苦荞FtERF基因克隆、生物信息学及其表达分析

乙烯响应因子对植物发育和细胞代谢具有重要作用。通过RT-PCR从苦荞中克隆出ERF基因,对其进行生物信息学分析和差异表达分析。结果表明,FtERF基因开放阅读框长度为729 bp,编码了243个氨基酸,编码的蛋白分子量26.08 k D,等电点9.22,属于亲水性蛋白。FtERF不含有信号肽和跨膜螺旋结构,亚细胞定位在细胞核内,蛋白质二级结构和三级结构高度相似。FtERF含有抑制基序DLNxxP,系统进化表明FtERF和ERF4关系较近。经荧光定量表达发现,厚壳苦荞不同部位表达均高于薄壳苦荞,苦荞发育成熟期表达高于非成熟期。     

玉米Zmcen基因的克隆、表达与生物信息学分析

为研究玉米Zmcen基因的特征及生物学功能,并对其编码蛋白结构与功能进行分析。以玉米c DNA为模板,将其构建到带有GST表达标签的原核表达载体p GEX-6p-1中,构建的重组载体p GEX-6p-ZmCen转化至大肠杆菌BL21(DE3),通过0.3 mmol/L IPTG在27℃下诱导表达20 h,获得了可溶性的GST融合蛋白。采用GST亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,经12%SDS-PAGE电泳和GST标签抗体Western Blotting检测,鉴定为含有GST-Tag的融合蛋白,纯化的蛋白经Pre Scission Protease(PPase)过夜酶切切除GST标签,得到较纯的ZmCen蛋白;同时利用生物信息学的方法,解析ZmCen蛋白质的结构特征。结果表明,该基因定位于玉米第7#染色体上,全长基因含有6个外显子和7个内含子,519 bp的开放阅读框,编码172个氨基酸,分子量约为19.78 k Da,等电点为4.78。采用maize GDB数据库对玉米整个生命周期的表达水平进行分析表明,细胞分裂旺盛的部位,Zmcen基因的表达量较高。对16种植物进行系统发育树分析显示,Zmcen基因与水稻、小麦、拟南芥等的centrin基因同源性高达80.21%,该结果为探索Zmcen蛋白的未知生物学功能提供了线索。     

苦荞FtHY5基因克隆、生物信息学及参与花青素合成分析

HY5 (Elongated hypocotyl 5)转录因子是参与植物光形态建成的重要成员,并调控花青素的生物合成。本研究以苦荞‘晋荞2号’作为材料,利用PCR克隆其HY5基因的完整的CDS序列,并对FtHY5的理化性质、保守功能域、信号肽、亚细胞定位、亲/疏水性、蛋白质结构、系统进化等进行了生物信息学分析,此外还分析了其对苦荞芽菜花青素合成的影响。结果表明,FtHY5基因完整的CDS长度为507 bp,编码的蛋白分子量为18.434 kD,等电点为9.47,空间构象呈拉链形状,属于亲水性蛋白,含有信号肽,亚细胞定位在细胞核里。苦荞FtHY5蛋白的氨基酸序列与藜麦和甜菜的亲缘关系最近。FtHY5基因与花青素生物合成途径上的结构基因在光照条件下培养的芽菜中的表达水平均高于黑暗条件下的,说明Ft HY5可能调控这些花青素合成基因的表达水平,从而参与光诱导花青素合成的过程。综上所述,本研究结果将为进一步研究FtHY5调控苦荞芽菜花青素的生物合成的分子机理提供基础,同时也为利用该基因来改善苦荞芽菜的品质提供理论支撑。     

枸杞LbCO基因的克隆与生物信息学分析

CONSTANS(CO)基因是高等植物叶片中光周期途径的关键成分,生物钟及光信号控制CO基因的表达。本研究以宁夏枸杞(Lycium barbarum L.)品种之一‘宁杞7号’叶片为实验材料,通过转录组测序结果筛选,利用RT-PCR技术扩增得到‘宁杞7号’的CO基因cDNA全长序列,命名为LbCO。利用生物信息学手段对所获得的序列进行结果及功能预测,结果显示:LbCO基因的cDNA序列全长1224 bp,编码407个氨基酸,分子质量为44.83 k D,理论等电点pI=5.58,不稳定指数为39.66,是一种稳定的非分泌蛋白。该蛋白亚细胞定位于细胞核,二级结构中无规则卷曲占比最高(54.48%),其次为α-螺旋(28.99%)。系统进化分析表明枸杞LbCO蛋白与其它物种的CO蛋白具有较高的同源性,其中与辣椒属CO蛋白亲缘关系最近。本研究为后续进一步探讨该基因编码的蛋白在调控枸杞花期研究方面提供理论参考。     

