洛伐地汀对高糖和低密度脂蛋白所致肾小管上皮细胞外基质蓄积的改善作用

为探讨洛伐他汀对高糖环境和低密度脂蛋白（LDL）刺激下人肾小管上皮细胞外基质（ECM）蓄积的作用。经体外培养人肾脏近端小管上皮细胞（HKC）,分别用LDL和/或高糖刺激HKC细胞,并与洛伐他汀共孵育。采用^3H-脯氨酸参入法测定总胶原合成,ELISA方法测定细胞培养上清中IV型胶原和板层素浓度,RT-PCR技术观察HKC细胞中IV型胶原及纤维连接蛋白（FIV）mRNA表达。结果表明高糖和LDL均可增加HKC细胞培养上清中的IV型胶原和板层素水平,并能上调IV型胶原和FN mRNA的表达,洛伐他汀可以部分或全部逆转高糖和LDL的作用。说明高糖和LDL均可促使HKC细胞合成细胞外基质,洛伐他汀可以逆转它们的作用。     

SGK1超表达对人足细胞合成纤连蛋白的影响

目的： 研究高糖刺激对人足细胞血清和糖皮质激素诱导的蛋白激酶1（SGK1）和纤连蛋白（FN）表达的影响，以及SGK1超表达和灭活条件下FN的合成变化，揭示SGK1介导的信号转导途径在高糖诱导足细胞细胞外基质聚集，引发早期糖尿病肾损害过程中的作用。方法: 高糖刺激人足细胞24 h，Western blotting方法检测SGK1和FN蛋白水平的表达。利用构建好的SGK1激活型质粒（pIRES2-EGFP-SGK1SD）、灭活型质粒（pIRES2-EGFP-SGK1KN）和空载体（pIRES2-EGFP）分别转染人足细胞，免疫荧光方法检测足细胞合成FN的水平。结果: 人足细胞中存在SGK1的表达，高糖刺激SGK1表达上调(50±4 vs 35±3)，与此同时，FN合成亦明显增加(19±4 vs 12±2)。SGK1SD转染的足细胞中FN合成明显增加，相反，SGK1KN转染的足细胞中FN合成明显减少。结论: SGK1参与了高糖诱导的人足细胞FN的合成，可能在糖尿病肾病早期足细胞的受损活化过程中发挥重要作用。     

Snail 在AP-1介导的肾小管上皮细胞转分化中的作用

目的：探讨Snail 在AP-1介导的肾小管上皮细胞转分化中的作用及对细胞外基质分泌的影响。 方法：将体外培养的人肾小管上皮细胞（HK2）分为正常对照组、高糖组、AP-1阻断组。细胞免疫化学法检测E-钙黏蛋白(E-cadherin)和波形蛋白(vimentin)的表达,ELISA法测定培养液上清中纤连蛋白（FN）的浓度变化,用凝胶电泳迁移率改变分析法（EMSA）检测HK2细胞AP-1的改变, RT-PCR法检测vimentin mRNA和Snail mRNA的表达,Western blotting检测E-cadherin的表达。结果：高糖作用HK2细胞48h后,高糖组FN浓度较正常对照组显著增加(P<0.05),而AP-1阻断组浓度显著低于高糖组(P<0.05);高糖能够刺激AP-1结合活性,AP-1阻断剂可显著抑制AP-1的活化;高糖组Snail mRNA表达水平较正常对照组显著增加（P<0.05）,而AP-1阻断组其水平显著低于高糖组（P<0.05）;与正常对照组相比,高糖组E-cadherin蛋白表达明显降低（P<0.05）,而AP-1阻断组其水平显著高于高糖组（P<0.05）;高糖组vimentin mRNA和蛋白水平明显高于正常对照组（P<0.05）,而AP-1阻断组显著低于高糖组（P<0.05）。结论：高糖可导致肾小管上皮细胞AP-1活化,诱导Snail表达而下调E-cadherin,同时导致vimentin蛋白的表达、细胞外基质FN的分泌增加,诱导其表型转化,参与糖尿病肾病的纤维化进程。     

