微小牛蜱Bm86基因的克隆与原核表达

根据已发表的Bm86基因序列,设计表达型引物,利用RT-PCR技术,从微小牛蜱饥饿幼蜱的研磨物中扩增Bm86基因,将PCR产物连入pGEM-T Easy载体,构建重组克隆载体pGEM-T easy-Bm86.测序分析表明:克隆的微小牛蜱Bm86基因序列与GenBank上登录的Bm86基因的核苷酸和氨基酸序列的同源性分别为97%和95.6%.然后对重组克隆载体pGEM-T easy-Bm86进行双酶切,获得带有粘性末端的Bm86基因片段,并将此片段定向亚克隆入原核表达载体pGEX-4T-1,构建重组原核表达载体pGEX-4T-1-Bm86,将其转化到BL21宿主菌中,用IPTG进行诱导表达.SDS-PAGE检测表明表达产物为分子量为88 Ku的融合蛋白,目的蛋白约占蛋白总量的39%,表达量约为1.08 mg/mL.Western blot分析表明此表达产物能被兔抗微小牛蜱阳性血清所识别.     

新疆南疆微小牛蜱Bm86/Bm91双基因原核表达载体的构建

为构建微小牛蜱Bm86和Bm91双基因原核表达载体,以新疆生产建设兵团塔里木畜牧科技重点实验室获得的Bm86和Bm91克隆基因阳性菌或质粒DNA为模板,参照GenBank登录的微小牛蜱Bm86和Bm91基因序列和所用载体序列,设计可以扩增Bm86和Bm91基因完整阅读框架的引物,然后对新疆南疆微小牛蜱Bm86和Bm91基因进行PCR扩增、纯化、酶切后连接,构建双基因重组质粒pET-32a-Bm并鉴定。结果显示,成功构建Bm86和Bm91双基因重组质粒pET-32a-Bm,经测序鉴定和初始获得的Bm86和Bm91基因序列一致,未发生变异。     

微小牛蜱Bm91基因的克隆及其真核表达载体的构建

参照GenBank中收录的微小牛蜱Bm91基因的核苷酸序列,设计了1对特异性引物,从我国微小牛蜱半饱血雌性成蜱肠道和唾液腺研磨物中提取总RNA,利用M-MLV RTase cDNA Synthesis Kit合成双链cDNA,并采用PCR技术扩增获得的Bm91基因,将其克隆到pGEM-T Easy载体中并进行PCR、酶切和测序分析鉴定.结果表明:所克隆的Bm91基因序列与GenBank上收录的Bm91基因序列的同源性达97.1%,而且该片段含有完整的开放阅读框;将该基因从克隆载体上用EcoRⅠ单酶切消化并亚克隆到巴斯德毕赤酵母分泌型表达载体pP1C9K的EcoRⅠ酶切位点,再次进行PCR、酶切和测序分析鉴定,结果表明成功构建并获得了微小牛蜱Bm91基因的重组真核表达载体pP1C9K-Bm91.     

福建省微小牛蜱的生物学特性

福州地区的微小牛蜱Boophilus microplus在牛体表终年均有寄生,以7、8、9、3个月为寄生高峰期。经人工饲养观察,每年发生4代。第一代需要63—88天,第二代42—56天,第三代44—62天,第四代90—152天。以第四代未吸血幼蜱或第三代未吸血幼蜱越冬。未吸血幼蜱最长能存活227天。雌蜱一生共产卵1589～4138粒(平均2986.3粒),产完卵后约0～14天死亡。饱血雄蜱一般存活不超过1个月。饱血雌蜱的体重与产卵量和产卵期呈相关[Y(产卵量)=00.945,P<0.01;r(产卵期)=0.490,p<0.05]。     

