青稞幼苗期叶片中 SBEⅡa基因的克隆及其表达分析

为进一步研究淀粉分支酶(Starch branching enzyme,SBE)在青稞叶片淀粉代谢中的作用,以青稞品种喜马拉雅2号和康青1号为材料,通过同源克隆技术分离 SBEⅡa基因,并对分离得到的 SBEⅡa基因进行生物信息学分析,同时利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术和淀粉分支酶活性测定试剂盒分析了在高温、低温和盐胁迫条件下 SBEⅡa基因的表达情况和SBEⅡa蛋白酶活性的变化情况。结果表明,从喜马拉雅2号和康青1号克隆得到的 SBEⅡa基因ORF区为2466 bp,编码821个氨基酸。生物信息学分析表明,该基因编码的蛋白质分子量为92.09 kDa,预测等电点(pI)为5.4,是酸性蛋白;该蛋白酶的不稳定系数为38.03,属于稳定蛋白;参试材料与大麦的亲缘关系最近,与细江蓠的亲缘关系最远。qRT-PCR和蛋白酶活性测定结果表明, SBEⅡa基因在不同环境下表达水平和SBEⅡa蛋白酶活性变异具有高度的正相关性,在不同环境和不同材料之间没有明显差异。     

香蕉NPR1基因的克隆及植物表达载体构建

病程相关基因非表达子(NPR1)是植物抗病信号传导的关键基因。以香蕉抗病香蕉品种为材料,根据NPR1基因序列在保守区设计引物,从香蕉cDNA中克隆获得NPR1基因片段,以RACE的方法克隆获得香蕉NPR1基因的全长,并命名为GCT119-NPR1。香蕉GCT119-NPR1基因最大阅读框(ORF)为1 707 bp。生物信息学分析结果表明,该基因含有ANK和BTB两个结构域,其中ANK结构域是NPR1基因中非常重要的结构域,在蛋白质相互作用中起着至关重要的作用。同源性分析表明,该基因与已克隆发表的NPR1基因氨基酸序列同源性为67%~82%。将其构建植物表达载体,为下一步转化工作奠定基础。     

红色荧光蛋白基因银耳表达载体的构建及表达鉴定

以pET-28a-RFP质粒为模板,PCR扩增红色荧光蛋白(red fluorescent protein,RFP)基因,并克隆到真核表达载体pTE11上,置于RP27启动子调控之下,成功构建表达载体pTE11-RFP。采用PEG介导转化法,将pTE11-RFP转入银耳芽孢中。提取转化子基因组DNA,RFP基因特异性引物扩增获得与目的基因大小一致的特异条带;日光下肉眼观察转化子略显红色,荧光显微镜观察有明显的红色荧光。以上结果证明RFP基因已成功转入银耳芽孢并进行表达,RP27启动子可以调控外源基因RFP在银耳芽孢中的正确表达,为进一步研究外源基因在银耳芽孢生物反应器中的高效表达奠定了一定的基础。     

香蕉Maasr1基因RNAi植物表达载体的构建及鉴定

以香蕉Maasr1基因为目的基因,载体pBS为中间载体,pBBB、pBI121为表达载体,分别构建含有Maasr1基因的RNAi植物表达载体DBBB-S-I-A和含有Maasr1基因正义片段的植物表达载体pBl121-S,并通过农杆菌介导的方式对构建的该RNAi载体沉默效果进行鉴定.结果表明:(1)利用中间载体pBS和植物表达载体pBBB成功构建了香蕉Maasr1基因的RNAi植物表达载体pBBB-S-I-A;(2)利用载体pBI121成功构建了1个含有Maasr1基因正义片段的植物表达载体pBI121-S:(3)构建的RNAi载体pBBB-S-I-A可以抑制Maasr1基因的表达,具有较好的沉默效果.     