Snail1/IGF-1信号通路介导高糖诱导的肾小管上皮细胞EMT

目的:观察高糖诱导大鼠肾小管上皮细胞NRK-52E中锌指转录因子Snail1和胰岛素样生长因子1(insulin-like growth factor-1,IGF-1)的表达变化,并初步探讨Snail1与IGF-1在糖尿病肾脏病(diabetic kidney disease,DKD)上皮-间充质转化(epithelial to mesenchymal transition,EMT)过程中的关系。方法:高糖培养大鼠近端肾小管上皮细胞系NRK-52E 72 h后,给予Snail1 siRNA和IGF-1 siRNA处理,分为高糖组、non-targeting(NT)siRNA组、Snail1 RNAi组和IGF-1 RNAi组,并设置对照组。于转染后48和72 h两个时点收获细胞。分别用实时荧光定量PCR检测细胞Snail1、IGF-1、E-钙黏蛋白(E-cadherin)和纤维连接蛋白(fibronectin,FN)的mRNA表达,用免疫荧光方法检测各蛋白的表达。结果:高糖诱导NRK-52E细胞E-cadherin的mRNA和蛋白表达明显降低(P0.01),FN的mRNA和蛋白表达明显升高(P0.01);同时,Snail1和IGF-1的mRNA和蛋白表达也明显升高(P0.01)。Snail1 RNAi组与高糖组比较,细胞中E-cadherin的mRNA和蛋白表达明显升高(P0.01),FN、Snail1和IGF-1的mRNA和蛋白表达明显降低(P0.01),Snail1的mRNA表达减少62.8%。与高糖组比较,IGF-1 RNAi组细胞IGF-1的mRNA表达减少61.1%,E-cadherin的mRNA和蛋白表达明显升高(P0.01),FN的mRNA和蛋白表达明显降低(P0.01)。NT组E-cadherin、FN、Snail1及IGF-1的mRNA和蛋白表达与高糖组比较差异无统计学显著性。Pearson相关性分析显示,NRK-52E细胞中Snail1与IGF-1蛋白的表达呈显著正相关(r=0.852,P0.01)。结论:Snail1及IGF-1的mRNA和蛋白在高糖诱导的肾小管上皮细胞EMT过程中表达升高,且沉默Snail1基因,IGF-1表达随之减少,提示Snail1/IGF-1可能促进DKD时肾小管上皮细胞EMT。     

胰岛素对高糖培养的人系膜细胞表达SGK1及合成细胞外基质的影响

目的：研究胰岛素对高糖培养的人系膜细胞（HMC）血清和糖皮质激素诱导的蛋白激酶1(SGK1)的表达及细胞外基质（ECM）合成的影响，初步探讨其主要作用环节。方法:用含有5.5 mmol/L、25 mmol/L葡萄糖和100 nmol/L胰岛素的DMEM培养基培养HMC细胞，即为对照组（NG）、高糖组（HG）、胰岛素干预对照组（NI）和胰岛素干预高糖组（HI）。4 h后检测SGK1的表达、胰岛素受体底物（IRS1和IRS2）蛋白的表达及磷酸化水平；24 h后检测结缔组织生长因子（CTGF）和纤连蛋白（FN）的表达。结果:HG组、NI组和HI组SGK1蛋白表达均显著高于NG组（P<0.01），高糖主要导致IRS2蛋白表达及磷酸化水平的增高（P<0.01）。胰岛素干预后，HI组IRS1蛋白表达及磷酸化水平明显高于HG组（P<0.05），而IRS2蛋白表达及磷酸化水平出现部分抑制（P<0.05）。高糖促进CTGF和FN的表达，胰岛素加强高糖此作用。结论:胰岛素和高糖能够通过不同的分子途径促进体外肾小球系膜细胞SGK1的表达，并最终促进ECM的合成；胰岛素的这种作用与IRS1信号转导通路密切相关。     

