甲磺酸加贝脂抑制人肝癌HepG2细胞增殖及相关机制

甲磺酸加贝脂(gabexate mesilate,GM)是一种人工合成的丝氨酸蛋白酶抑制剂,近年来有文献报道将GM用于直肠癌、胰腺癌等肿瘤治疗的探索性研究,初步显示GM可能是一种新型的基质金属蛋白酶抑制剂[1-2].我们探索GM在体外对肝癌细胞HepG2增殖和凋亡的影响,探讨其可能的作用机制.     

甲磺酸加贝脂抑制人肝癌HepG2细胞增殖及相关机制

甲磺酸加贝脂(gabexate mesilate,GM)是一种人工合成的丝氨酸蛋白酶抑制剂,近年来有文献报道将GM用于直肠癌、胰腺癌等肿瘤治疗的探索性研究,初步显示GM可能是一种新型的基质金属蛋白酶抑制剂[1-2].我们探索GM在体外对肝癌细胞HepG2增殖和凋亡的影响,探讨其可能的作用机制.     

Ciglitazone抑制人肝癌HepG2细胞增殖活性的实验研究

目的 研究过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)激动剂Ciglitazone对人肝癌细胞株HepG2体内、外生长的影响。并探讨其可能机制。方法 培养HepG2细胞,加入不同浓度的Ciglitazone,用生长曲线检测HepG2细胞体外生长情况,用流式细胞仪进行细胞周期分析;Western blot检测Ciglitazone对PPARγ蛋白表达的影响。建立裸鼠肝癌动物模型,随机将其分为两组:对照组(A组,10只),Ciglitazone注射组(B组,10只),B组隔天注射Ciglitazone 100 μl(100μmol/L)连续15次,对照组注射100μl生理盐水,1个月后,切除瘤灶、称瘤重、计算抑瘤率。标本用Western blot检测细胞周期素D1(CyclinD1)、细胞周期素依赖性激酶抑制子p21蛋白的表达。结果 (1)Ciglitazone体外抑制HepG2细胞生长,并呈现明显时间和剂量依赖性。(2)经Ciglitazone处理后PPARγ蛋白表达增加。(3)经Ciglitazone治疗后,A组、B组的瘤重分别为(3.73±0.22)g、(2.60±0.35)g,抑瘤率达30％,A组的CyclinD1较B组明显增高,A组的p21蛋白表达水平较B组明显降低。结论 Ciglitazone能抑制肝癌HepG2细胞的恶性增殖(呈明显的时间及剂量依赖性),并诱导其分化,其机制与PPARγ干预细胞周期的调控有关。     

异丙酚对人肝癌HepG2细胞增殖的影响

目的 评价异丙酚对人肝癌HepG2细胞增殖的影响.方法 将人肝癌HepG2细胞以1×105个/ml浓度接种于96孔培养板中,100 μl/孔,采用随机数字表法,将其随机分为5组(n=33)∶正常对照组(C组)、脂肪乳组(Ⅰ组)、30、60、120 μg/ml异丙酚组(P1-3组),P1-3组分别加入30、60、120 μg/ml异丙酚,Ⅰ组加入10％脂肪乳.于异丙酚孵育24 h时,光学显微镜下观察细胞形态学,分别于异丙酚孵育即刻、24、48、72 h时测定细胞增殖情况,于异丙酚孵育48 h时测定Fas表达.结果 P1组、P2组和P3组细胞数量逐渐减少.与C组比较,Ⅰ组细胞增殖程度升高(P＜0.05),Fas表达差异无统计学意义(P＞0.05),P1～3组细胞增殖程度降低,Fas表达上调(P＜0.05);与P1组或P2组比较,P3组细胞增殖程度降低,Fas表达上调(P＜0.05).结论 异丙酚可呈浓度依赖性抑制人肝癌HepG2细胞增殖,其机制与上调Fas表达有关.     

BC047440基因RNA干扰抑制肝癌HepG2细胞增殖

目的 构建shRNA并干扰肝癌HepG2细胞中BC047440基因,观察其对肝癌HepG2细胞增殖的影响.方法 根据BC047440基因序列,设计和合成两条特异表达该基因shRNA序列并克隆载体pGenesil-1,转染肝癌HepG2细胞并用定量PCR观察抑制BC047440基因表达的效果,并通过MTT法和流式细胞仪检测细胞增殖及细胞周期的变化.结果 酶切和序列测定提示成功构建了特异表达BC047440基因的shRNA1和shRNA2两个质粒.shRNA1和shRNA2对BC047440 mRNA的抑制率分别为80.22%和58.63%.干扰BC047440基因后,肝癌HepG2细胞增殖受到明显抑制,主要停滞在S期.结论 构建的shRNA能有效干扰肝癌HepG2细胞BC047440基因的表达,并抑制肝癌HepG2细胞的增殖,提示BC047440基因和肝癌HepG2细胞增殖有关.     