青稞法尼基转移酶β亚基编码基因HbERA1的克隆及表达分析

ERA1(Enhanced response to ABA)基因编码法尼基转移酶(Farnesyl transferase)β亚基,该酶在干旱胁迫下对ABA信号负向调控因子的修饰起着关键作用。本研究以青稞(Hordeum vulgare subsp.vulgare)抗旱品种喜马拉雅10号为材料,利用RT-PCR技术克隆获得了ERA1基因全长cDNA序列,命名为HbERA1(登录号:KJ699392)。生物信息学分析表明,该基因全长1 401bp,可编码466个氨基酸序列,蛋白分子量为51.14kD,等电点为5.00。Prosite Scan分析结果表明,HbERA1含有多个干旱胁迫响应蛋白的作用位点,如酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点、N-糖基化位点、蛋白激酶C磷酸化位点及N-豆蔻酰化位点。利用实时定量PCR方法研究了HbERA1在干旱胁迫条件下及复水后不同时间点的表达情况,发现在水分过剩处理下(土壤绝对含水量15.5%),HbERA1在土壤绝对含水量为33.4%时表达量最高,并随着土壤绝对含水量的下降而下调表达;进行干旱胁迫后(15.5%)基因表达量也明显下调表达;复水后表达逐渐恢复,复水8h时超过正常表达水平,表明HbERA1基因可能参与调控水涝和干旱胁迫双重信号传导。     

花生转录因子LEC1的表达特性分析

LEC1是调控植物胚形成和发育的重要转录因子.本研究根据已获得的花生AhLEC1基因序列,利用原核表达分析和实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术初步验证其在花生中的生物学功能.结果表明:①原核表达分析显示,获得了分子量为25 kD左右的目的蛋白条带,与预期大小一致.②组织表达分析显示,AhLEC1基因在花生的花及果...     

CryIA(c)和gna融合基因植物表达载体的构建

采用重叠延伸PCR技术(gene splicing by overlap extension PCR,简称SOE PCR),通过连接多肽FMDV2A序列将CryIA(c)和gna基因相融合,得到CryIA(c)-2A-gna抗虫融合基因。并进一步将玉米UBI启动子和融合基因(CryIA(c)-2A-gna)分别连接到植物表达载体pCAMBIA3300上,构建成由玉米UBI启动子驱动抗虫融合基因的植物表达载体pNUBG。经过限制性酶切分析鉴定,结果表明,含有融合基因的植物表达载体构建成功。     

中国水仙NtMYB1基因的克隆及表达分析

为研究调控花青素合成机制,利用RT-PCR和RACE技术从中国水仙‘金盏银台’（Narcissus tazetta var. chinensis‘Jinzhan Yintai’.）的花瓣和副冠中克隆得到一个MYB基因的cDNA序列,命名为NtMYB1,在GeneBank上登录号为KC763973。序列分析表明,NtMYB1基因全长842 bp,其中开放阅读框长681 bp,编码226个氨基酸,推测的蛋白分子量为25.2 ku,理论等电点为7.94。NtMYB1具有明显的R2R3-MYB结构域,且在R3结构域的下游含有一个相对保守的PDLNLDLSIG氨基酸基序。同源性分析表明,其编码的氨基酸序列与陆地棉、甜樱桃的MYB蛋白相似性分别达到65％和63％。利用实时荧光定量PCR技术检测NtMYB1基因在中国水仙花不同发育时期和部位的表达水平,分析结果表明,NMYB1基因在中国水仙成花不同时期均有表达,但表达量具有明显差异,其中NtMYB1基因在花蕾期的相对表达量约为花苞期的40倍,且其表达量在花瓣要高于副冠。推测NtMYB1可能参与调控花青素合成基因的转录沉默。     

山羊GDF-8基因的表达差异与发育性变化分析

为探索GDF-8基因在山羊不同生长阶段的肝脏、心脏、肾脏、脂肪和骨骼肌中mRNA表达发育性变换规律,采用SYBR Green实时荧光定量PCR技术对2月龄、3月龄和4月龄的海南本地山羊进行检测。结果显示,GDF-8基因在3月龄的心脏组织中mRNA表达量最高,其次是肾脏和骨骼肌;在2月龄和4月龄时5种组织中GDF-8基因表达量较低,尤其是在心脏组织中几乎不表达;在肝脏和脂肪中的表达依次为4月龄＞2月龄＞3月龄,且各月龄之间表达差异极显著(p＜0.01);心脏、肾脏和骨骼肌的表达依次为3月龄＞4月龄＞2月龄,其中,肾脏在不同月龄段表达差异极显著(p＜0.01),而心脏和骨骼肌在2月龄和4月龄之间表达差异不显著(p＞0.05)。     

