自体骨髓间充质干细胞对异基因猪移植肝的保护作用

摘要 目的 研究自体骨髓间充质干细胞术中经门静脉输注对异基因小型猪移植肝脏的保护作用.方法 建立异基因猪肝移植急性排斥反应模型, 实验分对照组和处理组,对照组只做原位肝移植,处理组在原位肝移植的基础上,术中经门静脉注射一定数量预先制备的受体自身骨髓间充质干细胞,术后1d,3d,6d静脉采血检测肝功能,并做肝组织的病理活检 ,并观察受体的生存时间. 结果 1、处理组中受体的生存时间明显比对照组的延长P<0.001。2、肝功能变化：术前两组血清AST、ALT比较尚无统计学差异（p>0.05）,术后处理组受体血清中AST,AL T总体变化明显低于对照组,两组比较有显著的统计学差异P<0.01;3、组织病理变化：处理组在术后7天病理活检见：大致呈正常肝脏病理, 肝组织轻度淤血,血管周围少量炎性细胞浸润, 少数汇管区小静脉或肝静脉内皮细胞下淋巴细胞浸润,肝细胞点状坏死,中性粒细胞浸润. 而对照组在术后3天移植的肝脏中出现汇管区大量炎症细胞聚集,肝细胞浑浊,气球样变性并出现不同程度的点状、灶状坏死。结论 自体骨髓间充质干细胞经门静脉输注能够保护移植的肝脏,延长受体的存活时间.     

经静脉骨髓基质干细胞移植治疗大鼠急性心肌梗死

目的:探讨急性心肌梗死(MI)早期经静脉途径移植骨髓基质干细胞(MSCs)对心肌梗死的影响。方法: 26只雄性SD大鼠随机分为Ⅰ组(MI+MSCs,n=10)、Ⅱ组(MI+PBS缓冲液,n=8)和Ⅲ组(假手术组,n=8),通过 结扎冠状动脉前降支制作心肌梗死模型。同种异体大鼠MSCs体外培养扩增,标记并通过尾静脉于MI后1d移植入 体内。分别进行心脏超声检查、血流动力学测定评价心功能,并行免疫组织化学分析。结果:MSCs移植3周后,Ⅰ组大 鼠心功能较Ⅱ组明显改善(P<0.05),其中Ⅰ组大鼠心功能较移植前也有明显改善(P<0.001),但Ⅱ组心功能则较移植 前进一步降低(P<0.001);免疫组化分析表明部分MSCs迁移至梗死心肌周围并存活下来,分化为心肌细胞。结论: 心肌梗死后1d,经静脉移植的MSCs可归巢至梗死心肌处,并分化为心肌细胞,从而改善损伤的心功能。     

大鼠骨髓间充质干细胞向成肌细胞诱导分化的研究

目的研究5-氮杂胞苷诱导大鼠骨髓间充质干细胞向成肌细胞方向分化的最佳诱导浓度及诱导后细胞的活性,以得到稳定分化的成肌细胞.方法应用不同浓度的5-氮杂胞苷进行定向诱导分化,3H-TdR掺入试验检测诱导后细胞的活性状况,筛选出最佳的时相-浓度结合点,通过免疫组化鉴定分化结果.结果在10μmol/L5-氮杂胞苷诱导培养后15d细胞活性较好,免疫组化技术鉴定其已向成肌细胞方向分化.结论10μmol/L5-氮杂胞苷可成功诱导其向成肌细胞分化.为临床上以细胞注射治疗女性压力性尿失禁提供实验依据.     

骨髓间充质干细胞移植对急性期脑梗死大鼠的干预作用

目的观察骨髓间充质干细胞(BMSCs)移植对急性期脑梗死大鼠的干预作用。方法按随机化原则将50只脑梗死大鼠模型随机分为BMSCs移植组、上清液移植组各22只及对照组6只。BMSCs组在脑梗死大鼠模型成功后3 h经静脉注入BMSCs 1 ml,上清液组注入上清液1 ml,对照组注入磷酸盐缓冲液(PBS)1 ml。术后28 d检测PBMSc在脑内的存活转化情况。分别于0、7、14及28 d观察记录各组大鼠的神经损伤严重程度评分(NSS)。结果 28 d后,BMSCs脑梗死灶边缘可见少量BrdU阳性细胞表达神经元特异性烯醇化酶(NSE),而上清液组及对照组病灶边缘则无NSE;细胞移植后,各组神经功能均有不同程度的恢复;从第7天起,BMSCs移植组NSS评分明显低于上清液组及对照组(P<0.05),而后2组之间差异无统计学意义(P>0.05)。结论骨髓间充质干细胞移植入急性脑梗死大鼠体内后,可存活、移行至梗死灶周围,并分化为神经元细胞,而且能够减轻脑梗死大鼠的神经损伤程度。     

