米根霉葡萄糖淀粉酶的分离纯化及特性研究

葡萄糖淀粉酶是米根霉在淀粉质培养基中诱导分泌的一类胞外酶，其表达对米根霉转化淀粉生成L-乳酸的效率，以及L-乳酸分批发酵周期的长短有很大影响。本文对米根霉葡萄糖淀粉酶进行分离纯化，并研究其酶学性质，结论如下：经硫酸铵盐析、透析脱盐、Sephadex G-100柱层析等纯化步骤，葡萄糖淀粉酶比活力提高23倍。SDS-PAGE显示纯化后的酶为一条带，相对分子量约75．5kD。该酶以可溶性淀粉为底物时最适催化反应pH值为4．0～6．0，最适催化反应温度为40-50℃，在50℃下保持稳定。钙离了和锰离子对该酶活力有一定的增强作用，而铅离子和亚铁离子对其活力有明显的抑制作用。     

玉米芯载体固定化米根霉发酵L-乳酸工艺的研究

对玉米芯载体固定化米根霉R-1发酵L-乳酸的工艺条件进行研究。结果表明:玉米芯与葡萄糖的添加比例为1∶4,经L9(34)的正交设计优化,(NH4)2SO4、KH2PO4、Mg-SO4、ZnSO4质量浓度分别3,0.3,0.4,0.2g/L,经48h发酵,L-乳酸积累量达到32.23g/L,葡萄糖对L-乳酸转化率达80.58%。     

米根霉α-淀粉酶基因的克隆与表达

以博德研究公布的米根霉基因组信息为基础设计引物,分别从两株米根霉中克隆得到大小为1 386 bp的α-淀粉酶编码基因。通过比对分析发现该淀粉酶基因内部不含内含子,两条基因的相似度为95.54%,基因编码产物相似度为97.84%。基因编码产物属于淀粉酶家族13成员,具有淀粉酶家族所特有的4个典型的高度保守区域。以质粒载体pET-28a(+)为基础构建相关表达载体,实现了两个淀粉酶在E coli中的功能性表达。两个淀粉酶在E coliBL21(DE3)codon-Plus宿主中的表达量相对较高,分别为1.3 U/mL和0.5 U/mL。其中一个淀粉酶经Ni亲和柱纯化后,用于进行(马铃薯)淀粉水解实验,终产物中葡萄糖质量浓度约为10 g/dL,麦芽糖质量浓度约为74 g/dL,其它低聚糖含量较少。     

玉米芯载体吸附法固定化米根霉发酵L-乳酸的工艺条件

研究玉米芯作为部分替代碳源及载体固定化米根霉R-1发酵L-乳酸的工艺条件,考察玉米芯作为替代碳源的利用率及作为载体的添加比例和最佳粉碎粒度。研究表明：米根霉R-1以玉米芯为碳源,其利用率达14.9%;玉米芯作为部分替代碳源与葡萄糖混合发酵时最佳比例为1:4,此比例下葡萄糖对L-乳酸的转化率高达82.5%,较纯葡萄糖发酵提高了14.6%;玉米芯载体的最佳粉碎粒度为40目,此条件下米根霉R-1发酵混合碳源产酸达到34.68g/L,并形成直径为0.5～1.0mm具有连续发酵能力的固定化菌丝球,连续发酵6批,葡萄糖对L-乳酸的平均转化率为83.1%。由此得出,玉米芯可以作为良好的载体及原料直接发酵产L-乳酸。     

反相HPLC双检测器法同时测定米根霉乳酸发酵液中的有机酸与葡萄糖

提出了用高效液相色谱法同时测定米根霉乳酸发酵液中的有机酸和葡萄糖。用Ｗａｋｏｓｉ－Ⅱ５Ｃ１８ＲＳ（４．６ｍｍ＊１５０ｍｍ,５μｍ）色谱柱,以０．０１ｍｏｌ／Ｌ磷酸水溶液（ＰＨ２．５）为流动相,流速１ｍｌ／ｍｉｎ,利用有机酸及葡萄糖对紫外光吸收强弱的差异,采用双检测器系统,以示差折光检测器检测葡萄糖,以可变波长检测器检测有机酸,一次进样可同时定性及定量分析待测样中的有机酸及葡萄糖,每个样品的分析过程     

米根霉NCU1011发酵豆渣开发甜酱生产工艺研究

文章以米根霉Rhizopus oryzae NCU1011为发酵菌种,采用酱类固态发酵法生产豆渣甜酱。利用单因素优化试验及正交试验,研究豆渣初始水分含量、接种量、发酵时间对豆渣中还原糖、氨基酸态氮含量和感官品质的影响,确定米根霉发酵生产豆渣甜酱的最佳发酵工艺参数为:接种量2.75%、豆渣初始水分含量70%、发酵时间28 h,所得发酵豆渣甜酱中氨基酸态氮、还原糖和可溶性膳食纤维的含量分别提高到0.25%、5.05%、10.5%,口感细腻爽滑,发酵风味浓郁,其营养和食用价值提高,是一种营养丰富、口感风味俱佳的新型高纤维甜酱调味品。     