甘蓝型油菜BnAPX1基因的克隆与生物信息学分析

抗坏血酸过氧化物酶(APX)是一种利用抗坏血酸作为电子供体的H₂O₂清除剂,在植物抵御逆境胁迫中起到重要作用。为进一步探究甘蓝型油菜APX1基因的功能,本研究通过RT-PCR法从甘蓝型油菜中克隆得到一条长度为753 bp的APX1 CDS序列,将其命名为BnAPX1。生物信息学分析表明,BnAPX1基因共编码250个氨基酸,相对分子量为27.546 14 kD,等电点为5.49,不稳定系数为36.73,属于稳定性蛋白;该蛋白的二级结构中无规则卷曲为42.00%,α-螺旋为39.20%,延伸链为10.40%,β-转角为8.40%;亚细胞定位预测结果显示该基因编码的蛋白位于过氧化物酶体中,其编码的蛋白没有跨膜结构,没有信号肽,属于非分泌蛋白。BnAPX1蛋白含有K+binding site、Substrate binding site、Heme binding site结合位点,属于植物过氧化物酶类似家族。     

水稻去泛素化酶OsUCH-L5基因的克隆及表达分析

通过生物信息学及RT-qPCR(quantitative Real-time PCR,RT-qPCR)的方法对水稻OsUCH-L5基因进行探究.生物信息学预测结果表明,该基因全长837 bp,编码278个氨基酸;OsUCH-L 5蛋白的相对分子质量为31.64 kDa,等电点为5.66,为亲水性蛋白,具备Peptida...     

欧李ChIRT1基因的克隆与生物信息学分析

欧李(Cerasus humilis)是蔷薇科矮生灌木,果实中的钙、铁等营养物质丰富.铁调转运基因1(IRT1)编码的蛋白是ZIP金属转运家族中主要的铁转运蛋白,负责植物中金属离子的转运,尤其是铁的吸收.本研究从欧李叶片中提取RNA,逆转录得到cDNA;参照小金海棠(Malus xiaojinensis)MxIRT1基...     

苦荞FtC4H基因克隆与生物信息学分析

克隆苦荞苯丙烷类物质代谢途径中的关键酶肉桂酸-4-羟基化酶基因（FtC4H）,为进一步研究其功能奠定基础。以云荞1号和小米荞为材料,提取不同发育期果壳RNA,利用RT-PCR法克隆苦荞FtC4H基因,运用生物信息学分析FtC4H蛋白的特征,构建FtC4H蛋白系统进化树,分析其基因表达。结果表明,克隆的FtC4H基因序列包含1299bp完整的cDNA开放阅读框,编码432个氨基酸,为亲水性不稳定碱性蛋白,具有P450超家族保守域,不具有跨膜结构域,有丰富的二级结构,三级结构预测显示FtC4H与6vby.1.A的序列相似度高。系统进化分析结果表明,本研究克隆的FtC4H与已报道的苦荞其他C4H基因不同。qRT-PCR结果表明,FtC4H在小米荞的花和叶中相对表达量显著高于云荞1号。     

白木香倍半萜合酶基因AsVS的克隆与表达分析

法尼基焦磷酸(farnesyl diphosphate, FPP)是植物萜类化合物合成途径的重要前体之一,经不同的酶催化可形成各类萜类化合物,Vetispiradiene合酶可催化FPP形成Solavetivone和Lubimin的前体Vetispiradiene。本研究利用白木香转录组数据,首次克隆了编码白木香Vetispiradiene合酶的基因(命名为As VS, Genbank登录号为MH378283),AsVS基因序列全长为1 632 bp,编码543个氨基酸,该氨基酸序列与马来沉香倍半萜合酶聚类于同一分支,具有较近的亲缘关系,该蛋白植物倍半萜的保守性结构域DDXXD,NST/DTE和R(R)X8W,相对分子量为62.73 kD,理论等电点为5.51,包含40个磷酸化位点;二级结构以α螺旋和无规则卷曲为主;不含跨膜结构域。RT-qPCR分析结果表明AsVS基因在结香剂处理过程中于白木香茎干样品中持续上调表达,其第6天及第9天的表达量分别为对照处理的2.36和5.02倍。此结果为进一步研究As VS基因在白木香萜类化合物的合成及沉香致香成分富集中的功能提供了理论基础。     