大鼠骨髓间质干细胞体外诱导分化为神经细胞

目的探讨体外β-巯基乙醇(BME)、正规胰岛素(R I)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)诱导大鼠骨髓间质干细胞(MSCs)分化为神经元样细胞的作用。方法取体外扩增至3~4代的大鼠MSCs,分别用BME、R I和bFGF诱导,另设空白对照。诱导后1、5、24 h,计算神经元样细胞的分化率,分别鉴定神经元烯醇化酶(NSE)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达。结果诱导后1 h,BME组分化率最高,5 h时bFGF组分化率最高,与其他组有显著差异(P<0.01);BME组和R I组各自1 h与5 h的分化率有显著差异(P<0.01);bFGF组5 h和24 h的分化率与1 h的分化率有显著差异(P<0.01),但5 h和24 h的分化率无显著差异(P>0.05)。结论抗氧化剂和神经营养因子能诱导MSCs分化为神经元样细胞,而且具有较高的诱导效率。胰岛素的作用较弱;BME的诱导作用快而短暂;bFGF的诱导作用缓和而持久。     

受体特异性骨髓干细胞诱导肝移植大鼠长期存活的研究

目的 研究受体特异性骨髓干细胞在大鼠移植肝中的诱导分化情况及对大鼠长期存活的影响.方法 雌性受体SD大鼠随机分成空白对照组、D-hanks液组、间充质干细胞组、造血干细胞组.空白对照组仅行原位肝移植术;D-hanks液组在肝移植术后大鼠门静脉注射D-hanks液0.5ml;间充质干细胞组在肝移植术后大鼠门静脉注射雄性SD大鼠骨髓问充质干细胞0.5ml(5×105个/mL);造血干细胞组注射骨髓造血干细胞0.5ml(5×105个/mL).观察大鼠的中位生存时间及术后60d Sry基因原位杂交和白蛋白免疫组化双标检测观察骨髓干细胞的分化情况.结果 间充质干细胞组、造血干细胞组中位生存时间分别为大于180 d、102d,较空白对照组、D-hanks液组明显延长(P＜0.05);间充质干细胞组又较造血干细胞组明显延长(P＜0.05);间充质干细胞组、造血干细胞组Sry基因原位杂交和白蛋白免疫组化双标检测呈阳性,且双阳性细胞百分率间充质干细胞组高于造血干细胞组(P＜0.05).结论 受体特异性骨髓干细胞能诱导大鼠肝移植术后长期存活,并能在移植肝的环境中诱导分化为肝细胞,表达白蛋白,并逐渐替代移植肝本身的细胞;间充质干细胞在移植肝内诱导分化为肝细胞并替代的能力较强;移植的肝脏被受体特异性骨髓干细胞分化来的肝细胞替代,是大鼠长期存活的可能原因.     

大鼠骨髓间质干细胞体外诱导分化为神经细胞

目的探讨体外β-巯基乙醇(BME)、正规胰岛素(RI)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)诱导大鼠骨髓间质干细胞(MSCs)分化为神经元样细胞的作用.方法取体外扩增至3～4代的大鼠MSCs,分别用BME、RI和bFGF诱导,另设空白对照.诱导后1、5、24 h,计算神经元样细胞的分化率,分别鉴定神经元烯醇化酶(NSE)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达.结果诱导后1h,BME组分化率最高,5 h时bFGF组分化率最高,与其他组有显著差异(P＜0.01);BME组和RI组各自1h与5h的分化率有显著差异(P＜0.01);bFGF组5 h和24 h的分化率与1 h的分化率有显著差异(P＜0.01),但5 h和24 h的分化率无显著差异(P＞0.05).结论抗氧化剂和神经营养因子能诱导MSCs分化为神经元样细胞,而且具有较高的诱导效率.胰岛素的作用较弱;BME的诱导作用快而短暂;bFGF的诱导作用缓和而持久.     