ILK siRNA对高糖刺激的人肾小管上皮细胞GSK-3β及β-catenin表达的影响*

 目的：探讨高糖诱导肾小管上皮细胞转分化中整合素连接激酶小干扰RNA（ILK siRNA）对糖原合成酶激酶3β（GSK-3β）磷酸化和β-连环蛋白（β-catenin）核内表达的影响及意义 。方法：体外培养人近端肾小管上皮细胞系HKC,分为正常对照组（NG）、高糖组（HG）、高糖＋阴性转染对照组 (HG+HK)和高糖＋ILK siRNA组(HG+ILK siRNA)。倒置荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达。RT-PCR及Western blotting检测ILK  mRNA及蛋白表达水平;免疫细胞化学检测磷酸化GSK-3β（p-GSK-3β）和β-catenin表达。Western blotting检测总GSK-3β、p-GSK-3β、核β-catenin、总β-catenin、E-钙黏蛋白（E-cadherin）和α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的表达水平。结果：（1）倒置荧光显微镜下可见绿色荧光蛋白表达,证实构建的siRNA重组质粒成功转染HKC细胞;（2）与HG和 HG+HK组相比,HG+ILK siRNA组ILK mRNA及蛋白水平下降,但较NG组表达仍高;（3）HG+ILK siRNA组ILK基因沉默后,p-GSK-3β与核β-catenin蛋白表达较HG及HG+HK组均下降,但较NG组表达仍高。而总GSK-3β与总β-catenin 在各组表达无明显差异。结论:ILK、GSK-3β和β-catenin可能参与了高糖介导的肾小管上皮细胞转分化过程。ILK可能通过调节Wnt/β-catenin途径下游效应蛋白GSK-3β和β-catenin的表达而促使肾小管上皮细胞转分化。     

Snail1 siRNA 对高糖诱导肾小管上皮细胞表型转变的影响

目的： 观察Snail1 siRNA对高糖诱导的肾小管上皮细胞向间充质细胞转变（TEMT）的影响。方法: 原代培养肾小管上皮细胞分为5组：（1）对照组（含糖5.5 mmol/L）;（2）高糖组（含糖25 mmol/L）;（3）Snail1 siRNA处理组,转染Snail1 siRNA,6 h后更换为高糖（含糖25 mmol/L）培养;（4）control siRNA处理组,转染control siRNA作为siRNA阴性对照,6 h后换为高糖（含糖25 mmol/L）培养;（5）高渗组（含D-manntio19.5 mmol/L）;72 h后收集细胞,用Western blotting和半定量RT-PCR检测Snail1、TGF-β1、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、vimentin和E-cadherin蛋白和mRNA表达。结果: 与高糖组比较,肾小管上皮细胞转染Snail1 siRNA后,Snail1 mRNA和蛋白表达水平分别下降62%和68%（P<0.01）。同时,Snail1 siRNA处理组α-SMA和vimentin蛋白和mRNA表达显著下调（P<0.01）,而E-cadherin蛋白和mRNA表达显著上调（P<0.01）。结论: Snail1参与了高糖诱导TEMT的调节。     

SnoN对高糖诱导大鼠原代肾小管上皮细胞纤维连接蛋白合成的影响

目的: 观察核转录共抑制因子SnoN (Ski-related novel protein N)对高糖诱导大鼠原代肾小管上皮细胞(RTECs)纤维连接蛋白(FN)合成的影响。方法: 原代培养大鼠RTECs,免疫荧光细胞化学和Western blotting检测培养细胞的上皮性钙黏蛋白、 角蛋白-18和α-平滑肌肌动蛋白表达,鉴定培养细胞;正常糖(5.5 mmol/L)、高糖(25 mmol/L)和相同渗透压的甘露醇分别培养RTECs 30 min、2 h、12 h、24 h、48 h、72 h和96 h;SnoN siRNA转染RTECs,分为对照组、高糖组、control siRNA组和SnoN siRNA组;Western blotting和免疫细胞化学检测不同处理组RTECs中SnoN和FN蛋白的表达;RT-PCR检测FN mRNA。结果: 与正常糖培养组相比,高糖刺激能抑制 RTECs中SnoN蛋白表达,且呈时间依赖性;高糖刺激能使RTECs中FN蛋白和mRNA表达增加;与单纯高糖培养组相比,转染SnoN siRNA 能进一步促进高糖诱导的RTECs中FN蛋白表达(P<0.05)。结论: SnoN表达减少参与了高糖诱导的RTECs中FN合成过程。     