新疆南疆地区牛羊寄生蜱类调查研究

为了明确新疆南疆牛羊寄生蜱类,有效防制本地区蜱及蜱传病。2013年4~8月期间,采集新疆南疆牛羊寄生蜱样,利用传统分类鉴定方法进行蜱类调查研究。结果表明:共采获蜱1 584只,隶属硬蜱科8个属和软蜱科2个属,以扇头蜱属(Rhipicephalus)和璃眼蜱属(Hyalomma)为羊蜱优势属类,分别占羊总蜱数的57.8%、19.80%;璃眼蜱属(Hyalomma)、扇头蜱属(Rhipicephalus)和血蜱属(Haemaphysalis)为牛蜱优势属类,分别占牛总蜱数的34.18%、30.36%、22.96%。本次调查结果和前人研究结果略有差异。     

新疆南疆微小牛蜱Bm91基因的克隆及鉴定

试验参照GenBank登录的微小牛蜱Bm91基因序列,设计了可以扩增Bm91基因完整阅读框的引物,对新疆南疆微小牛蜱进行总RNA提取、RT-PCR、克隆、测序和序列分析。结果表明:获得的Bm91基因长1 833 bp,与GenBank中登录号为U62809和HM622263的微小牛蜱Bm91基因核苷酸同源性为98%和97%,且为一个完整的开放阅读框。新疆南疆微小牛蜱Bm91基因的正确获得,为基因工程疫苗候选抗原的获得和中国抗微小牛蜱疫苗的制备奠定基础。     

溴氰菊酯对微小牛蜱的毒力测定和杀灭试验

溴氰菊酯对微小牛蜱未吸血幼蜱的半致死浓度（ＬＣ５０）为０．３６×１０＾－６，对未吸血成蜱的半致死量（ＬＤ５０）为４．６８７μｇ／虫，对饱血雌蜱的ＬＤ５０为６．８６８μｇ／虫，可见，溴氰菊酯对微小牛蜱未吸血幼蜱，未吸血成蜱及饱血雌蜱的杀蜱效果分别为敌百虫的４８６、２３８和７６７倍。现场杀蜱试验，采用５％溴氰菊酯水和剂１２．５×１０＾－６时，杀蜱率达９２％，３０×１０＾－６时达１００％杀蜱效果，对牛无     

溴氰菊酯对微小牛蜱的毒力测定和杀灭试验

溴氰菊酯对微小牛蜱未吸血幼蜱的半致死浓度（ＬＣ５０）为０．３６×１０－６，对未吸血成蜱的半致死量（ＬＤ５０）为４．６８７μｇ／虫，对饱血雌蜱的ＬＤ５０为６．８６８μｇ／虫；而敌百虫对未吸血幼蜱的ＬＣ５０为１７５×１０－４，对未吸血成蜱和饱血雌蜱的ＬＤ５０分别为１１１６和５２６６μｇ／虫．可见，溴氰菊酯对微小牛蜱未吸血幼蜱、未吸血成蜱及饱血雌蜱的杀蜱效果分别为敌百虫的４８６、２３８和７６７倍．现场杀蜱试验，采用５％溴氰菊酯水和剂１２．５×１０－４时．杀蜱率达９２％，３０×１０－６时达１００％杀蜱效果，对牛无副作用。     

边缘革蜱Dm 86基因表达及免疫原性分析

【目的】 研究Bm86同系物Dm86基因及其编码蛋白,为抗边缘革蜱疫苗候选抗原提供基础。【方法】 以边缘革蜱饱血雌蜱cDNA为模板扩增克隆Dm86基因,分析生物学特性及生活史各阶段表达水平,截短基因构建重组质粒,经IPTG诱导后SDS-PAGE鉴定,纯化蛋白,制备多克隆抗体进行Western Blotting 鉴定。【结果】 PCR扩增获得了1 773 bp目的片段,Dm86蛋白由591个氨基酸组成,分子量为64 857.81,理论等电点为6.78,酸性,具有不稳定性、亲水性和多个B细胞抗原表位;Dm86基因在边缘革蜱不同阶段均有不同程度的表达,饱血蜱阶段的表达量较高;重组蛋白大小为39kDa,以包涵体形式表达;抗体效价可达1∶25 600,能够识别重组蛋白。【结论】 Dm86重组蛋白具有一定的反应原性和免疫原性。     