大鼠骨髓间充质干细胞向脂肪细胞诱导分化的研究

目的探讨大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）的分离纯化和定向成脂诱导。方法采用密度梯度离心法分离纯化骨髓间充质干细胞,免疫组织细胞化学法检测BMSCs表面抗原。脂肪诱导剂诱导BMSCs分化为脂肪细胞,利用油红O染色进行检测。结果免疫组织细胞化学检测结果显示,BMSCs表达CD29、CD44、CD90、CD106,不表达CD34、CD45。BMSCs经脂肪诱导剂诱导后,油红O染色阳性。随着诱导时间的延长,油红O阳性细胞比例增加。结论体外培养的BMSCs在一定诱导条件下能够向脂肪细胞分化,并且随着诱导时间的延长,脂肪细胞比例不断增加。     

骨髓间质干细胞移植治疗大鼠实验性肺动脉高压

目的 探讨骨髓间质干细胞(MMSC)移植治疗肺动脉高压(PAH)的疗效和机制.方法 体外分离培养SD大鼠骨髓MMSC,以Hoechst 33342荧光染料标记.80只SD大鼠随机分为PAH组(30只)、PAH+MMSC移植组(移植组,30只)和正常对照组(对照组,20只).采用一次性注射野百合碱50 mg/kg的方法制备PAH模型.移植组于建模第22天舌下静脉注射5×106/ml的MMSC细胞悬液1 ml,其他2组同时间注射等量细胞培养液.饲养4周,观察各组大鼠一般情况计算生存率.实验第21天每组各处死4只大鼠,实验第49天处死所有存活大鼠,测定肺动脉平均压(mPAP)、右心室肥大指数,并取肺组织做肺小动脉形态计量学指标检测、血管Ⅷ因子相关抗原免疫组织化学染色和微血管密度分析.结果 实验结束时PAH组和移植组大鼠生存率分别为50%(15/30)和90%(27/30,P<0.01).第21天PAH组和移植组mPAP分别为(39.1±2.5)和(38.5±2.1)mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa);右心窒肥大指数分别为(34.0±3.1)%和(33.8±2.6)%,均明显高于对照组[(15.2±1.7)mm Hg,(22.7±1.5)%,均P<0.01)].第49天,PAH组和移植组mPAP分别为(42.7±2.3)和(24.7±2.1)mm Hg,右心窜肥大指数分别为(45.1±3.4)%和(38.8±3.2)%,移植组均明显低于PAH组(均P<0.01);与PAH组比较,移植组肺小动脉形态计量学指标明显改善.荧光显微镜观察显示荧光标记MMSC在肺内定植且分化成大量新生血管并形成侧支循环,肺动脉重构得到有效逆转.免疫组组织化学染色观察证实移植组大鼠肺组织中有大量新生血管形成,微血管密度明显高于PAH组[(5.2±0.8)比(1.4±0.5)个/高倍视野,P<0.01].结论 MMSC移植可通过分化形成新生血管和修复损伤肺小动脉,逆转肺血管重构,降低肺动脉压,有效减轻甚至是逆转野百合碱诱导的PAH进程.     

体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞定向分化肝样细胞

目的观察骨髓间充质干细胞体外诱导分化为肝样细胞。方法自大鼠的股骨中提取骨髓细胞,利用 Percoll 法行骨髓间充质干细胞分离、纯化。取第3代的骨髓间充质干细胞,应用肝细胞生长因子(HGF)20ng/ml 表皮生长因子(EGF)1.5μg/ml 联合诱导。两周后免疫荧光染色及逆转录-多聚酶链反应(RT-PCR)鉴定诱导后细胞白蛋白的 mRNA 的表达。结果诱导分化一周骨髓间充质干细胞变为圆形,两周后免疫荧光染色可见肝细胞标志物 CK18和白蛋白表达,RT-PCR 检测有白蛋白的 mRNA 的表达。结论骨髓间充质干细胞体外诱导能定向分化为肝样细胞。     