人血白蛋白对近端肾小管上皮细胞ACE2表达的影响

目的： 研究人血白蛋白对人近端肾小管上皮细胞（HK-2）血管紧张素转换酶2（ACE2）及血管紧张素转换酶（ACE）表达的影响，探讨白蛋白对肾脏损害的机制。方法: 不同浓度人血白蛋白（0、1、5、10、15 g/L）分别加入到培养的人近端肾小管上皮细胞培养48 h，用RT-PCR法和Western blotting法分别检测HK-2细胞ACE2和ACE mRNA和蛋白表达。结果: 正常培养状态下HK-2细胞（空白对照组）存在ACE2 mRNA和蛋白表达，加入不同浓度（5-15 g/L）的人血白蛋白剂量依赖抑制HK-2细胞ACE2 mRNA和蛋白表达（P<0.01）。正常培养状态下HK-2细胞ACE mRNA和蛋白表达水平较低，随着加入白蛋白浓度的增加其表达水平逐渐升高，10 g/L白蛋白显著促进了HK-2细胞ACE mRNA和蛋白表达（P<0.05）。结论: 在体外培养的HK-2细胞存在ACE及ACE2 mRNA和蛋白表达，人血白蛋白可抑制其ACE2表达而促进ACE表达,这可能是白蛋白促肾小管间质损伤及肾小球硬化、间质纤维化的机制之一。     

磷酸化FOXO1对高糖刺激的人肾小管上皮细胞脂质沉积的影响

 目的：研究叉头框蛋白O1（FOXO1）表达和磷酸化过程对高糖刺激下人肾小管上皮细胞脂质沉积的影响。方法：体外培养人肾小管上皮细胞株HKC,给予高糖刺激后免疫荧光及Western blotting检测总FOXO1、磷酸化FOXO1和固醇调节元件结合蛋白1（SREBP1）的表达,油红O染色测定细胞内脂质沉积;构建野生型和磷酸化位点突变型FOXO1质粒,转染入HKC细胞后给予高糖刺激,采用免疫荧光、Western blotting和油红O染色确定FOXO1磷酸化位点突变对肾小管上皮细胞脂质代谢的影响。结果：高糖刺激HKC细胞48 h后,总FOXO1在正常糖组和高糖组的表达未见差异,而磷酸化FOXO1及SREBP-1表达明显上调,细胞内脂滴显著增加。将构建的野生型FOXO1质粒转染人细胞后,上调了总FOXO1和磷酸化FOXO1的表达,增加了SREBP-1表达和细胞内脂滴含量;而磷酸化位点突变的FOXO1质粒避免了高糖诱导引起的SREBP-1上调和细胞内脂质沉积。结论：磷酸化FOXO1参与了高糖诱导的肾小管上皮细胞SREBP-1上调和细胞内脂质聚集;磷酸化位点的突变可避免高糖引起的肾小管上皮细胞SREBP-1上调和脂质沉积。     

核转录因子κB抑制剂PDTC对高糖培养大鼠肾成纤维细胞VEGF和PEDF表达的影响

目的:探讨核转录因子κB(NF-κB)抑制剂吡咯烷二硫氨基甲酸(PDTC)对高糖培养大鼠肾成纤维细胞(NRK)血管内皮生长因子(VEGF)及色素上皮衍生因子(PEDF)表达的影响。方法:NRK按培养条件分为常糖组:5.6mmol/L葡萄糖;高糖A组:15mmol/L葡萄糖;高糖B组:30mmol/L葡萄糖;PDTC对照组:5.6mmol/L葡萄糖+5.0μmol/LPDTC;PDTCA组:15mmol/L葡萄糖+10μmol/LPDTC;PDTCB组:30mmol/L葡萄糖+20μmmol/LPT-DC。采用半定量RT-PCR方法及ELISA测定各组培养24h、48h后NRK的VEGF及PEDFmRNA及蛋白的表达。结果:与常糖组相比,高糖各组NRK的VEGF蛋白含量及mRNA表达明显升高(P<0.01,P<0.05);与高糖B组相比,PDTC干预各组NRK的VEGF蛋白含量及mRNA表达呈下降趋势(P<0.01,P<0.05)。与常糖组相比,高糖各组NRK的PEDF蛋白含量及mRNA表达明显下降(P<0.01,P<0.05);与高糖B组相比,PDTCB组NRK的PEDF蛋白含量及mRNA表达明显升高(P<0.01)。结论:PDTC能明显抑制高糖培养大鼠NRK的VEGF表达并明显上调PEDF的表达,间接提示NF-κB可能通过参与VEGF和PEDF的表达失衡导致糖尿病肾病(DN)的发生。     

