pcDNA3-hBMP2转染对成纤维细胞 生物学性状的影响

目的 探讨人BMP2基因转染对成纤维细胞NIH3T3生物学性状的影响。方法 构建重组真核表达载体pcDNA3-hBMP2,并在脂质体介导下,将其导入NIH3T3成纤维细胞,通过G418筛选获得阳性克隆,用细胞原位杂交和免疫组织化学方法检测hBMP2基因在NIH3T3成纤维细胞内的表达情况;MTT法和FCM检测pcDNA3-hBMP2转染pcDNA3-hBMP2后成纤维细胞超微结构的改变,碱性磷酸酶的检测观察转染pcDNA3-hBMP2后成纤维细胞向成骨细胞分化情况。结果 转染pcvDNA3-hBMP2后的NIH3T3细胞内有大量hBMP2mRNA的转录及其蛋白的表达;转染pcDNA3-hBMP2对成纤维细胞增殖和细胞周期无影响;转染pcDNA3-hBMP2后的成纤维细胞超微结构可见粗面内质网丰富,囊腔扩张明显其内充满中等电子密度的蛋白分泌物;碱性磷酸酶活性显著上升。结论 pcDNA3-hBMP2转染对成纤维细胞NIH3T3增殖和细胞周期无影响。转染后的成纤维细胞不仅可形成BMP2,而且具有向成骨细胞系分化的特性。     

稳定表达人骨形成蛋白-2基因的成纤维细胞体内诱导成骨作用

目的 探讨稳定表达人骨形成蛋白—2(hBMP—2)基因的成纤维细胞是否具有体内诱导成骨能力。方法 构建置组真核表达载体pcDNA3—hBMP—2，在脂质体介导下，将其导入NIH3T3细胞，通过G418馈选获得阳性克随，并继续培养4周，用细胞原位杂交和免疫组织化学方法观察hBMP—2基因在NIH3T3细胞内的稳定表达，并观察了稳定表达hBMP—2的成纤维细胞碱性磷酸酶(ALP)活性的变化，将稳定表达hBMP—2的成纤维细胞植入裸鼠肌袋内观察其体内诱导成骨作用。结果 成功构建重组真核表达载体pcDNA3—hBMP—2，经细胞原位杂交和免疫组织化学证实，转染pcDNA3—hBMP—2后的NIH3T3细胞内有大量hBMP—2mRNA的转录及其蛋白的稳定表达，稳定表达hBMP—2的成纤维细胞ALP活性显著上升，植入裸鼠肌袋内4周有大量软骨形成。结论 稳定表达hBMP—2的成纤维细胞具有体内诱导成骨能力。     

pcDNA3.1(-)-hTGFβ3成纤维细胞稳定表达系统的构建与生长增殖活性研究

目的构建人转化生长因子β3的真核表达载体pcDNA3.1(-)TGFβ3转染NIH3T3成纤维细胞的稳定表达系统,研究转基因TGFβ3对成纤维细胞生长增殖活性的影响。方法通过脂质体介导的转染技术和G418细胞筛选法,将真核表达载体pcDNA3.1(-)TGFβ3质粒导入NIH3T3成纤维细胞,应用RTPCR与Westernblot检测hTGFβ3在真核细胞中的表达。经相差显微镜形态观察及四唑蓝比色实验法(MTT)检测细胞增殖活性。结果在10株转染和经G418反复筛选的NIH3T3成纤维细胞系中,有7株hTGFβ3mRNA及其蛋白的表达明显增强,其余3株细胞相对较弱或者没有表达。TGFβ3转基因稳定表达的NIH3T3成纤维细胞系的生长增殖明显减缓(P<0.05)。结论pcDNA3.1(-)TGFβ3真核表达载体转染NIH3T3成纤维细胞的稳定表达系统构建成功,转基因hTGFβ3在体外培养条件下可抑制成纤维细胞的增殖。     

