新蒲饮联合质子泵抑制剂对幽门螺杆菌感染相关性胃炎中TLR-2/MyD88/NF-κB信号通路的影响＊

目的 建立幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，HP)相关性胃炎小鼠模型,探讨新蒲饮与奥美拉唑联用对幽门螺杆菌的根除效果以及对Toll样受体2 （Toll-liκe receptor-2，TLR-2）/髓样分化因子88 （Myeloid differentiation factor 88，MyD88）/核转录因子κappaB（Nuclear Factor κappa B，NF-κB）信号通路和下游的炎症因子肿瘤坏死因子-α (Tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白介素1β （Interleuκin-1β，IL-1β）的干预机制。方法 50只6-8周龄SPF级C57BL/6小鼠（雌雄各半）为研究对象,按随机数字表法标记并按不同性别分笼造模。共分为5组:对照组（正常组、模型组）、新蒲饮组、新蒲饮加奥美拉唑(PPI)组、西药三联组（阿莫西林 + 克拉霉素 + 奥美拉唑）。模型组、新蒲饮组、新蒲饮加PPI组、西药三联组进行HP相关性胃炎造模:适应性饲养1周之后接种幽门螺杆菌菌液，灌胃3次（隔日一次）。定植4周后随机从各组中抽取1只雄鼠和1只雌鼠，用快速尿素酶法以及Giemsa染色法检验造模是否成功。第42天给药组予相应浓度药物灌胃，对照组给予生理盐水灌胃，2次/日,连续2周。灌胃结束4周以后处死所有小鼠。用快速尿素酶法以及Giemsa染色法检测HP根除率，并在光镜下观察HE染色胃黏膜炎症情况；应用免疫组化技术检测胃组织中TLR-2、MyD88、NF-κB的蛋白含量表达；Western-Blot技术检测胃组织中TLR-2、MyD88、NF-κB、IκB激酶-α (IκK-α)、磷酸化IκB-α (p-IκB-α)蛋白含量表达；qPCR技术检测胃组织中TLR-2、MyD88、NF-κB的mRNA表达水平；最后应用酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清中TNF-α、IL-1β的表达变化。结果 与正常组比较,模型组小鼠幽门螺杆菌根除率降低，胃黏膜组织炎症情况严重，蛋白表达TLR2、MyD88、NF-κB、IκK-α、p-IκB-α以及基因表达TLR2、MyD88、NF-κB和下游炎症因子TNF-α、IL-1β含量升高(P < 0.05);与模型组比较,新蒲饮组、新蒲饮加PPI组及西药三联组的幽门螺杆菌根除率升高，胃粘膜组织炎症情况改善,TLR2、MyD88、NF-κB、IκK-α、p-IκB-α以及下游炎症因子TNF-α、IL-1β含量降低(P < 0.05)；与新蒲饮组相比，新蒲饮 + PPI组、西药三联组的幽门螺杆菌根除率升高，但差异无统计学意义；胃黏膜组织炎症改善，TLR2、MyD88、NF-κB、IκK-α、p-IκB-α以及下游炎症因子TNF-α、IL-1β含量降低(P < 0.05)；新蒲饮加PPI组与西药三联组幽门螺杆菌根除率差异无统计学意义，胃黏膜组织炎症情况大致相同，TLR2、MyD88、NF-κB、IκK-α、p-IκB-α以及下游炎症因子TNF-α、IL-1β含量(P > 0.05)变化差异无统计学意义。结论 1、HP相关性胃炎发生的机制可能与TLR-2/MyD88/NF-κB信号通路的激活及下游炎症因子TNF-α、IL-1β释放相关;2、新蒲饮具有杀幽功效，与PPI合用杀幽效果更佳，堪比西药三联，初步猜测可能与PPI抑酸功能有关。3、新蒲饮以及新蒲饮加PPI可能通过抑制TLR-2/MyD88/NF-κB信号通路的激活及TNF-α、IL-1β的释放而发挥其抗炎作用，而新蒲饮联合PPI效果更加显著。     