新疆南疆部分地区3种璃眼蜱的分子生物学鉴定

旨在对新疆南疆部分地区璃眼蜱属的蜱进行分子生物学鉴定,了解其分布情况。采集新疆南疆部分地区蜱,通过形态学鉴定将璃眼蜱属蜱作为样本,通过12SrDNA和16SrDNA基因扩增、测序及序列分析进行蜱种类鉴定。13个采样点共559只璃眼蜱属蜱,鉴定为3种,分别为小亚璃眼蜱、亚洲璃眼蜱和残缘璃眼蜱。     

新疆南疆地区牛乳头瘤病毒1型L1基因克隆及原核表达

本研究以构建牛乳头瘤病毒1型L1基因原核表达系统pET32a-L1及表达牛乳头瘤病毒1型L1蛋白为目的,为进一步制备基因工程疫苗奠定基础.从牛体表赘生瘤组织中提取DNA,PCR扩增L1基因片段,克隆至pGM-T载体.测序成功后将目的片段和表达载体经双酶切连接于表达载体pET32a中,并构建重组质粒pET32a-L1.重...     

微小牛蜱饱血雌蜱高毒力绿僵菌菌株的筛选及应用

为筛选微小牛蜱的高毒力菌株,采用浸渍法测定了8株绿僵菌对微小牛蜱饱血雌蜱的存活指数.结果显示,菌株MaAT.4对微小牛蜱饱血雌蜱的毒力最强,其孢子悬浮液推荐杀蜱浓度为1×10~8个·mL~(-1).     

新疆南疆猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因克隆与序列分析

[目的]掌握新疆南疆PRRSV流行毒株特点,为新疆南疆PRRS的有效预防和控制提供理论依据.[方法]研究利用克隆和测序获得了8个新疆南疆PRRSV ORF5基因全序列,并进行序列分析.[结果]8个新疆南疆PRRSV ORF5基因长度均为603 bp,它们之间核苷酸同源性为87.4; ～ 100.0;;与欧洲型代表株LV、美洲型代表株ATCC VR-2332、中国代表株CH-1a和中国HP-PRRS代表株JXA1核苷酸同源性分别为60.9;～63.5;、88.4;～ 89.9;、88.9; ～ 94.7;和87.4;～98.7;;与中国猪养殖场常用的几种弱毒疫苗株核苷酸同源性为87.4;～94.7;;与美洲型毒株和欧洲型毒株氨基酸同源性为84.5;～98.0;和50.0;～59.5;.[结论]研究的8株新疆南疆PRRSV株均属于美洲型亚群Ⅱ毒株.利用新疆南疆PRRSV分子流行病学调查结论,可为新疆南疆PRRS防制疫苗的选择等做迸一步的调整或指导奠定基础.     

中国七省(区)牛蜱的种类鉴定及其携带无形体的分子检测

为了确定牛体表寄生硬蜱的种类及其携带无形体的状况,从河南、湖南、海南、四川、贵州、广东和广西采集牛体表寄生硬蜱572只,通过形态学和分子生物学方法对硬蜱进行种类鉴定;同时用PCR方法检测硬蜱体中无形体感染情况。经形态学和分子生物学鉴定,结果 572只牛硬蜱均为微小扇头蜱,且存在A、B、C等3个分支。基于无形体的16S rRNA基因序列分析的结果表明,微小扇头蜱携带无形体,其阳性率为38.8%(222/572),其中边缘无形体、山羊无形体、扁平无形体和嗜吞噬细胞无形体分别为23.6%(135/572)、7.3%(15/572)、5.3%(42/572)、2.6%(30/572),仅在湖南的牛蜱中发现存在无形体混合感染情况。微小扇头蜱C分支的发现尚属首次,且以边缘无形体感染率最高。     

河南省部分地区硬蜱种类鉴定及无形体携带情况调查

在河南省部分地区30个采样点采集寄生于绵羊、山羊、牛、犬、刺猬体表的蜱355只,扩增其16S rDNA和ITS-2基因序列,根据序列比对结果,结合形态学鉴定,显示共有长角血蜱83份、微小牛蜱16份、褐黄血蜱6份.利用巢式PCR方法扩增蜱体内4种无形体(嗜吞噬细胞无形体、绵羊无形体、边缘无形体和牛无形体)的16S rRN...     