玉米ZmMAPKKK21基因的克隆和生物信息学分析

丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK）在植物应对生物和非生物胁迫过程中发挥着重要作用。在前期研究中我们挖掘到ZmMAPKKK21这一潜在的重要抗旱基因,本研究从玉米抗旱自交系J24中克隆获得ZmMAPKKK21基因,并对其进行生物信息学分析。结果表明,玉米ZmMAPKKK21基因开放阅读框长1419 bp,编码472个氨基酸,是不具有信号肽的亲水性蛋白,且其启动子序列含有多个与逆境胁迫和激素有关的顺式作用元件;玉米中的MAPKKK21蛋白预测定位在细胞核上,蛋白互作预测结果显示,ZmMAPKKK21蛋白与参与植物逆境胁迫相关的MAPKK3蛋白和ZIM家族蛋白发生互作,其结构与高粱（Sorghum bicolor L.）和谷子（Setaria italica L.）等高抗旱禾本科作物相比,不但在STKc＿MAPKKK结构域上高度保守,且具有更加相似的二级结构和三级结构;qRT-PCR分析发现,ZmMAPKKK21基因在玉米根系中表达水平较高,干旱胁迫后该基因在根和叶中表达上调,进一步验证了ZmMAPKKK21基因的表达与干旱胁迫响...     

ITS序列在苦荞麦种质资源鉴定中的应用

为了更精确有效地鉴定苦荞麦种质资源,根据ITS序列通用引物,以苦荞麦基因组DNA为模板通过PCR方法扩增出ITS(internal translation spacer)序列,在克隆测序的基础上对荞麦属5个栽培苦荞麦中进行分子鉴定与亲缘关系分析。结果表明：（1）5个供试材料ITS序列的变异小,序列长度在584~590 bp之间,G+C含量高,为67.5%~68.5%。（2）通过聚类方法分析发现‘建德苦荞麦’和‘红花苦荞麦’聚为一支,‘西荞2号’和‘西荞3号’聚为一支。     

苦荞提取物的化感作用及化学成分分析

为探究苦荞水提液的化感作用及其相关的化学成分,以2种农田恶性杂草马唐和三叶鬼针草为供试植物,测定苦荞水提液的不同有机相萃取物的化感作用,利用气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)对苦荞水提液的石油醚相和乙酸乙酯相的萃取物进行化学成分分析。结果表明,苦荞水提液的石油醚、乙酸乙酯和正丁醇相萃取物均对马唐和三叶鬼针草的种子萌发和幼苗生长具有一定的抑制作用,其中乙酸乙酯相的化感抑制率最强,当浓度为2.00 mg/mL时,供试植物的化感响应指数为-1.00,抑制率达到100.0%,其次是石油醚相,正丁醇相的抑制率最差。总体上,3种不同萃取物对马唐的抑制作用大于三叶鬼针草,对根长抑制率大于茎长。苦荞水提液石油醚相和乙酸乙酯相中含量大于0.5%的化学成分有41种,其中石油醚相的主要成分为4-乙基苯酚,含量占26.8%,乙酸乙酯相的主要成分为四氢薰衣草醇,含量占20.7%。本研究初步证实,苦荞对农田杂草具有一定的化感作用,含有活性的化学成分,其化学成分的活性特征及作用机制有待进一步研究。     

蓖麻GST的基因克隆及生物信息学分析

谷胱甘肽S-转移酶(glutathione S-transferase,GST)是谷胱甘肽结合反应的关键酶,催化谷胱甘肽结合反应的起始步骤,主要存在于胞液中,有多种形式,其在病理学上有一定的重要性。本研究通过克隆GST基因以及对其进行相关的生物信息学分析。利用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)技术扩增该基因,经分析该基因可编码219个氨基酸,并且通过相关分析得到这219个氨基酸组成的蛋白为稳定的亲水性蛋白,有一个明显的区段存在信号肽,在该蛋白中α-螺旋和无规则卷曲是主要的二级结构方式,根据序列同源比对,蓖麻、麻疯树和榴莲聚类到一起,说明相对于其他物种,它们的同源性较高。这些分析结果为蓖麻谷胱甘肽S-转移酶生物合成及其功能的进一步研究提供一定的理论与实践依据。     