黄芩-黄连抗神经炎症的配伍优势及其调控TLR4/MyD88/NF-κB信号通路的潜在靶点

目的 探索黄芩-黄连防治神经炎症的配伍优势,并基于Toll样受体4（TLR4）/髓样分化因子88（MyD88）/核转录因子-κB（NF-κB）通路,阐明黄芩-黄连配伍优势的作用特点及机制。方法 选取体外具有代表性的小鼠小胶质细胞（BV2）,将BV2分为8组,分别为正常组、模型组、黄芩-黄连组、吡拉西坦组、黄芩组、黄连组;利用细菌脂多糖（LPS）建立BV2细胞炎症模型,通过细胞增殖活性检测（CCK-8）试剂盒检测细胞活性;明场下观察细胞形态;酶联免疫吸附测定法（ELISA）、免疫荧光法测定药物对BV2细胞促炎因子产生及释放的影响;实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-time PCR）检测TLR4、MyD88、NF-κB mRNA表达;细胞免疫荧光检测NF-κB p65核转位情况;通过TLR4信号转导抑制剂CLI-095、NF-κB阻断剂PDTC进行黄芩-黄连抗神经炎症作用靶点的确认。结果 与正常组比较,LPS诱导的模型组细胞大多处于激活状态,培养液及细胞内的IL-6、TNF-α、IL-1β含量显著升高（P<0.01）,TLR4、MyD88、NF-κB p50及NF-κB p65的mRNA表达显著升高（P<0.01）,NF-κB p65的入核现象明显;与模型组比较,黄芩-黄连、吡拉西坦组预处理后,BV2细胞形态大部分恢复,IL-6、TNF-α、IL-1β水平均显著降低（P<0.01）,TLR4、MyD88、NF-κB p50及NF-κB p65 mRNA表达明显降低（P<0.05,P<0.01）,NF-κB p65大多存在于细胞质中;黄芩组、黄连组与模型组比较,细胞形态略有恢复,促炎因子水平及TLR4、MyD88、NF-κB p50、NF-κB p65 mRNA表达量有所降低;与黄芩-黄连组比较,黄芩组、黄连组的促炎因子抑制作用效果显著低于药对组;与模型组比较,应用信号通路特异抑制剂“黄芩-黄连+CLI-095”组、“黄芩-黄连+PDTC”组,能够明显降低TLR4、MyD88、NF-κB p50及NF-κB p65的mRNA表达（P<0.05,P<0.01）,并明显抑制NF-κB p65转入细胞核内。结论 黄芩与黄连相须配伍后的抗神经炎症作用明显优于单味黄芩或黄连;该药对的抗神经炎症优势与抑制小胶质细胞中的TLR4/MyD88/NF-κB信号通路激活密切相关;通过验证说明TLR4、MyD88、NF-κB为黄芩-黄连发挥药对配伍优势的潜在靶点。     

痰瘀同治调控TLR4/NF-κB/IκB通路对糖尿病大鼠心肌炎症反应的影响

目的 观察痰瘀同治对糖尿病大鼠心肌Toll样受体4（TLR4）/核转录因子-κB（NF-κB）/核转录因子-κB抑制蛋白（IκB）信号通路的干预作用,探讨其改善糖尿病大鼠心肌炎症病变的相关机制。方法 选取清洁级雄性SD大鼠45只,随机分为正常组、化痰组、化瘀组、痰瘀同治组、阿拉氯胺组、模型组。除正常组外,其余各大鼠单次腹腔注射链脲佐菌素（STZ）55 mg·kg^-1建立糖尿病模型,正常喂养3周后,化痰组、化瘀组、痰瘀同治组每日分别给予小陷胸汤（4.05 g·kg^-1）,血府逐瘀汤（7.02 g·kg^-1）,抵当陷胸汤（8.10 g·kg^-1）灌胃,阿拉氯胺组每日予阿拉氯胺（3 mg·kg^-1）灌胃,连续给药8周后麻醉取材。采用酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测心肌组织TLR4蛋白及肿瘤坏死因子-α（TNF-α）表达水平;免疫组化法检测NF-κB p65和NF-κB抑制蛋白α（IκBα）表达水平;实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-time PCR）检测大鼠心肌TLR4,NF-κB p65,IκBα及TNF-α的mRNA表达水平。结果 与正常组比较,模型组TLR4,NF-κB p65,IκBα及TNF-α蛋白和mRNA表达水平显著升高（P<0.01）;与模型组比较,各用药组TLR4,NF-κB p65,IκBα及TNF-α蛋白和mRNA表达水平均有不同程度下降（P<0.01）;组间比较发现,痰瘀同治组TLR4,NF-κB p65,IκBα及TNF-α蛋白和mRNA表达水平比化瘀组和化痰组下降更明显（P<0.05,P<0.01）。结论 痰瘀同治法能够改善糖尿病大鼠心肌炎症病变,且效果优于单独使用化痰法或化瘀法,其机制可能与抑制TLR4/NF-κB/IκB信号通路的激活有关。     

补肾化痰方对OVX诱导的骨质疏松大鼠血清LPS及TLR4/MyD88/NF-κB信号通路的影响

目的 研究补肾化痰方对双侧卵巢切除术（OVX）诱导的骨质疏松大鼠脂多糖（LPS）及Toll样受体4（TLR4）/髓样细胞分化蛋白88（MyD88）/核转录因子-κB（NF-κB）信号通路的影响。方法 将60只SPF级6月龄的雌性大鼠随机分为假手术组,模型组,戊酸雌二醇组,补肾化痰方低、中、高剂量组,使用双侧OVX造模,造模后1周,每组中挑选8只,戊酸雌二醇组按0.184 mg·kg^-1,补肾化痰方低、中、高剂量组分别按4.7,9.4,18.8 g·kg^-1灌胃,假手术与模型组给予0.9%生理盐水4 mL灌胃,干预12周后处死取材。运用酶联免疫吸附测定（ELISA）法检测血清LPS含量,蛋白免疫印迹法（Western blot）检测骨组织中TLR4,MyD88,磷酸化（p）-NF-κB p65的蛋白表达,实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-time PCR）检测骨组织中TLR4,MyD88,NF-κB p65 mRNA水平及通路相关炎症因子白细胞介素（IL）-1β,IL-6 mRNA的表达。结果 与假手术组比较,模型组的血清LPS水平,骨组织中TLR4,MyD88,p-NF-κB p65蛋白表达水平,TLR4,MyD88,NF-κB p65,IL-1β,IL-6 mRNA水平均明显升高（P<0.05）;与模型组比较,戊酸雌二醇组和补肾化痰方高剂量组血清LPS水平,骨组织中TLR4,MyD88,p-NF-κB p65的蛋白表达,TLR4,MyD88,NF-κB p65 mRNA水平,以及下游炎症因子IL-1β,IL-6 mRNA水平有不同程度降低（P<0.05）。结论 补肾化痰方可以降低血清LPS含量,调控TLR4/MyD88/NF-κB通路中TLR4,MyD88,NF-κB p65,p-NF-κB p65的mRNA水平及蛋白表达,降低骨组织中IL-1β,IL-6 mRNA水平,改善骨微结构,抑制绝经后骨质疏松症的病情发展。     