损伤相关模式分子对人肝癌HepG2细胞增殖能力的影响

目的 观察在DAMPs诱导下人肝癌HepG2细胞增殖能力的变化.方法 将HepG2细胞分为对照组和实验组（10、20、40、80 μl DAMPs处理的HepG2细胞）;MTT比色法检测HepG2细胞的增殖能力;实时荧光定量PCR法检测IL-6 mRNA表达的变化;Western Blot法检测HepG2细胞IL-6蛋白的表达情况.结果 HepG2细胞随着DAMPs剂量的递增及时间的延长增殖能力逐渐增强,呈现明显的量效-时效关系,在剂量40 μl,作用时间36 h时细胞增殖能力达到最强,差异有统计学意义（P〈0.01）;选取作用时间为36 h,随着DAMPs剂量的递增,实时定量PCR法检测到HepG2细胞IL-6 mRNA分别为95.55±4.47,171.80±6.60,453.30±14.47,610.59±12.70,441.04±18.91,差异有统计学意义（P〈0.01）;Western Blot法检测HepG2细胞IL-6蛋白的表达分别为1.47、2.07、2.74、3.44、3.00,差异有统计学意义（P〈0.01）.结论 DAMPs在一定剂量及时间内促进人肝癌HepG2细胞增殖,并且呈现明显的量效-时效关系.     

甲基强的松龙对人肝癌HepG-2细胞增殖抑制机制的研究

甲基强的松龙是人工合成的一种糖皮质激素，又是肝移植术后常用的免疫抑制剂，其对肝癌肝移植术后肝癌复发影响尚不清楚。我们通过检测甲基强的松龙作用的肝癌细胞凋亡、细胞周期及周期蛋白依赖性激酶抑制剂p21表达变化的研究，进一步对其作用机制进行较深入的探讨。     

普伐他汀对肝癌HepG2细胞增殖的抑制作用

目的探讨HMG-CoA还原酶抑制剂(Statins)在体内外抑制肝细胞癌增殖和侵犯的作用及其机制。方法以不同浓度的普伐他汀(Pr)作用于培养的HepG2细胞,用噻唑蓝比色试验检测细胞的增殖活性,并观察细胞的形态学变化。建立HepG2细胞裸小鼠皮下移植瘤模型,腹腔注射浓度为5 g／L的Pr,每只每日10 ml／kg体重。观察肿瘤的生长情况,实验结束时切取肿瘤称重,检测血中AFP水平。肿瘤标本石蜡切片,免疫组织化学检测CyclinD1和FⅧRA的表达。结果 Pr作用96 h后明显抑制了HepG2细胞的生长,细胞出现明显的形态学改变。Pr也抑制裸小鼠皮下移植型肝癌的生长,Pr组和对照组瘤重分别是(0．246±0．129)g和(0．376±0．102)g(P< 0．05),抑瘤率34．6％。两组的AFP表达差异有统计学意义[(2．657±1．465)μg／L比(4．206± 1．204)μg／L,P<0．05]。Cydin D1在肿瘤间质的成纤维细胞表达,Pr组的积分吸光度(OPTID)为 219．40±24．00,对照组为451．54±47．97(P<0．05)。两组的微血管密度(MVD)分别为27．43± 6．83和41．22±6．26(P<0．05)。结论 Pr能抑制肝癌细胞的增殖,其机制主要是抑制肿瘤的血管形成和肿瘤基质中的成纤维细胞的增生。     