大豆抗病相关基因SR1正反义植物表达载体的构建及遗传转化研究

实验构建了CaMV35S启动子控制下的大豆抗病相关基因SR1的正反义植物双元表达载体pBISR1( )和pBISR1(-).通过根癌农杆菌叶盘转化法,将正义和反义SR1基因导入烟草Ha-vana 425,经卡那霉素筛选,获得了抗性植株.经PCR和PCR-Southern印迹分析,证明抗性植株中整和了SR1基因,RT-PCR分析进一步表明正义和反义基因皆能转录为完整的mRNA,经疫霉根腐接种及抗病性鉴定表明,转反义基因株系和未转基因株系均轻微感病,而转正义基因株系始终没有出现感病症状.     

青稞HvnWRKY26基因的克隆及表达分析

WRKY家族转录因子广泛参与植物的生物和非生物胁迫过程。为探索WRKY家族转录因子在青稞抗条纹病过程中的作用,本课题组前期利用条纹病菌分别侵染抗病青稞品种昆仑14号和感病品种Z1141,并进行转录组测序,发现一个在侵染时期差异表达的WRKY基因家族成员。序列分析发现,该基因的开放阅读框为765 bp,可编码255个氨基酸,具有典型的WRKY结构域,属于WRKY基因家族。Uniprot注释结果表明,该蛋白为HvnWRKY26。启动子区域预测表明,该区域含有脱落酸和茉莉酸响应元件以及与干旱、低温、盐胁迫和防御应激等逆境胁迫相关的顺式作用元件。序列比对分析显示,HvnWRKY26蛋白与其他物种中同源蛋白的氨基酸序列一致性均不高,但该蛋白与大麦HvWRKY26蛋白的WRKY结构域序列完全相同。系统进化分析表明,青稞HvnWRKY26与大麦WRKY26的亲缘关系最近;进一步对HvnWRKY26及与其亲缘关系较近的大麦、玉米、水稻WRKY蛋白进行进化分析,发现这些WRKY蛋白被分为A、B和C三大类,其中HvnWRKY26蛋白属于A类。RNA-seq和qRT-PCR分析结果表明,青稞在遭受条纹病菌侵染时,HvnWRKY26基因的相对表达量在抗病品种昆仑14号和感病品种Z1141中均显著上调表达,且抗病品种的表达量显著高于感病品种,推测HvnWRKY26基因在青稞抗条纹病过程中发挥重要作用。     

青稞F7-OMT基因的克隆及原核表达分析

类黄酮7-O-甲基转移酶(F7-OMT)具有甲基转移酶功能,能催化底物类黄酮甲基化产生植物抗毒素,提高植物的抗菌性。为了给进一步研究该酶蛋白的功能奠定基础,以青稞"94-19-1"为材料,采用同源克隆方法得到青稞F7-OMT基因编码片段。生物信息学分析表明,青稞F7-OMT开放阅读框(ORF)全长为1173bp,编码390个氨基酸,蛋白分子质量为42 207.8Da,等电点pI为5.36,无信号肽序列,具有甲基转移酶2(Methyltransf_2,pfam00891)和二聚化(Dimerization,pfam08100)保守域。通过亚克隆将F7-OMT连接到表达载体pET-32a上,构建pET-32a-F7-OMT融合表达载体,在E.coli BL21(DE3)pLysS中诱导表达,并采用亲和层析纯化法得到纯化蛋白。     

青稞叶绿体基因RNA编辑位点的预测、鉴定与比较分析

为了阐明青稞叶绿体基因组RNA编辑位点的组成与特性,首先利用生物信息工具对青稞叶绿体基因的RNA编辑位点进行了预测,结果发现了35个分布于15个基因的编辑位点,所有编辑均为C到U的转换,其中基因ndhB包含的编辑位点数量最多,达9个,这与其他麦类作物相似;进一步利用RT-PCR结合克隆测序,对预测的35个位点进行了实验验证,发现18个编辑位点被证实发生了C到U的编辑;对编辑前后编码蛋白质的结构进行了比较分析,发现RNA编辑引起了编码蛋白的结构变化,暗示RNA编辑可以造成编码蛋白功能的改变。最后,将青稞叶绿体基因RNA编辑位点与栽培大麦、野生大麦的叶绿体RNA编辑位点进行了比较,发现青稞与栽培大麦的RNA编辑组成完全一样,而野生大麦缺失了 ndhA-563位点,初步印证了大麦的起源进化关系。     