真核表达载体pcDNA3.1(-)-转化生长因子β3的构建

目的为研究成纤维细胞基因转染的可行性创造条件，从而为转化生长因子（TGF）83转基因治疗创面与病理性瘢痕的研究奠定基础。方法应用基因重组技术和限制性内切酶酶切构建并鉴定pcDNA3．1（-）-hTGFβ3真核表达载体，经脂质体Lipofectamlne^TM 2000介导质粒转染NIH3T3细胞后应用逆转录．聚合酶链反应（RT—PCR）检测hTGFβ3 mRNA在真核细胞中的表达。结果重组真核表达载体pcDNA3，1（-）-hTGFβ3经限制性内切酶BamH Ⅰ、Hind Ⅲ酶切，电泳后显示1253hp的hTGFβ3目的片段和5．40kb的pcDNA3．1（-）载体片段，测序证实酶切片段与GenBank中登记的TGFβ3全长序列相同，证实pcDNA3．1（-）-hTGFβ3真核表达载体构建成功，经RT-PCR检测了hTGFβ3在转录水平mRNA的表达情况，表明质粒转染NIH3T3细胞后hTGFβ3 mRNA的表达明显增强。结论重组真核表达载体构建正确，并能在NIH3T3成纤维细胞中表达hTGFβ3 mRNA，为其在创面与病理性瘢痕的转基因治疗奠定了基础。     

脂质体介导血小板衍化生长因子-B基因转染成纤维细胞的表达

目的用脂质体介导血小板衍化生长因子(PDGF)-B真核表达质粒转染成纤维细胞，使PDGF-B基因在成纤维细胞中特异表达。方法构建PDGF—B真核表达质粒，用脂质体LipofectAMINE介导转染成纤维细胞，G418筛选阳性克隆。逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和细胞爬片免疫组织化学染色检测PDGF-B基因在成纤维细胞中的表达。结果RT—PCR检测结果显示，转染组PDGF-BmRNA的表达量较未转染组明显增加。免疫组织化学染色结果显示转染组成纤维细胞胞浆中有大量棕黄色阳性颗粒。结论脂质体介导PDGF-B基因成功转染成纤维细胞并表达。为PDGF基因治疗奠定基础。     

经VEGF165转染的成纤维细胞-脱细胞异种真皮替代物的构建及其对创面愈合作用的实验研究

目的:构建经血管内皮生长因子(VEGF)165转染的成纤维细胞-脱细胞异种真皮替代物,观察其在促进大鼠深度创面愈合过程中的作用.方法:采用分子生物学方法将扩增的VEGF165基因克隆入真核表达载体pcDNA31(+),在脂质体介导下将重组质粒转染至经传代培养的鼠成纤维细胞(NIH/3T3),再将转染后的NIH/3T3接...     

β-葡萄糖醛酸苷酶基因对人膀胱癌T24细胞的转染及表达

目的：探讨β-葡萄糖醛酸苷酶（βG）基因对人膀胱癌T24细胞的转染及表达的可行性。方法：采用基因工程技术构建带βG基因的真核表达载体，利用脂质体介导法在体外将βG基因导入人膀胱癌T24细胞，利用mRNA打点杂交、原位杂交、免疫组织化学、Western bloting 方法检测βG基因的转录和表达情况。结果：成功克隆出含人βG基因全长的真核表达载体pcDNA3.1-βG，以阳离子脂质体LipofectAMINE为载体将βG基因转染T24细胞后，经400mg/L的G418筛选后可形成抗性克隆；βG基因打点杂交和原位杂交结果显示转基因细胞中有βGmRNA的高表达；免疫组织化学和Western bloting证实转基因细胞中有βG蛋白的强阳性高表达。结论：βG基因可被成功转染入人膀胱癌细胞并能有效表达。     

pcDNA 3.1/RPs15载体构建及对皮肤成纤维细胞作用的实验研究

目的 构建核糖体蛋白s15(RPs15)基因真核表达载体，研究其对小鼠皮肤成纤维细胞的体外作用。方法 将RT-PCR法获得的鼠胚皮肤RPs15cDNA克隆入真核表达载体pcDNA3．1(-)，在FuGENE6介导下转染体外培养的小鼠皮肤成纤维细胞，观察RPs15基因的表达情况及其对成纤维细胞生物学特性的影响。结果 构建的重组表达载体pcDNA3．1／RPs15经DNA测序证实序列正确。RT-PCR法检测RPs15基因在转染的成纤维细胞中获得表达，细胞生长密度下降，形态发生变化。结论 成功构建了真核表达载体pcDNA3．1／RPs15，并可在体外培养的小鼠皮肤成纤维细胞中表达，为深入研究RPs15基因对皮肤成纤维细胞的作用奠定了基础。     

