毒的TaqMan荧光定量PCR方法。方法 根据GenBank已登录的猪巨细胞病毒(Porcine Cytomegalovirus,PCMV)DNA序列设计合成特异性引物对和TaqMan荧光探针,经优化反应条件,建立了猪巨细胞病毒的TaqMan荧光定量PCR检测方法(fluorescent quantitative real-time PCR, FQ-PCR),进行了FQ-PCR检测方法的敏感性、特异性和重复性试验;对疑似PCMV 感染临床样品进行了应用检测,并与常规PCR方法进行了比对;对FQ-PCR检测结果为PCMV 阳性猪的不同内脏器官进行病毒含量比较检测。结果 成功建立了PCMV 的FQ-PCR方法,标准曲线的循环阈值(Ct值)与模板浓度有良好的线性关系,相关系数为0.998;检测灵敏度可达1 拷贝/μL,是常规PCR的100倍;特异性高,对pGEM-T/PCMV重组质粒扩增呈现阳性反应曲线,而对6个对照病原的扩增曲线均呈现阴性反应;对不同浓度的pGEM-T/PCMV重组质粒分别重复扩增6次,重复结果良好;对15份临床疑似PCMV感染的组织病料进行应用检测表明,其中有9份样品为阳性,与常规PCR方法检测的阳性符合率为100%。猪的内脏器管中PCMV含量最高为扁桃体,最低的为小肠。结论 成功建立了PCMV FQ-PCR方法,可用于临床上PCMV感染猪的确诊和隐性感染猪的早期检测,对PCMV的快速诊断、综合防控及净化等具有重要意义。     

嗜血杆菌属CODEHOP PCR检测方法的建立及在树鼩检测中的应用

目的建立树鼩中嗜血杆菌的CODEHOP PCR快速检测方法,为树鼩微生物质量控制提供参考。方法应用CODEHOP在线简并引物设计工具,比对NCBI中6株嗜血杆菌的外膜蛋白序列设计简并引物。通过4株嗜血杆菌标准菌株和24株它属菌株进行特异性和敏感性评价,将建立CODEHOP PCR检测方法,应用于树鼩嗜血杆菌的检测。结果简并引物HF1/HR8和HF3/HR3扩增标准菌株副鸡嗜血杆菌(ATCC 29545)、溶血嗜血杆菌(ATCC 33390)、流感嗜血杆菌(ATCC 33391)、副流感嗜血杆菌(ATCC 33392)的目的片段分别为506 bp~535 bp和344 bp~390 bp,经测序和NCBI Blast比对,结果准确。两对引物组合,能够有效的区分嗜血杆菌属菌株与它属菌株,检测限最低可达2.1 pg/μL。在受试的野生树鼩呼吸道样本中嗜血杆菌阳性率为33.3%(20/60)。结论所建立的方法具有较好的特异性和敏感性,操作简便,能够用于动物样品的嗜血杆菌检测。     

鹦鹉热嗜衣原体实时定量PCR检测方法的建立

目的建立一种简便、快速、特异的荧光定量PCR检测方法,用于鹦鹉热嗜衣原体的快速检测。方法以主要外膜蛋白(MOMP)基因为靶序列设计特异性引物,采用SYBR GreenⅠ随机渗入法建立实时定量PCR检测方法。结果循环阈值(Ct)与标准DNA模板在1.0×102-1.0×107拷贝/μl浓度范围内呈良好的线性关系,相关系数为0.989。该方法用于鹦鹉热嗜衣原体的检测具有很高的特异性,其敏感性与常规PCR相比可以提高100倍。结论本研究建立的检测鹦鹉热嗜衣原体的实时定量PCR检测方法具有很高的特异性和敏感性,可以用于鹦鹉热嗜衣原体的检测。     

空肠弯曲菌实时荧光定量PCR检测方法的研究

目的建立一种快速廉价的检测空肠弯曲菌的实时荧光定量PCR方法。方法根据空肠弯曲菌flaA、gyrA基因设计引物,建立空肠弯曲菌实时荧光定量PCR检测方法。结果以flaA基因引物对空肠弯曲菌DNA进行实时荧光定量PCR,扩增曲线呈S形指数增长,大肠埃希菌等对照菌扩增阴性。方法的灵敏度为10CFU/ml菌悬液。结论建立的空肠弯曲菌荧光定量PCR检测方法具有快速、简便、准确等特点,具有一定的使用价值。     

荧光实时定量PCR定量水体中日本血吸虫尾蚴方法的建立

摘要：目的 建立快速、高效、特异的定量水体中尾蚴的数量和检测水体中日本血吸虫尾蚴残余基因组DNA的方法,来评估水体受日本血吸虫尾蚴污染的程度。方法 根据日本血吸虫基因组DNA中的三个多拷贝序列Sjrh1.0（序列号：U92488.1）、18S小亚基单位核糖体核酸基因(18SrRNA)序列（序列号：AY157226.1）和逆转录转座子SjR2的G55A序列（G55A）（序列号：AF412221.1）,设计常规PCR引物和荧光PCR引物,比较选取较好的靶序列建立SYBR GreenI 实时定量PCR方法,绘制尾蚴数的对数与Ct值的标准曲线,并对疫水中日本血吸虫尾蚴残余的基因组DNA进行检测。结果 尾蚴数的对数与Ct值的标准曲线有良好的线性关系,相关系数r2为0.9186,和重复实验的变异系数小于3%。结论 本方法特异性高,灵敏,可定量水体中尾蚴数,重复性好,对疫水检测有一定的预警作用。     

猪链球菌2型的Real-time PCR定量检测研究

目的 建立了基于TaqMan探针的Real-time PCR方法，实时、定量检测猪链球菌2型。针对GenBank公布的猪链球菌2型的csp2J基因序列设计一对引物和TaqMan探针，建立了Real-time PCR检测方法，制作标准曲线，定量检测猪链球菌2型。通过对6种细菌（9株菌株）的DNA进行扩增。结果所有4株猪链球菌2型均可产生扩增曲线，其他5株非猪链球菌2型均不产生扩增曲线。细菌纯培养物的检测敏感度为6～8CFU／PCR反应体系，相关系数均为0．99（r^2=0．99），整个试验可在1．5h内完成。建立的方法可用于猪链球菌2型的快速、定量检测。