米根霉产糖化酶发酵条件的研究

以R.SCLG 0319菌株的糖化酶催化活性为指标,研究了发酵时间、温度、装液量、初始pH值及相关金属离子等因素对该菌株发酵产糖化酶活力的影响.结果表明,R.SCLG 0319菌株摇瓶发酵产糖化酶40h为宜,最适发酵温度30℃,装液量100mL/250mL,培养基初始pH值6.0;菌株对低浓度乙醇作用呈现依赖性,培养基中6%vol酒精度时酶活力达到135 U/mL,可耐12%vol酒精度,在高浓度乙醇作用下酶活力迅速下降;Cu2+、Ca2+ 和Mg2+呈现激活效应,其中Mg2+的效应最明显,酶活力增强50%,Fe2+、Zn2+ 和Mn2+呈现出抑制效应,其中Fe2+的抑制作用最大,酶活力降低近80%.     

米根霉原生质体电融合条件研究

以米根霉突变株mut-A、mut-B为亲本,采用双亲灭活标记筛选融合子,对亲本灭活条件、原生质体电融合条件进行了研究。实验结果表明,0.6mol/L山梨醇溶液为最适的渗透压缓冲液,mut-A、mut-B的灭活条件分别为50℃加热6min及紫外照射180s。原生质体在电场中排队所需的细胞浓度为1×107/mL,交变电场电压为8V;最佳的电融合参数为直流脉冲电压260V,脉冲持续时间40μs,脉冲次数2次;最高融合率可达7.29±0.71%。     

反相HPLC双检测器法同时测定米根霉乳酸发酵液中的有机酸与葡萄糖

提出了用高效液相色谱法同时测定米根霉乳酸发酵液中的有机酸和葡萄糖。用Wakosil Ⅱ 5C18RS(4 6mm× 150mm ,5μm)色谱柱 ,以 0 0 1mol/L磷酸水溶液 (pH2 5)为流动相 ,流速 1mL/min ,利用有机酸及葡萄糖对紫外光吸收强弱的差异 ,采用双检测器系统 ,以示差折光检测器检测葡萄糖 ,以可变波长检测器检测有机酸 ,一次进样可同时定性及定量分析待测样中的有机酸及葡萄糖 ,每一样品的分析过程不超过 10min ,对于分析数量较多的样品 ,可及时了解乳酸发酵过程的变化 ,方法的优越性尤为突出     

米根霉发酵生产L-乳酸的动力学研究

本文对米根霉发酵生产L-乳酸的发酵过程进行了研究，分析了过程中的底物消耗，L-乳酸生成与菌体生长之间的关系，初步得出培养条件影响发酵的原因，对L-乳酸发酵有着指导作用。     

Lipase production by Rhizopus oryzae growing on different carbon and nitrogen sources

Nitrogen and carbon sources influencing the growth and production of lipase by Rhizopus oryzae were studied. High yields of enzyme activity were obtained when proteose peptone was the nitrogen source in media with olive oil (MWO) and without olive oil (MWHO). Carbon sources increased lipase activity in MWHO but decreased it slightly in the presence of oil. Lipase activity was significantly (P < 0.5) higher in MWO than in MWHO. Biomass concentration was also higher in the presence of oil. Industrial by-products bran and whey have been used as efficient media for the production of lipase by R oryzae. © 1999 Society of Chemical Industry     

不同中和剂对米根霉发酵产L- 乳酸的影响

在米根霉发酵产L- 乳酸过程中,采用CaCO3 作为中和剂会造成下游分离过程中膜堵塞和环保压力,因此以NH3·H2O 和NaOH 替代CaCO3 作中和剂,对米根霉发酵产L- 乳酸的工艺条件和发酵动力学进行研究。结果表明：添加CaCO3 后L- 乳酸产量平均提高7.3 倍;NaOH、NH3·H2O 作为中和剂的最佳浓度及质量分数分别为10mol/L、25%,以该条件进行发酵72h 得菌丝体小球直径分别为0.2～1.2mm 和1.2～2.2mm,残糖含量分别为2.58g/L 和1.37g/L,L- 乳酸产量分别为74.34g/L 和80.61g/L。     

无载体固定化米根霉半连续发酵产L－乳酸工艺研究?