裸大麦突变体Ynbs-1的分枝穗特性及其遗传分析

为了解裸大麦突变体重要种质Ynbs株系的分枝穗特性及其遗传基础,在花后7d,调查了Ynbs-1突变体及其重组自交系(正常六棱穗)等材料的正、反杂交F1植株的穗分枝特性,分析了F2及其F3群体中正常穗与分枝穗植株的分离状况,检测了穗分枝基因连锁SSR标记和小穗轴短毛标记状况。结果表明,Ynbs-1的分枝穗长度、分枝穗数和分枝穗轴节数平均值分别为1.48±0.09cm、23.56±1.52个和1.32±0.63个,均极显著高于RIL。Ynbs-1与RIL-1正、反杂交F1及Ynbs-1(母本)与BDM-8的杂交F1植株均无分枝。Ynbs-1(母本)与RIL-1和BMD-8的杂交F2群体的分枝穗与正常穗植株的个体数之比均符合1∶3,纯合分枝穗、杂合正常穗和纯合正常穗的个体数之比均符合1∶2∶1。Ynbs-1的穗分枝基因与3个SSR标记(HVM40-190bp、Bmag0023-110bp、Bmag0508A-170bp)和小穗轴短毛基因均不连锁。Ynbs-1株系的分枝较多,其穗分枝遗传受1对隐性核基因控制,该基因与穗分枝突变体Prbs、F151和Foma的均不等位。     

青稞4-香豆酸辅酶A连接酶基因4CL的克隆及表达分析

为了进一步了解4-香豆酸辅酶A连接酶(4-coumarate:CoA ligase;4CL)基因在黄酮合成中的作用,利用RT-PCR和cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends,RACE)获得了青稞4CL基因(Hv4CL)的cDNA全长序列,并利用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)技术,对该基因在青稞4个胚乳发育时间段茎、叶和花中的表达情况进行研究。结果表明,Hv4CL基因cDNA序列全长2 107bp,该序列包含一个完整的开放阅读框(ORF,1 662bp),编码553个氨基酸。Hv4CL与小麦同源性最高(96%),且该蛋白序列中包含2个保守的box,即AMP结合盒:boxⅠ(SSGTTGLPKGV)和boxⅡ(GEICIRG)。qRT-PCR分析结果表明:4CL基因在青稞不同发育时期、不同组织的表达丰度不同,在茎中表达量最高,其次是叶和籽粒。     

青稞籽粒阿拉伯木聚糖含量的遗传分析

为了解青稞籽粒阿拉伯木聚糖的遗传特性,以喜马拉雅8号和藏青320及二者构建的F_1和F_2群体为材料,使用主基因+多基因模型,对青稞籽粒总阿拉伯木聚糖含量、水溶性阿拉伯木聚糖含量、不溶性阿拉伯木聚糖含量及不溶性阿拉伯木聚糖/水溶性阿拉伯木聚糖比值进行了遗传分析。结果表明,青稞籽粒总阿拉伯木聚糖含量与不溶性阿拉伯木聚糖含量显著相关,而与水溶性阿拉伯木聚糖含量相关不显著。籽粒总阿拉伯木聚糖符合1对显性-加性主基因+多基因遗传模式。不溶性与水溶性阿拉伯木聚糖及不溶性与水溶性阿拉伯木聚糖之比均受2对主基因+多基因调控,只是主基因的作用方式存在着差异。控制水溶性阿拉伯木聚糖和不溶性阿拉伯木聚糖含量的主基因加性效应均为负值,可能为负调控因子。除调控水溶性阿拉伯木聚糖含量的主基因加性效应较小外,其余性状的主基因加性效应均较大。各性状的主基因遗传率都较高,为62.5%~88.49%。     