竹节参总皂苷通过NF-κB通路对LPS致RAW264.7细胞炎症的保护作用研究

目的： 探讨竹节参总皂苷对脂多糖（LPS）刺激的RAW264.7巨噬细胞的抗炎作用。方法：噻唑蓝（MTT）法检测不同浓度的竹节参总皂苷对RAW264.7细胞活性的影响;一氧化氮（NO）试剂盒法检测竹节参总皂苷对LPS刺激RAW264.7细胞的NO释放量;酶联免疫吸附法（ELISA）检测肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白介素1-β（IL-1β）分泌;逆转录聚合酶链反应法（RT-PCR）检测诱导型一氧化氮合酶（iNOS）,TNF-α,IL-1β mRNA的表达;免疫印迹法（Western blot）检测胞核内核转录因子-κB p65（NF-κB p65）蛋白表达。结果：竹节参总皂苷的安全用药范围为≤80 mg·L^-1;与LPS模型组相比,竹节参总皂苷各剂量组（0.1,1,10,40 mg·L^-1）均能显著降低LPS刺激下RAW264.7细胞NO,TNF-α和IL-1β分泌;竹节参总皂苷各剂量组（10,40 mg·L^-1）均能抑制iNOS,TNF-α,IL-1β mRNA表达和NF-κB p65蛋白表达。结论：初步证实了竹节参总皂苷对LPS致RAW264.7巨噬细胞炎症的保护作用,作用机制可能与 NF-κB通路有关。     

Anti-inflammation of Tripterygium wilfordii Polycoride on Macrophages and Its Regulation to Inflammation via TLR4/NF-κB

Objective To investigate the inhibitory effect of Tripterygium wilfordii polycoride(TWP) towards the pro-inflammatory factors(TNF-α and IL-1β) on the inflammatory reaction in macrophages induced by LPS and its regulatory effect and influence on the inflammation via TLR4/NF-k B. Methods The MTT method was adopted to test the effect of drugs, TWP, dexamethasone(DXM) and azathioprine(AZA) on cell growth and to select the appropriate concentration. LPS was used to induce the inflammatory reaction in RAW264.7 cell line of mice. Elisa kit was adopted to test the levels of TNF-α and IL-1β. Western blotting was adopted to test the protein expression of TNF-α and IL-1β. RT-PCR was adopted to test the expression of TLR4 and NF-κB. Results The inhibiting effect of TWP on the release of TNF-α and IL-1β in a dose dependent manner. The inhibitory effect of three different TWP dose groups is weaker than that in DXM group. However, TWP in high dose is better than AZA on TNF-α and is as strong as AZA on IL-1β. The dose dependent manner also exits in the effect on the expression of TLR4 and NF-κB, the effect is not weaker, but even stronger than that of DXM and AZA. Conclusion The research shows that down regulation of TLR4 and NF-k B p65 may be one of the mechanisms about the TWP inhibitory effect on TNF-α and IL-1β.     

芪冬活血饮对LPS致炎巨噬细胞炎症反应的作用及机制探讨

目的:通过观察芪冬活血饮大鼠药物血清对NF-κB抑制巨噬细胞炎症细胞因子及TLR4、Cav-1、NF-κBp65 mRNA表达的影响,探讨其炎症调控的机制。方法:将巨噬细胞分为空白对照组(UT组)、LPS组、NF-κB抑制组(NI组)、NF-κB抑制+LPS组(NL组)、LPS加空白血清组(LB组)、LPS加药物血清组(LD组)、NF-κB抑制+LPS+空白血清组(NLB组),NF-κB抑制+LPS+药物血清组(NLD组)8组。巨噬细胞予阻断剂阻断0.5 h后加入LPS致炎,并予药物血清干预,LPS处理12 h后测定各组细胞上清液TNF-α、IL-1β、IL-10水平,及TLR4、Cav-1、NF-κBp65 mRNA相对表达量。结果:LD组TNF-α、IL-1β、IL-10水平及NF-κBp65、Cav-1、TLR4 mRNA相对表达量均低于LB组和LPS组,比较有统计学意义;NLD组TNF-α、IL-1β、IL-10水平及NF-κBp65、Cav-1、TLR4mRNA相对表达量均低于NL组,两组TNF-α、IL-1β有显著统计学差异,NF-κBp65mRNA、IL-10比较差异无统计学意义,Cav-1、TLR4mRNA比较差异有统计学意义。结论:芪冬活血饮药物血清可减轻LPS刺激的巨噬细胞炎性反应;除TLR4/Cav-1/NF-κBp65途径外,芪冬活血饮还可以通过非NF-κBp65途径降低炎症反应。     