Doxycycline抑制人肝癌细胞系HepG2生长的实验研究

目的：观察多西环素（Doxycycline）对人肝细胞性肝癌细胞系HepG：生长抑制和凋亡的作用，并初步探讨其作用机制。方法：不同浓度的Doxycycline（5、10、20、30和50mg／L）对体外培养人肝癌细胞系HepG：进行不同的时间干预（24、48和72h），MTT法测定细胞生长抑制率，TUNEL法检测细胞凋亡率，免疫细胞化学检测Fas、FasL及MMP-2蛋白表达的变化。结果：Doxycycline作用HepG2细胞48h和72h后，细胞生长被明显抑制，与无药对照组比较差异有统计学意义（P〈0．001），且呈时间、浓度依赖趋势。其细胞凋亡率较无药对照组也明显升高（P〈0．01）；20mg／L Doxycycline作用于癌细胞48h后，实验组FasL蛋白阳性表达较无药对照组明显升高，MMP-2蛋白阳性表达较无药对照组明显降低，两组差异均有统计学意义（P〈0．01），而Fas蛋白表达则差异无统计学意义（P〉0．05）。结论：Doxycycline对人肝癌细胞系HepG2具有明显的生长抑制和促凋亡作用，其机制可能与下调MMP-2、上调FasL从而启动Fas／FasL膜受体途径有关。     

热疗诱导人肝癌细胞HepG2凋亡及机制的研究

目的探讨不同温度热疗对人肝癌细胞Hep G2的凋亡作用。方法人肝癌Hep G2细胞常规方法培养,采用水浴加热法对实验组(41℃,42℃,43℃)和对照组(37℃)细胞进行加温(0.5 h)处理,处理后继续培养24 h。采用流式细胞术检测细胞的凋亡情况,免疫组织化学技术检测细胞凋亡相关蛋白P53的水平,实时荧光定量PCR法检测热疗作用后生存素(Survivin),caspase-9基因mRNA的表达变化。应用SPSS16.0软件进行统计学分析。凋亡率、P53蛋白值、caspase-9 mRNA表达水平等计量资料采用均数±标准差表示,组间比较采用t检验或方差分析。P0.05差异有统计学意义。结果在37℃,41℃,42℃,43℃,细胞凋亡率分别为(9.58±1.22)%、(16.47±3.41)%、(20.07±1.85)%和(23.42±1.93)%;P53蛋白表达OD值分别为(0.083±0.015)、(0.145±0.024)、(0.267±0.031)、(0.389±0.019)。与对照组比较,survivin基因mRNA的表达量下降(P0.05),caspase-9基因mRNA的表达显著增加(P0.05)。不同温度热疗后,随着加热温度的增高,细胞凋亡率增加,促进了基因p53及caspase-9的表达,凋亡抑制基因survivin的表达量下降。结论通过热疗可以增加p53及caspase-9基因的表达,抑制survivin基因的表达,从而诱导肝癌Hep G2细胞凋亡。     

重复加热对肝癌HepG2细胞增殖周期及bcl-2的影响

目的探讨多次热疗后残存的肝癌HepG2细胞增殖速度变化及其相关的可能原因。方法HepG2细胞43℃加热，每次80min，2次／d，10个循环，分析细胞倍增时间，检测细胞周期及bcl-2 mRNA及bax mRNA的表达。结果热处理后的HepG2细胞增殖加快，细胞周期中G2期和S期细胞的比率增高，bcl-2 mRNA的表达增强，bcl-2／bax比值增大。结论热处理后的HepG2细胞的增殖加快与其完成DNA复制而进入分裂的细胞比率高、抗凋亡基因bcl-2mRNA的强表达及bcl-2／bax比值的增加有关。     

HGF下调Skp2表达抑制人肝癌细胞增殖的实验研究

目的：探讨肝细胞生长因子(HGF)对人肝癌细胞增殖的作用及其机制。方法：人肝癌细胞株HepG2用于实验。通过BrdU细胞增殖酶联免疫实验观察HGF对细胞增殖的作用,采用Western印迹和RT-PCR法检测HGF对S期激酶结合蛋白2(Skp2)表达的影响。将Skp2真核细胞重组表达质粒转染HepG2细胞并获得稳定转染的过表达Skp2的HepG2细胞,观察HGF对该转染细胞增殖的影响。结果： HGF对HepG2细胞的增殖具有浓度依赖性和时间依赖性的抑制作用;HGF明显抑制HepG2细胞表达Skp2蛋白和mRNA。但HGF对过表达Skp2的HepG2细胞无增殖抑制作用。结论：HGF对HepG2细胞具有明显的增殖抑制作用,其作用机制与下调Skp2表达密切相关。     