人骨形态发生蛋白—2真核表达载体的构建

目的 构建人骨形态发生蛋白－2（hBMP-2）真核表达载体,并观察其在真核细胞内表达的可能性。方法 Sal Ⅰ和Xba Ⅰ双酶切含有hBMP－2全长cDNA的pUC19,回收1.24kb片段,将其连入真核表达载体pcDNA3,构建重组子pcDNA3-hBMP-2。将重组子转化细菌,扩增后提取质粒,分别用Ecor Ⅰ和Xba Ⅰ双酶切和Xho Ⅰ单酶切后琼脂糖凝胶电泳鉴定。将重组子转染成纤维细胞,G418筛选形成阳性克隆后继续培养4周行细胞原位杂交和免疫组织化学染色。结果 琼脂糖电泳显示：用EcoR Ⅰ和Xba Ⅰ双酶切后可形成两条带,大小分别为1.3kb和5.38kb,而Xbo Ⅰ酶切位点消失,符合物理图谱,表明载体构建成功,转染后G418筛选所获阳性克隆,继续培养4周,的位杂交和免疫组织化学染色,结果表明hBMP-1基因在mRNA水平和蛋白水平均有表达。结论 成功构建hBMP-2真核表达载体,该载体可在真核细胞内表达,为将来骨损伤的基因治疗奠定了一定的实验基础。     

RECK基因真核表达载体的构建及在HepG2细胞中的表达

目的构建RECK(reversion-induc ing-cyste ine-rich prote in w ith Kazal motifs)基因的真核表达载体,通过脂质体介导法转染人肝癌细胞株HepG2并获得高表达RECK蛋白的细胞克隆。方法用RT-PCR方法扩增出人RECK基因,构建真核表达载体pcDNA3-RECK,采用脂质体介导法将重组质粒导入体外培养的HepG2细胞,RT-PCR和W estern b lot检测转染细胞和未转染细胞中RECK基因mRNA及蛋白质的表达。结果本实验成功构建了真核表达载体pcDNA3-RECK,并用脂质体介导的方法获得了高稳定表达RECK的细胞克隆;W estern b lot显示转染前的细胞未检测到RECK基因mRNA及蛋白质表达,但转染后表达量明显增高。结论重组质粒pcDNA3-RECK经转染能在HepG2细胞中高效表达,为进一步研究RECK对肝癌细胞的生物学影响奠定了基础。     

可调控表达人骨形态发生蛋白2基因的腺病毒载体系统的构建

目的构建可调控人骨形态发生蛋白2（hBMP2）基因表达的重组腺病毒载体系统,为骨缺损的修复提供新思路。方法基因测序验证pcDNA3．1－hBMP2质粒的准确性,将酶切得到的hBMP2基因片段亚克隆到穿梭载体质粒pTRE—Shuttle2的多克隆位点,将pTRE—Shuttle2-hBMP2线性化并连接至腺病毒骨架质粒Adeno—XSystem 1 Viral DNA上,构建重组的Adeno—X－pTRE—hBMP2载体;用PacI酶将其线性化后脂质体法（Lipofectamine 2000）转染HEK293细胞,获得有感染能力的重组腺病毒颗粒,收集病毒上清进行hBMP2基因PCR鉴定;将包含rtTA激活因子的Adeno—X Tet—Onvirus Stock感染HEK293细胞包装扩增病毒。结果hBMP2基因被成功定向克隆到腺病毒骨架质粒Adeno—X System 1 Viral DNA上,转染HEK293细胞后获得有感染能力的重组腺病毒颗粒。结论本研究成功构建了hBMP2基因的腺病毒Tet—On表达系统,为实现hBMP2基因在靶细胞水平上的调控表达提供前期实验基础。     

PcDNA3-hBMP3基因转染关节软骨细胞及其稳定表达

目的 探讨外源性基因ｈＢＭＰ３在软骨细胞获得稳定表达的可能性。方法 将和ＢＭＰ３的ｃＤＮＡ构建于真核表达载体ＰｃＤＮＡ３,形成重组真核表达载体ＰｃＤＮＡ３－ｈＢＭＰ３,转染培养状态下兔关节软骨细胞。利用重组ＤＮＡ和基因克隆技术构建重组真核表达载体ＰｃＤＮＡ３－ｈＢＭＰ３;利用细胞２和细胞基因转染技术体外转染ｈＢＭＰ３基因至关节软骨细胞;     