芍药甘草汤灌肠治疗大鼠氯胺酮相关性膀胱炎的实验研究

[目的] 探讨芍药甘草汤灌肠治疗氯胺酮相关性膀胱炎（KC）模型大鼠的疗效及其作用机制。[方法] 选取SD雄性大鼠40只,随机分为空白组、模型组、左氧氟沙星组、芍药甘草汤组,每组10只。采用氯胺酮连续腹腔注射12周建立KC模型。芍药甘草汤组给予芍药甘草汤水煎剂灌肠治疗,以左氧氟沙星为阳性对照组,给予左氧氟沙星灌肠治疗,空白组给予等量生理盐水灌肠处理,每日1次,持续4周。治疗结束行膀胱尿动力学检测,比较各组大鼠膀胱残余尿量、最大膀胱容量、最大膀胱压力及膀胱顺应性变化情况;疼痛检测比较各组大鼠疼痛阈值;采用苏木精-伊红染色法和酶联免疫吸附法（ELISA）检测各组大鼠膀胱组织病理学改变及血清中白介素-1β（IL-1β）、白介素-6（IL-6）及肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的表达变化,蛋白质免疫印迹法检测大鼠膀胱组织中核因子-κB p65（NF-κB p65）、核因子E2相关因子2（Nrf2）、环氧化酶-2（COX-2）蛋白表达水平,TransAMTM ELISA法检测NF-κB p65、Nrf2的DNA结合活性。[结果] 与模型组相比,芍药甘草汤组大鼠膀胱最大容量、残余尿量及膀胱顺应性明显降低,最大膀胱内压明显升高,疼痛阈值明显高于模型组,差异有统计学意义（P<0.05）。芍药甘草汤组大鼠膀胱组织病理损伤明显改善,大鼠血清中IL-1β、TNF-α、IL-6炎症因子的表达明显降低,大鼠膀胱组织中NF-κB p65、COX-2的表达明显降低,Nrf2的蛋白表达显著上调,同时降低了NF-κB p65的活性,增高了Nrf2活性,差异有统计学意义（P<0.05）。[结论] 芍药甘草汤能够通过调控NF-κB/COX-2/Nrf2信号通路抑制KC模型大鼠氧化应激及炎症反应,改善膀胱功能,减轻膀胱组织损伤,从而起到治疗KC的作用。     

半夏厚朴汤对脂多糖诱导神经炎症损伤的保护机制

目的 研究半夏厚朴汤（BHT）对脂多糖（LPS）诱导小胶质细胞（BV2细胞）炎症的抑制作用以及对人神经母细胞瘤细胞（SH-SY5Y细胞）的神经保护作用。方法 经LPS诱导BV2细胞构建神经炎症模型后，分别给予模型组（LPS 100 μg·L^-1）、给药组（LPS+1 g·L^-1 BHT、LPS+2 g·L^-1 BHT、LPS+5 g·L^-1 BHT、LPS+10 g·L^-1 BHT），空白组同体积DEME培养基给药；同时建立LPS诱导BV2细胞炎症培养基与SH-SY5Y细胞共培养（LPS-DMEM）系统构建小胶质细胞炎症反应诱导的神经元凋亡模型按上分组分别给药。通过细胞增殖与活性检测（CCK-8）法检测细胞活性，Griess法测定一氧化氮（NO）的含量，酶联免疫吸附测定法（ELISA）测定肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）、白细胞介素-6（IL-6）的含量，实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-time PCR）测定TNF-α、IL-1β、IL-4、一氧化氮合酶（iNOS）、IL-10 mRNA的水平，蛋白免疫印迹法（Western blot）测定细胞内信号传导及转录激活蛋白3（STAT3）、Janus激酶2（JAK2）、核转录因子-κB p65（NF-κB p65）、蛋白激酶B（Akt）、NF-κB抑制蛋白激酶-α（IκBα）、B细胞淋巴瘤-2（Bcl-2）及Bcl-2相关X蛋白（Bax）表达水平。结果 与空白组比较，模型组可增加BV2细胞NO释放，增加TNF-α、IL-1β、IL-6、iNOS水平，减少IL-4、IL-10的含量，增加Akt、NF-κB p65、IκBα、JAK2和STAT3蛋白的表达，并引起共培养的SH-SY5Y细胞的凋亡（P<0.01）。与模型组比较，而BHT能显著降低NO、TNF-α、IL-1β、iNOS含量（P<0.01），显著升高IL-4、IL-10的含量（P<0.01），显著降低Akt、NF-κB p65、IκBα、JAK2和STAT3蛋白的表达（P<0.01）。同时，BHT能抑制LPS-DMEM引起的SH-SY5Y细胞的凋亡（P<0.01）。结论 实验揭示BHT通过调控Akt/NF-κB/JAK2/STAT3信号通路抑制LPS诱导的BV2细胞炎症反应，并在SH-SY5Y细胞中表现出神经保护作用。     