菲立磁标记的大鼠骨髓基质干细胞在同种异体移植鼠肝脏中的追踪观察

目的:研究菲立磁标记的大鼠骨髓基质干细胞(BMSCs)在同种异体移植鼠肝脏中的追踪方法. 方法:采用菲立磁(Feridex)对分离培养的BMSCs进行标记,Prussian blue染色和电镜观察对标记后的BMSCs进行鉴定;取鉴定后的BMSCs 2 mL(1×109/L)分别注射到SD异体大鼠的门静脉、肝局部实质、尾静脉内;采用磁共振成像(MRI)技术(SE-T2WI,FSE-T2WI,GRE-T2WI序列)分别对移植前6 h,移植后6 h,1,3和5 wk时的大鼠肝脏进行扫描. 结果:Prussian blue染色证实Feridex标记BMSCs阳性率＞90%,透射电镜见铁颗粒位于BMSCs胞质中;MRI扫描 SE-T2WI序列成像显示:各移植组在移植前肝脏均未见异常低信号区;门静脉组大鼠移植后6 h在肝门部可见异常的低信号改变,1,3 wk低信号改变范围逐渐扩大,第5周时低信号改变消失;肝内注射组大鼠移植后6 h在肝脏局部注入区域可见异常的低信号改变,1,3,5 wk低信号改变区域逐渐扩大. 尾静脉组在移植后各时间点均未见到异常低信号改变. 结论:Feridex标记的大鼠BMSCs在同种异体移植鼠肝脏中可用MRI进行有效的追踪.     

T细胞分化群40补体免疫球蛋白基因修饰骨髓间充质干细胞在肝移植排斥反应中的作用

目的探讨T细胞分化群40补体免疫球蛋白(CD40LIg)基因修饰骨髓间充质干细胞(MSCs)肝移植排斥反应中的作用。方法采用双袖套法建立DA-Lewis大鼠原位肝移植模型,经门静脉输注CD40LIg基因转染的MSCs,观察大鼠肝移植术后肝功能的变化、生存情况和移植肝病理形态学的改变,检测肝移植大鼠干扰素(INF-γ)和白细胞介素4(IL-2)水平的变化。结果(1)基因转染MSCs组生存时间显著长于对照组、单纯MSCs组和基因转染组,而单纯MSCs组和基因转染组又较对照组显著延长(P<0.05)。(2)对照组谷丙转氨酶(ALT)、总胆红素(TBil)、IL-2和INF-γ水平在肝移植术后急剧升高,各时段均显著高于3个治疗组(P<0.05);(3)肝脏组织病理检查,对照组呈重度排斥反应,单纯MSCs组和基因转染组为轻度排斥反应,而基因转染MSCs组无明显排斥反应。结论 CD40LIg基因修饰MSCs可以延长肝移植大鼠的存活时间,抑制大鼠肝移植的排斥反应。     

大鼠骨髓基质细胞体外诱导分化的研究

目的:探索骨髓基质细胞体外定向诱导分化为神经细胞的可能性。方法:取大鼠的骨髓基质细胞在体外培养,用免疫组化方法检测正常脊髓提取液和脑源性神经生长因子诱导分化,观察诱导后细胞的形态。结果:骨髓基质细胞在体外培养呈梭形。诱导后细胞呈神经元样细胞改变。神经元烯醇化酶和胶质纤维酸性蛋白染色阳性。结论:骨髓基质细胞可在体外诱导分化。     

骨髓间充质干细胞治疗大鼠白毒伞中毒致急性肝衰竭的效果

目的：探讨骨髓间充质干细胞（BMSCs）治疗大鼠白毒伞中毒致急性肝衰竭的疗效及机制。方法选取10只体重约80 g的雄性清洁级SD大鼠用于BMSCs的培养。另选取体重在220～250 g的成年大鼠45只作为研究对象,用于肝衰竭模型制备以及BMSCs输注治疗。在45只大鼠中随机抽取15只作为空白对照组,剩下的30只均给予白毒伞粗毒素灌胃制备肝衰竭模型,将造模成功的大鼠随机均分为两组,肝衰竭模型组和治疗组（实验BMSCs输注治疗）。对比各组大鼠7 d生存率及肝功能、凝血功能、炎症因子、肝脏病理等指标情况。结果与肝衰竭模型组相比,治疗组SD大鼠体重减轻明显更少,7 d生存率明显更高。移植结束后治疗组大鼠肝功能、凝血功能、炎症因子等指标及肝脏病理均较肝衰竭模型组显著改善（ P＜0.05）。结论 BMSCs输注对白毒伞中毒致急性肝衰竭大鼠具有十分明显的治疗作用,能显著改善大鼠肝功能衰竭。     

Characterization of neural crest-derived stem cells isolated from human bone marrow for improvement of transplanted islet function

Abstract

Background: Murine boundary cap-derived neural crest stem cells (NCSCs) are capable of enhancing islet function by stimulating beta cell proliferation as well as increasing the neural and vascular density in the islets both in vitro and in vivo. This study aimed to isolate NCSC-like cells from human bone marrow.