人骨形成蛋白7基因重组2型腺相关病毒载体的构建及其在骨髓间充质干细胞中的表达

目的构建人骨形成蛋白7基因（hBMP7）重组腺相关病毒载体,并观察其在兔骨髓间充质干细胞中的表达。方法将骨形成蛋白7基因片段克隆入穿梭质粒pUC18获得重组质粒pUC18-hBMP7。KpnⅠ和鼠Ⅱ双酶切质粒pUC18-hBMP7／与pSNAV,用T4DNA连接酶连接分别回收的两片段后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,获得重组质粒PSNAV—hBMP7／,转染BHK-21细胞,筛选培养,用能表达Rap和Cap的重组Ⅰ型单纯疱疹病毒HSVl-rc／△UL2感染此细胞,裂解细胞收获病毒液。采用氯仿处理-PEG／NaCl沉淀-氯仿抽提法分离浓缩、纯化与测定病毒滴度。用rAAV2-hBMP7／和rAAV2-EGFP在体外分别转染兔骨髓间充质干细胞。流式细胞仪、RT-PCR和Western—blot方法检测兔骨髓间充质干细胞中hBMP-7基因的转录和表达。结果成功构建具有感染活性的重组腺相关病毒载体rAAV2-hBMP7／,病毒载体对兔骨髓间充质干细胞早期转染效率可达99．8％,hBMP7／在兔骨髓间充质干细胞中可得到转录和表达。结论成功构建了人骨形成蛋白7基因重组腺相关病毒载体,rAAV2-hBMP7／载体在体外可转染兔骨髓间充质干细胞,并获得较高的转染效率。     

重组pcDNA3.1-hBMP-2转染人骨髓基质干细胞和对其增殖及血管内皮生长因子表达的影响

目的构建人骨形成蛋白-2(hBMP-2)真核表达载体pcDNA3.1-hBMP-2,转染人骨髓基质干细胞(MSCs),探讨基因转染对其增殖和血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响. 方法利用重组DNA和基因克隆技术构建重组载体pcDNA3.1-hBMP-2;细胞培养和基因转染技术体外转染人MSCs;免疫细胞化学、原位杂交和蛋白印迹法检测细胞BMP-2的表达;通过流式细胞仪和VEGF探针原位杂交分析其对细胞增殖和VEGF表达的影响. 结果转染后细胞在mRNA水平和蛋白质水平均表达BMP-2;转染后S期细胞比例增多,提示细胞DNA的合成增加;BMP-2基因转染上调细胞VEGF的表达. 结论在脂质体介导下,pcDNA3.1-hBMP-2转染MSCs获得成功.基因转染后能促进细胞增殖并将通过使VEGF的表达增加促进血管再生,为进一步骨缺损的基因治疗及构建组织工程骨奠定了实验基础.     

pcDNA3-hBMP2转染兔骨髓基质细胞前后生长特性的研究

目的 观察pcDNA3-hBMP2转染兔骨髓基质细胞前后的生长特性变化,为骨组织工程的种子细胞选择打下基础.方法 抽取成年雄性新西兰大白兔髂骨骨髓,密度梯度离心获得骨髓基质细胞,培养传至第5代,按处理方法分为常规培养液组(A组),pcDNA3-hBMP2转染组(B组).观察原代MSC及第5代的细胞形态等生长特性并与转染组进行比较.结果 原代MSCs为短梭形,簇形生长,传代细胞呈长梭形,旋涡形生长.转染组细胞72 h后表达BMP2,瞬问表达为100%.转染细胞未经筛选培养4周细胞形态发生较明显地变化,细胞生长周期改变.结论 pcDNA3-hBMP2成功转染兔骨髓基质细胞并改变其生物学特性.     

骨形成蛋白-2基因在人骨髓基质细胞中的表达及对其成骨分化的作用

目的利用构建的人骨形成蛋白-2(BMP2)真核表达载体pcDNA3／BMP2，检测其转染人骨髓基质细胞后的表达及对其成骨分化的影响。方法酶切鉴定构建的真核表达载体pcDNA3／BMP2，利用脂质体介导的转染技术，将所构建的载体导入骨髓基质细胞中，体外单层培养。分别于转染后48h和4周采用原位杂交、免疫组化和碱性磷酸酶、钙化学染色方法检测BMP2的基因蛋白表达以及对骨髓基质细胞成骨分化的影响。结果pcDNA3／BMP2酶切片段的大小与理论相符。转染后细胞能检测到BMP2基因和BMP2蛋白表达，并促进成骨转化。结论pcDNA3／BMP2转染骨髓基质干细胞中可获得短暂和长期表达，并加强骨髓基质细胞的成骨分化能力。