肺肠合治法对LPS诱导急性肺损伤大鼠NF-κB炎症通路和巨噬细胞极化的影响

目的 探究肺肠合治法（麻黄汤+大承气汤）对脂多糖（LPS）诱导的急性肺损伤（ALI）大鼠的作用与保护机制。方法 将Wistar大鼠随机分为正常组、模型组、肺肠合治低、中、高剂量组、地塞米松组。通过LPS（10 mg·kg^-1）腹腔注射成功复制ALI大鼠模型。观察与记录各组大鼠一般状态;采用肛温测量法记录各组大鼠造模后0~8 h体温数值;造模后24 h取材,收集血清与肺组织。酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测大鼠血清白细胞介素-1β（IL-1β）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-10（IL-10）、精氨酸酶-1（Arg-1）含量;蛋白免疫印迹法（Western blot）检测各组大鼠肺组织中核转录因子-κB p65（NF-κB p65）、磷酸化核转录因子-κB p65（p-NF-κB p65）、核转录因子抑制蛋白α（IκBα）、磷酸化核转录因子抑制蛋白α（p-IκBα）蛋白的表达量;免疫荧光双标检测大鼠肺组织经典激活型（M1）巨噬细胞标记物CD80、IL-1β、巨噬细胞标记物F4/80、IL-10表达。结果 与正常组比较,模型组大鼠体温和热效应指数（TRI）显著升高,血清促炎因子TNF-α、IL-1β和抗炎因子IL-10水平显著升高（P<0.01）,肺组织p-NF-κB p65、p-IκBα蛋白表达显著升高（P<0.01）,肺组织巨噬细胞标志物F4/80、M1巨噬细胞标志物CD80和IL-1β的表达显著升高（P<0.01）;与模型组比较,肺肠合治各组和地塞米松组大鼠体温与TRI指数降低（P<0.01）,血清炎症因子TNF-α、IL-1β水平降低（P<0.05,P<0.01）,血清抗炎因子IL-10、Arg-1水平升高（P<0.05,P<0.01）,肺组织p-NF-κB p65、p-IκBα蛋白表达降低（P<0.05,P<0.01）,肺组织M1巨噬细胞标志物CD80、IL-1β表达显著降低和IL-10表达显著升高（P<0.01）,巨噬细胞标志物F4/80表达无明显变化。结论 肺肠合治方剂对ALI大鼠的发热与炎症状态有明显的改善,其机制可能与NF-κB炎症通路被抑制,肺组织巨噬细胞向抗炎表型极化有关。     

虎杖苷对NRK-52E细胞缺血再灌注损伤时TLR-4表达的抑制作用

虎杖苷（polydatin,PD）是传统中药虎杖中提取的第四单体,具有利湿退黄,活血通经等功效。研究发现其对缺血再灌注（ischemia reperfusion,I/R）肾损伤其保护作用,目前虎杖苷在急性缺血性肾损伤中的具体作用尚不完全清楚。该实验通过培养肾小管上皮细胞（NRK-52E）,观察体外缺血再灌注损伤时虎杖苷对大鼠肾小管上皮细胞TLR4受体的干预作用并进一步探讨其对TLR4信号通路的作用机制。将体外培养的NRK-52E细胞采用缺氧复氧的方法,模拟肾I/R损伤过程。在缺氧复氧6 h/24 h时,采用realtime-PCR检测TLR4基因的表达变化,Western blot检测TLR4和NF-κB蛋白水平,ELISA检测炎症因子TNF-α,IL-1β水平。虎杖苷浓度依赖性下调TLR4的mRNA和蛋白表达水平,减少TLR4下游信号分子NF-κB的蛋白表达水平以及炎症因子TNF-α和IL-1β的蛋白表达水平。此外,TLR4阻断剂对缺氧复氧诱导的NRK-52E细胞NF-κB及炎症因子TNF-α和IL-1β的蛋白表达水平有部分抑制作用,虎杖苷可增强这一抑制作用。虎杖苷对NRK-52E细胞TLR4致炎信号通路的负性调节作用,可能是通过干预TLR4表达,影响胞内信号转导途径,抑制NF-κB表达,从而减轻肾脏炎症反应。     

哈巴俄苷通过抑制TLR4/MyD88/NF-κB通路减轻神经炎症诱导的神经元损伤

目的 研究哈巴俄苷对神经炎症诱导神经元损伤的作用。方法 采用MTT检测血管紧张素II（angiotensin II,Ang II）和哈巴俄苷对小鼠小胶质BV2细胞活性的影响;观察BV2细胞的形态变化;检测细胞上清液中炎症因子水平;采用免疫荧光检测核因子-κB p65（nuclear factor-κB p65,NF-κB p65）核易位以及CD86、髓系细胞触发受体2（triggering receptor expressed on myeloid cells 2,TREM2）的表达;采用Western blotting检测Toll样受体4（Toll like receptor 4,TLR4）、髓样分化因子88（molecule myeloid differentiation factor 88,MyD88）、诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase,iNOS）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）、白细胞介素-1β（interleukin-1β,IL-1β）蛋白表达。分别使用脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）和TLR4抑制剂（TAK-242）进一步验证哈巴俄苷的作用机制。建立BV2-HT22细胞共培养模型,检测线粒体膜电位、细胞凋亡情况以及凋亡相关蛋白表达,研究哈巴俄苷对神经炎症引起的神经元损伤的影响。结果 Ang II显著上调BV2细胞TLR4、MyD88、IL-1β、TNF-α和iNOS蛋白表达（P＜0.01、0.001）,促进NF-κB p65入核（P＜0.001）,调节小胶质细胞表面炎症标志物CD86和TREM2的表达（P＜0.05）。哈巴俄苷和TAK-242可逆转Ang II或LPS诱导的BV2细胞的作用（P＜0.05、0.01、0.001）。此外,哈巴俄苷可显著下调BV2-HT22共培养模型HT22细胞中凋亡相关蛋白的表达（P＜0.01、0.001）,抑制HT22细胞凋亡（P＜0.05、0.001）。结论 哈巴俄苷可能通过抑制Ang II诱导的BV2细胞TLR4/MyD88/ NF-κB通路的激活来减轻炎症反应,进而缓解炎症引起的神经元细胞的凋亡。     