活性氧介导高糖负荷致人系膜细胞癌胚纤维连接蛋白的表达

背景：研究发现,癌胚纤维连接蛋白系新合成细胞外基质的重要标志,而高糖环境氧化应激与癌胚纤维连接蛋白的关系尚未见报道。 目的：观察高糖作用对人系膜细胞活性氧和癌胚纤维连接蛋白mRNA表达的影响。 方法：将培养的系膜细胞分为以下各组：正常对照组(5 mmol/L D-葡萄糖);渗透压对照组(5 mmol/L D-葡萄糖+           20 mmol/L L-葡萄糖);高糖组(25 mmol/L D-葡萄糖);α-硫辛酸干预组,分为高糖+LA50组(25 mmol/L D-葡萄糖+        50 μmol/L α-硫辛酸)、高糖+LA100组(25 mmol/L D-葡萄糖+100 μmol/L α-硫辛酸)、高糖+LA200组(25 mmol/L D-葡萄糖+  200 μmol/L α-硫辛酸)。以RT-PCR法检测癌胚纤维连接蛋白mRNA表达水平,荧光显微镜和荧光酶标仪测定细胞内活性氧水平。 结果与结论：高糖促进系膜细胞活性氧的产生,亦增加癌胚纤维连接蛋白mRNA的表达,α-硫辛酸可显著降低高糖负荷下细胞内活性氧水平,同时减少癌胚纤维连接蛋白mRNA的表达,且呈浓度依赖性,提示活性氧介导高糖负荷致人系膜细胞癌胚纤维连接蛋白的表达,α-硫辛酸可部分逆转这一效应。     

p38MAPK介导高糖下调肾小管上皮细胞表达BMP-7

目的:观察高糖环境中培养的原代肾小管上皮细胞骨形态发生蛋白-7(BMP-7)表达及p38丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)信号通路的作用。方法:原代培养大鼠肾小管上皮细胞,随机分为正常对照组、高糖组、p38MAPK阻断剂SB202190+高糖组和高渗组,处理72h后收集贴壁细胞,免疫细胞化学检测BMP-7和纤维连接蛋白(FN)表达;Westernblotting检测p38MAPK和磷酸化p38MAPK(p-p38MAPK)的表达;RT-PCR法检测BMP-7和FNmRNA水平。结果:正常对照组肾小管上皮细胞BMP-7主要表达于细胞浆,有少量总p38MAPK与FN表达,未见p-p38MAPK;高糖状态激活了p38MAPK,p-p38MAPK蛋白表达明显增加,FN的表达也明显增多而BMP-7的表达显著减少;与SB202190共同培养72h后,p-p38MAPK的表达较高糖组减少约80%,BMP-7的表达却被显著上调,而FN的表达减少。高渗组与正常对照组比较无明显差异。结论:高糖状态下肾小管上皮细胞BMP-7蛋白和mRNA均减少,阻断p38MAPK信号通路可促进内源性BMP-7增多,提示p38MAPK可能参与高糖下调肾小管上皮细胞BMP-7的表达。     