山胡椒LgCMK基因克隆与生物信息学预测分析

CMK是MEP途径中的第四个关键酶,对于萜类合成代谢具有重要的影响。本研究基于实验室前期获得的山胡椒果实的转录组数据,经过注释筛选出CMK基因,首次从山胡椒中克隆得到萜类生物合成关键基因LgCMK并对其生物信息学预测分析。结果显示:LgCMK基因的开放阅读框为1 221 bp,编码406个氨基酸,分子量为44.78 k D,理论上等电点为6.26,属GHMP蛋白超家族。对Lg CMK蛋白的氨基酸序列理化性质进行分析,发现蛋白亲水性指数为-0.332,不稳定性指数为41.77,属于亲水性不稳定蛋白;亚细胞定位预测结果显示该蛋白定位于叶绿体中。同源性和系统进化分析结果表明,与香樟、博落回和罂粟同源蛋白相似度较高分别为96.8%、75.96%和73.0%,不同物种的CMK具有较近的亲缘关系,与香樟同属一支,亲缘关系最近。通过本研究生物信息学分析将有助于对LgCMK深层次功能探究提供借鉴作用,同时为山胡椒的种质改良提供基因资源。     

毛竹中黄酮-C-糖基转移酶基因的克隆和生物信息学分析

糖基转移酶是催化黄酮糖苷形成的关键酶。黄酮糖苷类化合物具有抗氧化、清除自由基、调节血脂和血糖等生理作用。基于毛竹基因库测序的完成,本研究通过RT-PCR技术首次获得一条完整的毛竹黄酮-C-糖基转移酶基因开放阅读框,将其命名为PeCGT,其基因的序列长度是1342 bp。对其编码蛋白的理化性质、保守结构域以及二级结构和空间结构等进行了生物信息学分析。结果表明:PeCGT基因编码的蛋白含有447个氨基酸,分子量是47.76 kD,理论等电点为4.91,酸性氨基酸(Asp+Glu)个数为54,碱性氨基酸(Arg+Lys)个数为35。PeCGT蛋白是疏水型蛋白,不存在信号肽,存在于线粒体中。结构域预测分析结果表明,PeCGT编码的氨基酸序列具有明显的糖基转移酶特征的保守域结构PSPG。通过同源性分析,其与乌拉图小麦(Triticum urartu)、节节麦(Aegilops tauschii subsp.Tauschii)和二穗短柄草(Brachypodium distachyonhiihii)具有较高的同源性。实时荧光定量PCR结果表明:PeCGT基因在叶中的表达量最高,在根中几乎不表达,在茎中有部分表达。此研究结果为以后毛竹黄酮-C-糖基转移酶的表达和功能鉴定提供了一定的帮助。     

细粒棘球蚴TSP1和TSP6基因的克隆及生物信息学分析

为了研究绵羊细粒棘球蚴重要抗原基因Tetraspanin 1-TSP1(TSP1)和Tetraspanin 1-TSP6(TSP6)的功能,对Gen Bank中Eg基因组数据库检索,获得TSP1和TSP6的c DNA序列并设计特异性引物。以Eg头节为总RNA模板,进行RT-PCR,将PCR产物克隆到p MD19-T载体后测序并进行生物信息学分析。TSP1 c DNA全长792个核苷酸,编码263个氨基酸,该多肽含有3个潜在的N端糖基化位点,2个N端酰基化位点,与已登录的标准株TSP1基因序列(EG_11043)同源性为98.99%,其推导的氨基酸序列同源性为98.48%;TSP6 c DNA全长666个核苷酸,编码221个氨基酸,该多肽含有5个N端酰基化位点,1个酪氨酸激酶磷酸化位点,与已登录的标准株TSP6基因序列(EG_00715)同源性为98.18%,其推导的氨基酸序列同源性为85.07%。运用分子生物学软件对Eg TSP1和TSP6基因进行生物信息学分析,预测已知序列的蛋白质抗原的结构和表位,为疫苗的研发奠定了前期基础。     

中间锦鸡儿WRKY12基因克隆与生物信息学分析

WRKY转录因子是植物信号网络中不可缺少的部分,是最大的调节子家族之一。本研究从中间锦鸡儿干旱转录组及基因表达检测数据中,挑选出对干旱、冷、盐、碱及ABA都响应明显的CiWRKY12基因,对其进行克隆及生物信息学分析。结果显示:CiWRKY12基因的开放阅读框为696 bp,编码232个氨基酸,含有一个典型的WRKY保守结构域,属于GroupⅡc亚族。对转录因子CiWRKY12与其它8种植物的同源蛋白的理化性质和一、二、三级结构进行生物信息学比较分析,发现这9个蛋白无规则卷曲比例较高,大部分属于不稳定蛋白;亚细胞定位预测表明大部分的蛋白定位于细胞核内;多重序列比对显示WRKY保守结构域保守性很高,其三级结构上也呈现较高的相似性,推测这9个转录因子可能具有相似的转录调控功能。通过本研究生物信息学分析将有助于对CiWRKY12深层次功能研究提供借鉴作用。