通腑泻肺法对ALI/ARDS大鼠炎症反应的调控作用

目的探讨通腑泻肺中药对ALI/ARDS大鼠炎症反应的可能作用机制。方法 27只大鼠随机分为空白组、模型组、中药组,每组9只。模型组与中药组尾静脉注射内毒素8 mg/kg,空白组大鼠静脉注射生理盐水。中药组在造模完成后给予通腑泻肺中药灌胃,每次0.01 m L/g,每日1次,共7 d,空白组与模型组予等量生理盐水灌胃。通过ELISA法检测大鼠血清及BALF中TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10表达,免疫组化染色及Real-Time PCR方法检测肺组织PPARγ、NF-κB p65、TLR4蛋白及其m RNA表达。结果模型组大鼠肺组织中NF-κB p65和TLR4的m RNA表达升高,PPARγ的m RNA表达下降(P0.05),炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10显著升高(P0.05);与模型组相比,中药组NF-κB p65、TLR4的m RNA表达降低,PPARγ的m RNA表达升高(P0.05),炎症因子显著降低(P0.05)。结论通腑泻肺中药可以上调ALI/ARDS状态下PPARγ的表达,降低TLR4及NF-κB表达,减轻TLR4介导的炎症反应。     

基于TLR4/NF-κB信号通路研究清开灵口服液防治肺炎的作用机制

目的 基于Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4)/核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)信号通路研究清开灵口服液防治肺部炎症的作用及机制。方法 SD大鼠随机分为对照组、模型组及清开灵口服液低、中、高剂量(4、8、16 mL/kg)组和头孢氨苄(175 mg/kg)组,各给药组ig相应药物,1次/d,连续6 d。给药同时进行造模,肺部注射肺炎克雷伯菌菌液造模3 d,对照组肺部注射生理盐水。给药结束后采集大鼠血液、肺泡组织灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF),进行菌落培养和计数;采用全自动血液细胞分析仪检测白细胞数量及中性粒细胞、单核细胞比例;采用ELISA法检测血清中白细胞介素-1(interleukin-1,IL-1)、IL-2、IL-6、IL-10、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、缓激肽(bradykinin,BK)、单核细胞趋化因子(monocyte chemotactic protein-1,MCP-1)水平及环氧化酶-1(cyclooxygenase-1,COX-1)、COX-2活性;采用苏木素-伊红(HE)染色观察大鼠肺组织病理变化;采用免疫组化法检测肺组织TLR4蛋白表达;采用Western blotting法检测肺组织磷酸化p65(phosphorylated p65,p-p65)、p65、磷酸化NF-κB抑制因子(phosphorylated inhibitor of NF-κB,p-IκB)和IκB表达。结果 与模型组比较,清开灵口服液组大鼠全血及BALF中经培养后的菌落数显著降低(P<0.05);全血中白细胞数目及中性粒细胞、单核细胞比例均显著降低(P<0.05、0.01);血清中IL-1、IL-2、IL-6、IL-10、TNF-α、BK、MCP-1水平及COX-1、COX-2活性均显著降低(P<0.05、0.01);肺实质中炎性细胞浸润、红细胞渗出及肺泡上皮细胞脱落等现象明显减少;肺组织中TLR4蛋白阳性表达明显减少,p-p65/p65和p-IκB/IκB蛋白表达水平显著下降(P<0.05、0.01)。结论 清开灵口服液具有抑制肺炎克雷伯菌所致肺炎的作用,其机制可能与调控TLR4/NF-κB信号通路有关。     

蹄叶橐吾萃取物通过NF-κB通路降低细胞炎症反应＊

目的 探究蹄叶橐吾提取物（ethanolic extract of ligularia fischeri，EEOLF）的抗炎作用机制，为蹄叶橐吾（Ligularia fischeri, LF）的临床应用提供理论依据。方法 采用脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）作用于RAW264.7细胞建立体外细胞炎症模型。实验分6组，即空白对照组、EEOLF组、LPS组、LPS + 吡咯烷二硫代氨基甲酸盐（Ammonium pyrrolidinedithiocarbamate，PDTC）组、LPS + EEOLF组、LPS + EEOLF + PDTC组。Western blot法检测药物作用于RAW264.7细胞后，细胞核内因子κB p65（nuclear factor-κB，NF-κB）的表达水平和磷酸化水平。ELISA法测定药物作用于RAW264.7细胞后IL-1β及TNF-α的释放量。结果 与空白组对照比较，LPS能显著增加细胞核内NF-κB p65蛋白表达及其磷酸化水平（P < 0.001）；与LPS组比较，EEOLF能显著下调LPS诱导增加的NF-κB p65蛋白表达及其磷酸化水平（P < 0.001）。与空白组比较，LPS能显著增加炎症因子L-1β及TNF-α的分泌（P < 0.001）；与LPS组比较，蹄叶橐吾提取物（ethanolic extract of ligularia fischeri，EEOLF）能显著降低LPS诱导增加的L-1β及TNF-α的分泌（P < 0.001）。在NF-κB抑制剂PDTC作用下，LPS诱导的细胞炎症反应减弱，并且在PDTC存在下，EEOLF能更加明显降低LPS所诱导的细胞炎症反应。结论 EEOLF通过作用于NF-κB通路抑制炎性因子的分泌，从而达到抗炎作用。     