霉酚酸酯对高糖培养下人肾小球系膜细胞MCP-1和FN表达的影响

目的:探讨高糖以及霉酚酸酯(MMF)对人肾小球系膜细胞(HMCs)单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)和纤维连接蛋白(FN)表达的影响。方法:将培养的HMCs分为正常对照组(5 mmol/L葡萄糖);高糖组(30 mmol/L葡萄糖);甘露醇渗透压对照组(5 mmol/L葡萄糖+25 mmol/L甘露醇);高糖+MMF-10组(30 mmol/L葡萄糖+10μg/mL MMF);高糖+MMF-100组(30 mmol/L葡萄糖+100μg/mL MMF),采用RT-PCR检测每组不同时间点(24、48、72 h)MCP-1 mRNA的表达,ELISA法检测培养上清液MCP-1及FN蛋白的表达。结果:高糖组HMCs MCP-1 mRNA、蛋白的表达及FN的分泌较正常对照组显著增加(P<0.01),且48 h表达最高;不同浓度的MMF均能下调MCP-1 mRNA、蛋白及FN的表达(P<0.01);不同浓度的MMF对MCP-1 mRNA、蛋白的表达及FN分泌的抑制程度不同,呈时间剂量依赖性(P<0.05)。结论:MMF可以阻抑MCP-1的表达及FN的分泌,可能对延缓肾小球硬化及间质纤维化有一定作用。     

不同浓度胰岛素对人肾小管上皮细胞SREBP-1、FAS表达及脂质形成的影响

目的:探讨不同浓度胰岛素对人肾小管上皮细胞(HKC)固醇调节元件结合蛋白-1(SREBP-1)和脂肪酸合成酶(FAS)表达以及细胞内脂滴形成的影响。方法:分别给予0nmol/L、1nmol/L、10nmol/L、100nmol/L和200nmol/L胰岛素刺激HKC细胞6h。RT-PCR技术检测SREBP-1和FASmRNA表达,免疫细胞化学和Westernblotting检测SREBP-1蛋白的表达,油红O染色检测细胞内脂滴。结果:与0nmol/L胰岛素组相比,10nmol/L、100nmol/L和200nmol/L组HKC细胞SREBP-1和FASmRNA表达均升高,其中100nmol/L组升高最明显。免疫细胞化学技术显示SREBP-1蛋白定位于HKC细胞的胞浆,在10nmol/L、100nmol/L和200nmol/L组HKC细胞其表达明显增强。Westernblotting检测显示10nmol/L、100nmol/L和200nmol/L组HKC细胞SREBP-1蛋白的前体和成熟片段表达增强,其中100nmol/L组表达最强,差异显著。油红O染色显示胰岛素刺激6h后只有100nmol/L胰岛素组HKC细胞内可见明显红染脂滴颗粒。结论:高浓度胰岛素引起HKC细胞SREBP-1和FAS表达上调并最终导致细胞内脂滴沉积,这可能是代谢综合征引起肾脏脂质沉积的重要机制之一。     

高糖诱导内皮细胞氧化型低密度脂蛋白受体表达

目的:研究高浓度葡萄糖对内皮细胞凝集素样氧化型低密度脂蛋白受体(LOX-1) mRNA和蛋白表达的影响,探讨糖尿病易合并血管病变的可能机制。方法:用倒置相差显微镜观察细胞生长情况, RT-PCR检测不同浓度D-葡萄糖(7.5、15、30 mmol/L)作用48 h及15 mmol/L浓度作用不同时间0、12、24、48、72、96 h内皮细胞LOX-1 mRNA表达;免疫组化观察葡萄糖15 mmol/L作用48 h LOX-1蛋白表达。结果:高糖组细胞粗糙,轮廓增强,细胞内有许多发亮的颗粒;不同浓度高糖均可诱导LOX-1 mRNA表达,30 mmol/L作用最强(P＜0.01);同一浓度下作用不同时间,LOX-1 mRNA表达随时间延长而增加,48 h达高峰(P＜0.01),之后下降;免疫组化显示葡萄糖组细胞棕色着色颗粒位于胞膜和胞浆,与对照组差异明显(P＜0.01)。结论:高浓度D-葡萄糖呈浓度依赖性和时间依赖性地诱导内皮细胞LOX-1 mRNA的表达;也可诱导LOX-1蛋白表达,表达的蛋白存在于细胞浆中和细胞膜上。葡萄糖的这种作用可能是糖尿病容易合并血管病变的原因之一。