为了选择米根霉半连续发酵产L-乳酸工艺参数,通过单因素试验和正交试验,对接种量、CaCO3添加时间、温度、装液量及转速进行了优化,并采用培养基重复发酵,建立米根霉半连续发酵工艺。其中摇瓶半连续发酵条件为：孢子接种量4%,种子接种量10%,发酵开始时添加CaCO3,装液量为20%～30%,0～36h时发酵温度28～30℃、36～72h时发酵温度32～34℃,转速200r/min。7L磁力搅拌发酵罐半连续发酵工艺条件为：搅拌转速为300r/min,通气量为1.25L/(L·min),温度为32℃。发酵罐重复发酵稳定,产L-乳酸最高达到86%。为米根霉半连续发酵产L-乳酸的工业化生产提供了研究基础。     

米根霉乳酸脱氢酶的特性研究

乳酸脱氢酶(LDH)是米根霉发酵生产L-乳酸中催化丙酮酸转化成L-乳酸过程的关键酶。本研究从米根霉As3.819中初步分离出乳酸脱氢酶,并结合发酵条件对其酶学特性进行了研究。结果表明,该乳酸脱氢酶的最适反应pH为7.4,最适催化温度为30～50℃。Mg2+、Ca2+对该酶有激活作用,K+、Zn2+对该酶有抑制作用。以NADH和丙酮酸为底物的米氏常数分别为7.22×10-4mol/L和1.24×10-3mol/L。     

Rhizopus oryzae产酸性蛋白酶条件及其酶学性质研究

本文以少孢根霉(Rhizopus oligosporus)为对照研究了豆豉中的一个分离菌株米根霉(Rhizopus oryzae)产生酸性蛋白酶的条件及所产蛋白酶的性质,结果表明这个菌株的产酶条件和蛋白酶的性质与少孢根霉相比有相似性但也存在一些差异:米根霉在水分含量57%~59%、pH2.5~3.0的酸性介质中、28~31℃下培养36h时产酸性蛋白酶能力最强,所分泌的蛋白酶系在pH4.0和pH6.0附近有最强的催化活性,在pH3.0~6.0的范围内有较好的稳定性,催化反应的最适作用温度为50℃,它的温度稳定性很差,在50℃保温30min已完全失活;少孢根霉在水分含量52%~55%、pH2.5~3.0的酸性介质中、31℃下培养48h时产酸性蛋白酶能力最强,在35℃条件下培养36h也能产生较高的酶活力,少孢根霉分泌的蛋白酶系在pH3.0和pH6.0附近有最强的催化活性,在pH4.0～6.0范围内很稳定,催化反应的最适作用温度可达55～60℃,但它的温度稳定性较差,在50℃保温30min,酶活力损失达到90%,保温120min酶几乎完全失活。     

对米根霉在不同条件下产酸情况的研究

乳酸是目前世界上公认的3大有机酸之一,其广泛应用于食品、医药、化工、制革、纺织、环保和农业等诸多领域。用微生物发酵法生产L-乳酸可以达到较高的纯度要求。根霉属中的米根霉(Rhizopus oryzae)是目前发酵生产L-乳酸的重要菌株,本课题研究的是从自然界选取的米根霉在不同条件下的产酸情况。采用分析方法包括还原糖的测定,pH测定,NaOH滴定确定乳酸产量。通过对不同条件下产酸情况的分析,可以优化产酸条件,提高产酸率。最终确定出在葡萄糖浓度为130g/L,氯化铵作为氮源,其浓度在2.0g/L的条件下,实验室菌株的最佳产酸量是44.2g/L,葡萄糖的转化率是40.1%。     

L-乳酸高产突变株--米根霉NAF-032

运用正交试验理论,对L-乳酸高产突变株NAF-032的优化摇瓶发酵条件作了初步研究,确定了优化的发酵培养基和发酵条件.优化发酵培养基为(g/L)葡萄糖140,氯化铵1,KH2PO40.3,MgSO4*7H2O0.25,ZnSO4*7H2O0.08;优化培养条件为34℃,摇床转速200r/min,装液量50mL(250mL容积三角瓶),一次性添加CaCO380g/L调节pH值.米根霉NAF-032的摇瓶发酵L-乳酸积累量可达94.28g/L.     

Rhizopus oryzae LS1利用丢糟水解液发酵生产乳酸

研究了一株诱变米根霉Rhizopus oryzae LS-1利用丢糟水解液发酵生产乳酸的可行性。首先考察R.oryzae LS-1利用葡萄糖和木糖的糖代谢差异特性,并通过正交实验优化丢糟水解液发酵生产乳酸的工艺参数。结果表明,R.oryzae LS-1能代谢利用葡萄糖和木糖,且二者存在协同互补作用,有利于乳酸生成和糖酸转化,可用于木质纤维原料的乳酸生产。丢糟水解液发酵生产乳酸的实验表明,氯化铵是R.oryzae LS-1适宜的氮源。在接种量为3.0%、p H为6.5、发酵时间为96h、Ca CO3添加量为80g/L的条件下,乳酸生成浓度为13.27g/L,糖利用率为79.61%。说明诱变菌株R.oryzae LS-1具备发酵丢糟水解液制备乳酸的潜力。