桑苏饮调控TLR4通路抑制哮喘大鼠气道炎症

目的 探讨桑苏饮调控Toll样受体4（TLR4）通路对哮喘大鼠气道炎症的抑制作用。方法 48只SD大鼠中选取40只建立哮喘模型,并按照随机数表法等分为模型组,地塞米松组,桑菊饮低、中、高剂量组5组,剩余8只SD大鼠作为空白组。地塞米松组予以0.005 g·kg^-1灌胃,桑苏饮低、中、高剂量组分别予以2.1,4.2,8.4 g·kg^-1桑苏饮灌胃（给药体积0.01 L·kg^-1）,模型组和空白组分别予以给药体积0.01 L·kg^-1灌胃生理盐水,均每天1次,共7 d。比较干预后各组大鼠过敏反应分级;酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测各组大鼠干预后血清,支气管肺泡灌洗液（BALF）白细胞介素-1β（IL-1β）,肿瘤坏死因子-α（TNF-α）,γ-干扰素（IFN-γ）水平;苏木精-伊红（HE）染色观察各组肺组织病理改变,比较肺组织炎症细胞浸润评分;实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-time PCR）检测各组肺组织TLR4,核转录因子-κB（NF-κB）mRNA表达;蛋白免疫印迹法（Western blot）检测各组肺组织TLR4,NF-κB蛋白表达及磷酸化（p）-NF-κB水平。结果 模型组过敏反应分级、肺组织病理改变较空白组加重,其余各组较模型组均有所减轻;模型组血清,BALF IL-1β,TNF-α水平均高于空白组,其余各组均低于模型组（P<0.01）;模型组血清,BALF IFN-γ水平均低于空白组,其余各组均高于模型组（P<0.05,P<0.01）;模型组肺组织炎症细胞浸润评分,肺组织TLR4,NF-κB mRNA与蛋白表达,p-NF-κB蛋白水平均高于空白组,其余各组均低于模型组（P<0.01）,差异有统计学意义。结论 桑苏饮可抑制哮喘大鼠过敏反应、肺组织病变和气道炎症,可能是通过抑制TLR4通路,下调TLR4,NF-κB mRNA与蛋白表达,降低p-NF-κB水平实现。     

苓甘五味姜辛汤治疗急性肺损伤的作用机制

目的 探究苓甘五味姜辛汤治疗脂多糖（LPS）诱导的小鼠急性肺损伤（ALI）的作用机制。方法 使用中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）数据库和GeneCards、DisGeNET、Herb数据库结合基因表达综合数据库（GEO）临床数据筛选苓甘五味姜辛汤治疗ALI的关键靶点，构建蛋白质-蛋白质相互作用网络（PPI）筛选核心靶点，并进行基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析。使用LPS诱导建立小鼠ALI模型，验证苓甘五味姜辛汤治疗ALI的效果及相关靶点，并采用蛋白免疫印迹法（Western blot）检测肺组织中Toll样受体（TLR）4、核转录因子-κB p65（NF-κB p65）、磷酸化NF-κB p65（p-NF-κB p65）的表达水平。结果 分析显示苓甘五味姜辛汤治疗ALI与白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子（TNF）-α、原癌基因（JUN）等10个核心靶点相关，涉及TNF信号通路、TLR信号通路、NF-κB信号通路等。动物实验结果显示苓甘五味姜辛汤可以减轻肺部损伤，改善ALI小鼠的病理状态，显著降低血清中TNF-α、IL-6的表达，提高肺组织中总超氧化物歧化酶（T-SOD）、过氧化氢酶（CAT）的活性，显著降低肺组织中JUN、TLR4、NF-κB p65、NF-κB p-p65蛋白表达水平。结论 苓甘五味姜辛汤可以抑制LPS诱导的ALI小鼠炎症和氧化损伤，其机制可能与抑制TLR4/NF-κB信号通路，降低炎症因子TNF-α、IL-6的水平有关。     

基于TLR4/MyD88/NF-κB信号通路探讨通络蠲痹颗粒对骨关节炎炎症损伤和细胞凋亡的影响

目的 观察通络蠲痹颗粒对膝骨关节炎（KOA）兔软骨细胞凋亡及Toll样受体4（TLR4）/髓样分化因子88（MyD88）/核转录因子-κB（NF-κB）信号通路的影响,研究其防治KOA的作用机制。方法 30只新西兰兔按随机数字表法分为假手术组、模型组、通络蠲痹颗粒低、高剂量组（4.1、8.2 g·kg^-1·d^-1）、塞来昔布组（10.9 mg·kg^-1·d^-1）,每组6只。采用内侧半月板失稳法（DMM）建立兔KOA模型,造模6周后给药,干预8周,每日1次。用苏木素-伊红（HE）染色和番红O-固绿染色观察关节软骨病理改变;原位末端标记法（TUNEL）荧光染色检测关节软骨细胞凋亡;酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测关节液中白细胞介素-1β（IL-1β）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）含量;实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-time PCR）和蛋白免疫印迹法（Western blot）检测TLR4/MyD88/NF-κB信号通路相关基因的mRNA和蛋白表达水平。结果 与假手术组比较,模型组关节软骨退变严重,Mankin评分升高（P<0.01）,关节液IL-1β、TNF-α含量升高（P<0.01）,软骨细胞凋亡数量增加（P<0.01）,软骨组织中TLR4、MyD88、NF-κB p65的mRNA和蛋白表达上调（P<0.01）,而Bcl-2的mRNA及蛋白表达下调（P<0.01）;与模型组比较,通络蠲痹颗粒低、高剂量组软骨退变得到改善,Mankin评分降低（P<0.01）,IL-1β、TNF-α含量降低（P<0.01）,软骨细胞凋亡数量减少（P<0.01）,软骨组织中TLR4、MyD88、NF-κB p65的mRNA和蛋白表达下调（P<0.01）,Bcl-2的mRNA及蛋白表达上调（P<0.01）,且在上述观察指标中通络蠲痹颗粒高剂量组均明显优于低剂量组。结论 通络蠲痹颗粒可抑制KOA兔关节软骨细胞凋亡,改善软骨退变,其作用机制可能与抑制TLR4/MyD88/NF-κB信号通路介导的炎症反应有关。     