癌光啉对人肝癌细胞HepG2的光动力作用及机制

目的:探讨光敏剂癌光啉(PsD-007)对肝癌细胞HepG2的体外光动力效应及其机制。方法:将HepG2细胞分为3个光动力处理组,分别以10,20,30μg/mL PsD-007孵育细胞,期间均用630 nm波长的可见光照射(光照能量为6.0 J/cm2,时间2.0 min);同时设3个对照组,分别为空白对照,单纯光照组和暗毒组(30μg/mL PsD-007,未光照)。各组细胞于实验24 h后用MTT法检测存活率,并用凋亡试剂盒结合荧光显微镜观察凋亡情况。应用Real-time PCR和Western blot方法检测20,30μg/mL PsD-007 2个光动力处理组和3个对照组细胞caspase-3,caspase-8和p53的基因、蛋白表达水平。结果:与空白对照组比较,3个光动力处理组HepG2细胞存活率均明显降低,且呈浓度依赖性(P<0.05),而单纯光照组和暗毒组细胞存活率均无明显改变(P>0.05)。荧光显微镜观察结果显示,各光动力处理组坏死或晚期的凋亡细胞较3个对照组显著增多。Real-time PCR和Western blot结果显示,2个光动力处理组细胞caspase-3,caspase-8和p53基因、蛋白表达水平较3个对照组明显上调。结论:PsD-007在体外对HepG2细胞具有光动力杀伤作用,其机制可能与调控caspase蛋白酶和p53的表达从而诱导细胞凋亡和坏死有关。     

5-脂氧合酶抑制剂对人肝癌细胞株HepG2体外迁移及侵袭的影响

目的 :观察5-脂氧合酶(5-LOX)抑制剂对人肝癌细胞株HepG2体外迁移及侵袭的影响及其部分机制的探析。方法:将不同浓度5-LOX抑制剂体外培养人肝癌HepG2细胞,通过细胞迁移划痕愈合实验、侵袭实验法检测5-LOX抑制剂对细胞体外迁移、侵袭抑制的情况,同时利用Western blot法检测不同浓度5-LOX抑制剂干预后人肝癌HepG2细胞MMP-9蛋白的表达情况。结果:5-LOX在细胞质中表达,部分在细胞核也有表达,人正常肝细胞5-LOX弱阳性,肝癌细胞HepG2中5-LOX呈强阳性表达;5-LOX抑制剂各组各个时相点的划痕愈合率均显著低于空白对照组(P0.05),并且随着5-LOX浓度的增加降低的趋势逐渐明显;随着5-LOX抑制剂浓度的上调,对人肝癌HepG2细胞的抑制率逐渐上调;不同浓度5-LOX抑制剂可抑制MMP-9蛋白的表达,并随着浓度逐渐上调抑制作用更加明显。结论:5-LOX抑制剂可抑制人肝癌细胞株HepG2迁移及侵袭,这一过程可能与下调细胞MMP-9蛋白的表达有关。     

全反式维甲酸抑制肝癌细胞增殖的作用机制研究

目的 研究全反式维甲酸(all-trans-retinoicacid,ATRA)对肝癌细胞增殖的影响并探讨可能的作用机制.方法 利用ATRA处理肝癌细胞系HepG2与SMMC-7721,选择MTT法分析细胞增殖.利用实时PCR方法研究ATRA对miR-18a表达的影响,并选择特异抑制剂Anti-miR-18a处理肝癌细胞,利用MTT法分析细胞增殖.设计拯救实验,利用ATRA处理转染miR-18a模拟物的肝癌细胞系,利用MTT法分析细胞增殖情况.结果 ATRA可以有效抑制肝癌细胞系HepG2和SMMC-7721的增殖,A490吸光度值分析显示,HepG2经ATRA处理后,细胞增殖分别被抑制74％(P＜0.05,36 h)、72％(P＜0.01,48 h)、67％(P＜0.05,72 h);SMMC-7721经ATRA处理后,细胞增殖分别被抑制68％ (P＜0.05,48 h)、64％ (P＜0.01,72 h).miR-18a在肝癌细胞HepG2与SMMC-7721中的表达水平分别上调4.7倍(P＜0.05)、3.8倍(P＜0.05); ATRA处理后,HepG2与SMMC-7721内源性miR-18a的表达水平分别下调67％(P＜0.05)与56％(P＜0.05).过表达miR-18a的肝癌细胞HepG2与SMMC-7721对ATRA的抑制作用出现耐受,其中HepG2细胞增殖上调1.2倍(P＜0.05),SMMC-7721细胞增殖上调1.25倍(P＜0.05,24 h)与1.2倍(P＜0.05,48 h).结论 ATRA可通过下调肝癌细胞内源性miR-18a的表达,抑制细胞增殖.     