覆膜种植方式对西藏青稞光合特性及产量的影响

为筛选西藏地区青稞高产栽培的最佳覆膜种植方式,在西藏自治区日喀则市边雄乡,通过随机区组试验,以当地农民传统条播种植为对照(CK),比较分析了渗水地膜覆盖穴播(SS)、降解地膜覆盖穴播(JJ)、普通地膜覆盖穴播(PT)、垄膜条播(LT)、垄膜带状播种(LD)方式下青稞的光合特性、产量及其构成的差异。结果表明,与CK相比,5种覆膜种植方式下青稞叶片相对叶绿素含量、净光合速率、气孔导度、蒸腾速率均不同程度提高,其中LD处理总体上保持最优。JJ、SS、PT、LT、LD处理的平均产量分别达4 560、4 425、4 335、4 635和4 740kg·hm~(-2),均显著高于CK,其中LD处理的增产幅度达到61.69%。因此,在本试验条件下垄膜带状播种是西藏地区高产栽培的最佳覆膜种植方式。     

青稞主要性状的差异性与遗传分析

为合理评价110份青稞品种(系)的农艺性状及遗传特性,对参试种质材料的株高、穗长、穗粒数、分蘖数和千粒重进行了调查统计,同时用分布于大麦全基因组的48对SSR标记进行了遗传多样性分析。结果表明,参试材料各农艺性状变异较大,变异系数为2.92%~42.33%,其中株高、穗长、分蘖数、穗粒数和千粒重变化范围分别为53~122cm、2.5~7cm、2~19个、20~90粒和25.46~60.34g。SSR标记共检测到168个等位变异,变化范围为2~6个。110份青稞种质材料分成三大类群。SSR标记的1 128个位点成对组合中,不论是共线性成对组合还是非共线性成对组合,都存在一定的连锁不平衡(linkage disequilibrium,LD)。D′统计概率(P0.01)支持的LD成对位点438个,占全部位点的38.8%,D′的平均值为0.36,整体LD水平较高。较高水平的LD位点(D′0.5)主要分布在2H、4H、6H和7H连锁群上。     

小麦 TaWIN1基因的克隆和表达分析

14-3-3蛋白家族在植物生长发育和逆境胁迫响应中发挥着重要作用。 TaWIN1基因是小麦14-3-3基因家族成员之一,为了进一步了解该基因的功能,本研究以普通小麦中国春为材料克隆了 TaWIN1基因并进行了生物信息学分析和表达分析。结果表明, TaWIN1基因含有801 bp的开放阅读框,编码266个氨基酸,含有完整的14-3-3蛋白家族结构域;该基因的编码蛋白为酸性蛋白,不具有跨膜区,可能定位于细胞质;进化分析显示,小麦TaWIN1蛋白与大麦14-3-3E、二穗短柄草GF14-D的亲缘关系最近; TaWIN1基因在小麦不同发育时期和不同组织中均有表达,但在10 mm幼穗中的相对表达量最高,其次为苗期叶片和旗叶,在根中表达量最低;根中 TaWIN1基因在干旱、高温、低温和盐胁迫下均显著上调表达;叶片中 TaWIN1基因在干旱、低温和盐胁迫下均显著上调表达,而在高温下则显著下调表达。     

基于速冻青稞鱼面加工的青稞品种适宜性评价体系构建

为寻求速冻青稞鱼面加工品质的客观评价方法,筛选适宜加工速冻青稞鱼面的优良青稞品种,选取10个青稞品种,根据主成分分析和灰色关联度筛选关联度较大的核心青稞理化指标作为自变量,以PLS方法建立评价模型筛选适宜速冻青稞鱼面加工的品种。结果表明:(1)与成品鱼面品质综合评分关联度较大的7个青稞理化指标是蛋白质含量、灰分含量、总淀粉含量、直链淀粉含量、β-葡聚糖含量、b值、水分含量,其中,青稞蛋白质含量关联度最大(0.703);(2)基于青稞籽粒理化指标的速冻青稞鱼面品质预测模型预测效果良好,可靠性较高;(3)适宜鱼面加工的青稞籽粒理化指标最佳取值范围:直链淀粉含量26.02%～28.97%,总淀粉含量60.56%～63.17%,蛋白质含量9.02%～10.61%,灰分含量1.13%～1.39%,水分含量9.83%～11.46%,β-葡聚糖含量6.00%～7.96%,b值12.27～18.15。