基于SIRT1/NF-κB信号通路探讨有氧运动结合生慧汤对睡眠剥夺大鼠学习记忆的影响＊

目的 研究4周的跑台运动结合生慧汤对睡眠剥夺大鼠SIRT1/NF-κB信号通路及相关炎症因子的调节作用，探讨其改善睡眠剥夺大鼠学习记忆可能的作用机制。方法 将48只睡眠剥夺模型大鼠随机均分为空白对照组（CON组）、有氧运动组（EX组）、完全睡眠剥夺组（TSD组）、完全睡眠剥夺 + 有氧运动组（TSD + EX组）、完全睡眠剥夺 + 生慧汤 + 有氧运动组（TSD + SHT + EX组）、完全睡眠剥夺+生慧汤组（TSD + SHT组）。EX组、TSD + EX组进行4周的跑台运动、TSD + SHT + EX组同时给与4周的跑台运动及生慧汤之后，采用多平台水环境法建立大鼠完全睡眠剥夺模型，TSD组、TSD + EX组、TSD + SHT组、TSD + SHT + EX组进行72 h的睡眠剥夺。睡眠剥夺结束后采用Morris水迷宫评价大鼠的学习记忆，采用Western blot（免疫印迹试验）检测大鼠海马中SIRT1、IκBα（NF-κB的抑制蛋白）、AC-NF-κB p65（乙酰化NF-κB p65）蛋白表达水平，采用实时荧光定量PCR技术和ELISA（酶联免疫吸附剂测定）分别检测海马和血清中TNF-α（肿瘤坏死因子-α）、IL-6（白细胞介素-6）、IL-1β（白细胞介素-1β）mRNA表达水平，采用HE染色（苏木精-伊红染色法）观察大鼠海马的神经元形态。结果 与CON组比较，TSD组大鼠上平台潜伏期和游泳总路程显著增加，初次抵达平台时间显著延长，目标象限停留时间显著减少；SIRT1、IκBα表达显著降低、AC-NF-κB p65表达显著升高；海马及血清中TNF-α、IL-6、IL-1β表达水平显著升高。与TSD组比较，TSD + EX组、TSD + SHT组、TSD + SHT + EX组大鼠平台潜伏期和游泳总路程显著减少，初次抵达平台时间缩短，目标象限停留时间增加；SIRT1、IκBα表达升高、AC-NF-κB p65表达降低；海马及血清中TNF-α、IL-6、IL-1βmRNA表达水平显著降低；TSD + SHT + EX组、TSD + EX组、TSD + SHT组海马神经元细胞排列较规则，数量增加，细胞核饱满。结论 4周的有氧运动结合生慧汤可抑制神经元损伤，改善睡眠剥夺引起的大鼠学习记忆能力，其机制可能与SIRT1/NF-κB信号通路中的关键蛋白及TNF-α、IL-6、IL-1β等炎症因子表达有关。     

蔓性千斤拔素D通过TLR2/MyD88/NF-κB信号通路调控CIA大鼠炎症反应的相关机制

目的 观察蔓性千斤拔素D对大鼠胶原诱导型关节炎（CIA）的作用并探讨其作用机制。方法 将40只大鼠随机分为正常组、CIA组、甲氨蝶呤（MTX）组（1.35 mg·kg^-1）、蔓性千斤拔素D低剂量组（1.5 mg·kg^-1）及蔓性千斤拔素D高剂量组（3.0 mg·kg^-1）,每组8只,除正常组外,其余均采用Ⅱ型胶原诱导CIA模型。给药组通过灌胃给予相应药液,正常组给予相应体积生理盐水,MTX组每周1次,蔓性千斤拔素D各组每天1次,共给药28 d。实验中记录各组大鼠关节炎评分和关节肿胀度,苏木素-伊红（HE）染色观察各组大鼠踝关节病理学变化,酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测大鼠血清炎症因子白细胞介素（IL）-1β、IL-6、IL-8、肿瘤坏死因子（TNF）-α水平,实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-time PCR）检测Toll样受体2（TLR2）、髓样分化因子88（MyD88）、核转录因子-κB（NF-κB） p65 mRNA的表达量,蛋白免疫印迹法（Western blot）检测TLR2、MyD88、NF-κB p65蛋白的表达量。结果 与正常组比较,CIA组大鼠踝关节明显肿胀,关节炎临床评分及关节肿胀度显著升高（P<0.01）,踝关节组织结构明显破坏,血清炎性因子IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α含量显著升高（P<0.01）,TLR2、MyD88、NF-κB p65 mRNA及蛋白表达水平显著升高（P<0.01）。与CIA组比较,各给药组大鼠关节炎临床评分及关节肿胀度均明显降低（P<0.05,P<0.01）,踝关节组织结构病理变化明显改善,血清IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α含量均明显降低（P<0.05,P<0.01）,踝关节TLR2、MyD88、NF-κB p65 mRNA及蛋白表达水平均明显下降（P<0.05,P<0.01）。结论 蔓性千斤拔素D在一定程度上可降低类风湿关节炎大鼠炎性因子的表达,能起到良好的治疗作用,其作用机制可能是通过抑制TLR2/MyD88/NF-κB信号通路的活化而发挥抗炎作用。