血管内皮生长因子-C shRNA对肝癌HepG2细胞增殖及侵袭能力的影响

目的 检测靶向血管内皮生长因子-C(vasenlar endothelial growth factor-C,VEGF-C)shRNA质粒载体对肝癌HepG2细胞增殖及侵袭能力的影响.方法 构建VEGF-C shRNA质粒载体,脂质体转染方法转入肝癌HepG2细胞.通过倒置荧光显微镜及流式细胞仪检测细胞的转染率;RT-PCR及Western blot检测转染细胞内VEGF-C mRNA及蛋白的表达变化;MTT法检测细胞增殖抑制率;人工基底膜体外侵袭实验检测细胞侵袭能力.结果 VEGF-C shRNA稳定转染后,肝癌HepG2细胞内VEGF-C mRNA及蛋白表达水平显著下降;VEGF-C shRNA对肝癌HepG2细胞具有明显的增殖抑制作用,其抑制增殖效应呈时间依赖性;VEGF-C shRNA可有效抑制肝癌HepG2细胞的人工基底膜体外侵袭能力,抑制率为51.54%.结论 VEGF-C在肝癌增殖、侵袭转移中发挥重要作用;通过RNA干扰技术实现VEGF-C沉默,在肝癌的基因治疗中具有较好的应用前景.     

雷帕霉素抑制人前列腺癌细胞增殖及其作用机制

目的 观察雷帕霉素(Rapamycin)对体外培养的人前列腺癌PC-3M-2B4细胞增殖及凋亡的影响,探讨其机制.方法 分别用不同浓度的雷帕霉素(100、200、400、800μg/L)对细胞进行干预后,采用噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞增殖变化,流式细胞术检测细胞凋亡变化,Western blot 法检测凋亡相关蛋白bcl-2及bax表达的变化.结果 雷帕霉素能明显抑制PC-3M-2B4细胞的增殖活性,此作用呈现量-效、时-效关系.雷帕霉素呈浓度依赖性诱导细胞凋亡.雷帕霉素作用PC-3M-2B4细胞后,细胞内凋亡抑制蛋白bcl-2的表达明显降低,bax蛋白的表达明显增加.结论 雷帕霉素能够通过调节凋亡相关蛋白bcl-2和bax的表达比例,诱导前列腺癌细胞凋亡,从而抑制肿瘤生长.

Abstract：

Objective To investigate the effects of Rapamycin on the growth and apoptosis of human prostate carcinoma cell line PC-3M-2B4. Methods The inhibitory effect of Rapamycin was observed at 100,200,400,800μg/L on the growth of human prostate carcinoma cell line PC-3M-2B4 in serum-free medium for different concentrations by methyl thiazol tetrazolium (MTF) assays. Flow cytometry (FCM)analysis was used to study the changes of cell apoptosis. The expression level of bcl-2 and bax was determined by Western blotting. Results Rapamycin caused dose-dependent inhibition on the growth of human prostate carcinoma cell line PC-3M-2B4 in a concentration-and time dependent manner. Rapamycin induced the apoptosis of PC-3M-2B4 cells in a concentration-dependent manner. The levels of bcl-2 protein were reduced gradually with the increase of concentration or action time. Conclusion Rapamycin, a mTOR inhibitor, inhibits the growth of human prostate cancer cell and induces apoptosis of human prostate cancer cell. mTOR might be a potential target for anti-prostate cancer.     

槲皮素通过抑制己糖激酶抑制肝癌HepG2细胞的增殖及促进其凋亡

目的 观察槲皮素对HepG2细胞增殖和凋亡的影响并探讨其机制.方法 选用槲皮素12.5、25.0、50.0、100.0、200.0 μmol/L为实验浓度梯度,采用噻唑蓝(MTT)比色法及流式细胞检测技术检测人肝癌HepG2细胞对槲皮素的敏感性;应用免疫细胞化学及逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测细胞中已糖激酶蛋白及mRNA的表达.结果 槲皮素对肝癌HepG2细胞的增殖呈浓度依赖性的抑制作用,以上各浓度抑制率分别为10.1％、20.4％、35.6％、59.8％、70.2％;诱导细胞凋亡率分别为9.7％、15.2％、22.6％、31.7％、42.3％:100 μmol/L槲皮素作用HepG2细胞48 h前后已糖激酶蛋白表达的灰度值分别为128.33±13.27、193.18±12.36;与β-肌动蛋白(β-actin)mRNA表达的吸光度(A)值分别为0.3747±0.1356、0.2058±0.1172.结论 槲皮素对肝癌HepG2细胞具有生长抑制作用,并通过抑制己精激酶的表达来促进细胞凋亡.