Methods: CD271 magnetic cell separation and culture techniques were used to purify a NCSC-enriched population of human bone marrow. Analyses of the CD271+ and CD271- fractions in terms of protein expression were performed, and the capacity of the CD271+ bone marrow cells to form 3-dimensional spheres when grown under non-adherent conditions was also investigated. Moreover, the NCSC characteristics of the CD271+ cells were evaluated by their ability to migrate toward human islets as well as human islet-like cell clusters (ICC) derived from pluripotent stem cells.

Results: The CD271+ bone marrow population fulfilled the criterion of being multipotent stem cells, having the potential to differentiate into glial cells, neurons as well as myofibroblasts in vitro. They had the capacity to form 3-dimensional spheres as well as an ability to migrate toward human islets, further supporting their NCSC identity. Additionally, we demonstrated similar migration features toward stem cell-derived ICC.

Conclusion: The results support the NCSC identity of the CD271-enriched human bone marrow population. It remains to investigate whether the human bone marrow-derived NCSCs have the ability to improve transplantation efficacy of not only human islets but stem cell-derived ICC as well.     

硝普钠促进静脉移植BMSCs向溃疡性结肠炎大鼠结肠的迁移

目的:观察硝普钠能否促进静脉移植的大鼠骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)向溃疡性结肠炎(Ulcerative colitis,UC)大鼠结肠的迁移.方法:分离培养、4',6-二脒基-2-苯基吲哚盐酸(4',6-diamidino-2-phenylindo...     

骨髓间充质干细胞培养条件的改良及其定向分化

目的：探讨建立大鼠骨髓间充质干细胞（ BMSCs）快速、有效的体外分离纯化方法。方法全骨髓离心贴壁法分离大鼠BMSCs;分别采用同种异体血清培养基（同种异体血清组）、胎牛血清培养基（胎牛血清组）、无血清培养基（无血清组）培养BMSCs,传代后换用胎牛血清培养;12、24、48、72 h和5 d首次换液;绘制P3代BM-SCs生长曲线;免疫荧光鉴定BMSCs CD44和vimentin的表达;诱导BMSCs的骨向、内皮向分化;茜素红检测钙结节表达;免疫荧光鉴定血管内皮样细胞CD31和vWF的表达。结果（1）同种异体血清组及胎牛血清组细胞形态均一,生长速率相似。（2）P3代BMSCs生长曲线显示：同种异体血清组与胎牛血清组倍增速率相似,均快于无血清组。（3）P3代BMSCs免疫荧光染色显示：同种异体血清组与胎牛血清组CD44、vimentin表达均高于无血清组。（4）成骨诱导14 d后,茜素红染色可见大量橘红色钙化结节形成。（5）内皮诱导14 d后,内皮样细胞表面标志物CD31、vWF阳性。结论改良培养条件后所获得的骨髓细胞具有间充质干细胞的表型和功能特点。     

兔骨髓基质细胞诱导分化成神经元样细胞的研究

目的检测由骨髓基质细胞诱导分化而成的神经元样细胞能否分泌氨基酸类神经生物活性物质成分,从而推断是否具有神经元的生化特征。方法无菌条件下抽取新西兰大白兔骨髓,梯度密度离心分离获取兔骨髓基质细胞(BMSCs),在神经干细胞培养基及细胞因子0.5 μg/ml维甲酸(RA)、20 ng/ml胶质源性神经营养因子(GDNF)于体外诱导分化为神经干细胞及神经元样细胞,采用免疫细胞化学方法进行鉴定,并应用高效液相色谱法(HPLC)检测其氨基酸类生物活性物质的含量。结果BMSCs培养10 d可见细胞大而圆,免疫细胞化学检测Nestin抗原阳性;培养20 d可见具有长突起的神经元样细胞形成,神经元特异烯醇化酶(NSE)免疫细胞化学检查阳性,高效液相检测骨髓源性神经元样细胞含有高浓度的天冬氨基酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)。方差分析显示:随着BMSC培养天数的增加,其所含的Asp、Glu浓度也渐增加,RA GDNF组所含Asp生物活性物质与其余各组比较有显著性差异(P<0.01)。结论兔BMSCs在体外条件下可以增殖分化,增殖细胞表达Nestin,分化的细胞则可表达NSE特异性抗原,并含有高浓度的兴奋性和抑制性氨基酸类神经递质成分;RA和GDNF作为BMSCs的诱导剂,在BMSCs向神经干细胞分化中起有重要的促进作用。