新疆南疆猪繁殖与呼吸综合征病毒毒株分型鉴定

了解新疆南疆PRRSV毒株类型,为新疆南疆PRRS防制疫苗的选择和防制措施的制定提供理论依据。本实验利用可同时扩增PRRSV欧洲型和美洲型毒株的ORF7基因特异性引物,进行RT-PCR、克隆、测序及序列分析。结果显示:本研究获得的14个ORF7基因片段不存在类似欧洲型代表株LV的9个核苷酸缺失,进化树显示均与国内外的美洲型代表株在同一分支内,其中XJNJ-5-2和XJNJ-5-3株与高致病性代表株JXA1在同一个小的分支内。结论为本实验未检测到欧洲型毒株,获得了14个美洲型毒株,其中有2株属于高致病性毒株。利用新疆南疆PRRSV分子流行病学调查结果,对新疆南疆PRRS的防制具有现实意义。     

水稻温敏雄性不育突变体mh86s的鉴定及基因克隆

光/温敏核雄性不育基因在水稻杂种优势利用中发挥着重要作用。发掘光/温敏核雄性不育突变体及其基因有助于更好地了解水稻中光/温敏核雄性不育的机制并丰富遗传资源。本研究在籼稻材料明恢86的转基因后代中鉴定了1个雄性不育突变体,该突变体在正常生长季表现为雄性不育,花药较野生型小,淡白色,镜检无花粉,孕穗期低温处理后育性恢复,为1个温敏雄性不育突变体,命名为mh86s。利用突变体mh86s分别和其野生亲本明恢86及籼稻材料93-11杂交,构建F2遗传群体,遗传分析表明雄性不育性状由1对隐性核基因控制。采用图位克隆技术将该温敏雄性不育基因定位在第2染色体分子标记Indel7.38和SNP3之间49.8kb的物理区间内。在该定位区间内包含已克隆的温敏雄性不育基因tms5。测序结果表明,突变体mh86s中tms5基因和野生型相比,第2外显子1个碱基发生了替换(G-T),导致推测的161位氨基酸由甘氨酸变为缬氨酸。利用突变体mh86s和携带tms5基因的温敏不育系HD9802S杂交,F1表现为温敏雄性不育。据此推断突变体mh86s中的温敏雄性不育基因为tms5的新等位基因,命名为tms5-mh86。研究...     

新疆南疆羊蜱蝇基于12S rDNA,16S rDNA和18S rDNA基因的分子生物学鉴定

旨在建立羊蜱蝇的分子生物学鉴定方法,从新疆南疆库车县的绵羊体表采集样品,形态学鉴定初步确定为羊蜱蝇,随后进行羊蜱蝇12SrDNA、16SrDNA和18SrDNA基因的扩增和测序,将所得序列进行Blast在线分析和MEGA 5.0分析。结果表明,12SrDNA序列与云南2016年提交的相似性为100%,16S rDNA序列与丹麦2007年、捷克2017年和新疆2017年提交的相似性均为99%,18SrDNA序列与新疆2016年提交的相似性为99%。羊蜱蝇16SrDNA和18SrDNA序列均能与GenBank数据库中已知羊蜱蝇基因序列聚类,且羊蜱蝇种内K2P遗传距离为0～2.3%,通过12SrDNA、16SrDNA和18SrDNA基因的扩增和测序可准确鉴定羊蜱蝇。     

黑龙江地区流行犬瘟热病毒H基因克隆及序列分析

对临床上流行的犬瘟热病毒CDV(ZH-10株)的H基因进行克隆和序列分析。结果显示:H基因全长约为1824bp;CDV ZH-10株与国外的Convac和Onderstepoort疫苗株亲缘关系较远,核苷酸同源性分别为91.3%、91.4%;ZH-10株与国内近期大部分分离株属于野毒株谱系,在基因型上归属Asia-1型。研究揭示了CDV基因型的地域性差异是近年来我国CD流行的一个主要原因,为将来研制出更加有效的CD疫苗奠定了基础。