黄芪皂苷Ⅱ对人肝癌多药耐药细胞BEL-7402/FU 的逆转耐药作用

摘要目的：探讨黄芪皂苷II（AstragalosideII,ASⅡ）对肝癌多药耐药性的逆转作用。方法：MTT法检测人肝癌多药耐药细胞BEL-7402／FU对化疗药物的敏感性和逆转耐药倍数,RT-PCR法检测多药耐药蛋白-1（MDRl）基因表达,免疫细胞化学法检测P一糖蛋白（P-gP）蛋白表达水平,流式细胞仪检测AS1I对细胞内Rhodaminel23的蓄积影响。结果：BEL-7402／FU细胞对5-氟尿嘧啶（5-FU）、阿霉素、丝裂霉素的耐药倍数分别为19．64、1．98、1．92。0．04、0．08mg／mL的ASⅡ能增强5-FU对BEL-7402／FU的细胞毒作用,逆转耐药倍数分别为1．49,1．81。0．08、0．16mg／mL的ASⅡ作用BEL-7402／FU细胞24h后,能下调MDRlmRNA和P-gP蛋白表达水平,提高细胞内Rhodaminel23的荧光表达率。结论：ASⅡ能部分逆转肝癌多药耐药性,其机制可能与下调MDRl1TIRNA表达及抑制P-gP的功能与表达有关。     

蛇葡萄素改变Bcl-2/Bax表达和激活caspase-3诱导人肝癌细胞Bel-7402凋亡

目的探讨蛇葡萄素在体外诱导人肝癌细胞株Bel-7402的凋亡作用及其可能机制。方法以不同浓度的蛇葡萄素作用于体外培养的人肝癌细胞株Bel-7402,应用MTT法检测培养24、48和72h的细胞生长情况;荧光染色观察细胞核的形态学改变;琼脂糖凝胶电泳分析细胞DNA变化;流式细胞仪检测细胞凋亡率;Western blot检测细胞caspase-3、Bcl-2和Bax的表达情况。结果蛇葡萄素对Bel-7402细胞的生长有明显的增殖抑制作用,呈浓度和时间依赖性。24、48、72h的IC50值分别是89.6±16.1、36.2±6.5和15.3±3.0mg·L-1。经荧光染色后可观察到典型的凋亡小体。细胞DNA电泳后呈现出凋亡细胞典型的DNAl adder。流式细胞术检测细胞凋亡率呈时间和浓度依赖性。caspase-3和Bcl-2蛋白表达量逐渐降低,Bax蛋白表达量逐渐增加,呈明显的浓度依赖性。结论蛇葡萄素能诱导体外培养的人肝癌Bel-7402细胞凋亡,其作用具有时间和浓度依赖性。下调Bcl-2、上调Bax表达,活化caspase-3是蛇葡萄素诱导Bel-7402细胞凋亡的可能机制之一。     

美洲大蠊提取物对人肝癌细胞Bel-7402作用机制的研究

目的探讨美洲大蠊提取物对人肝癌细胞Bel-7402的作用机制。方法 MTT比色法观察美洲大蠊提取物对人肝癌细胞Bel-7402增殖的影响,AnnexinV-FITC/PI双染色法研究美洲大蠊提取物对人肝癌细胞Bel-7402凋亡的影响,流式细胞术检测线粒体膜电位,DNA Ladder实验检测细胞凋亡,蛋白印迹法检测Bax、Bcl-2、Caspase-9、Caspase-3、Caspase-8蛋白的表达。结果美洲大蠊提取物可抑制人肝癌细胞Bel-7402增殖,IC50为28.2μg.mL 1,并可诱导人肝癌细胞Bel-7402凋亡,降低线粒体膜电位。DNA Ladder实验可见明显的梯形电泳图谱,蛋白印迹法显示Bax、Caspase-9、Caspase-3蛋白表达增强,Bcl-2蛋白表达减弱,Caspase-8蛋白表达无明显变化。结论美洲大蠊提取物可通过线粒体途径诱导人肝癌细胞Bel-7402凋亡。     

甲基莲心碱体外抑制人肝癌细胞增殖和侵袭的作用机制研究

目的探讨甲基莲心碱(neferine,Nef)对人肝癌HepG2和Bel-7402细胞侵袭的影响和作用机制。方法人肝癌HepG2和Bel-7402细胞体外培养,经不同浓度的甲基莲心碱处理后,CCK-8法检测细胞的增殖,Transwell细胞体外侵袭实验观察Nef对细胞侵袭能力的影响;免疫印迹检测Rho相关蛋白的表达。结果 CCK-8结果显示,与对照组比较,甲基莲心碱干预组抑制人肝癌HepG2和Bel-7402细胞增殖,并呈剂量-效应关系(P<0.05);Transwell细胞体外侵袭实验显示,3μmol·L~(-1)甲基莲心碱明显抑制HepG2和Bel-7402细胞的侵袭;免疫印迹结果显示,3μmol·L~(-1)甲基莲心碱作用HepG2和Bel-7402细胞12 h后,RhoA、RhoC和ROCK表达明显降低。结论甲基莲心碱可体外抑制HepG2和Bel-7402细胞的增殖和侵袭,其抑制肝癌细胞的侵袭可能与抑制RhoA、RhoC和ROCK蛋白的表达有关。     

5-氟尿嘧啶核苷前药脂质体对人鼻咽癌HNE-1细胞株增殖抑制与凋亡作用的影响

目的：研究5-氟尿嘧啶核苷前药脂质体对人鼻咽癌细胞株HNE-1细胞株增殖与凋亡作用的影响。方法本研究以人鼻咽癌HNE-1细胞株为研究对象,以5-氟尿嘧啶为对照,用四甲基偶氮唑蓝（MTT）法测定5-氟尿嘧啶核苷前药脂质体对HNE-1细胞的增殖抑制率;用流式细胞仪（FCM）测定5-氟尿嘧啶核苷前药脂质体作用与HNE-1细胞72h后细胞的凋亡率。结果5-氟尿嘧啶核苷前药脂质体对HNE-1细胞的IC50是5-氟尿嘧啶的1/3;浓度为0.043μg/mL 5-氟尿嘧啶和5-氟尿嘧啶核苷前药脂质体作用于HNE-1细胞的凋亡指数分别为（6.31±0.17）％、（19.53±1.79）％。结论本实验研究显示,与5-氟尿嘧啶相比较,5-氟尿嘧啶核苷前药脂质体对人鼻咽癌HNE-1细胞具有很好的生长增殖抑制作用,并且能够显著提高HNE-1细胞的凋亡率。     

自噬对多发性骨髓瘤细胞增殖的影响

目的：探讨自噬（ autophagy）对正常培养多发性骨髓瘤（ Multiple myeloma,MM）细胞株增殖的影响。方法 MM细胞株U266在正常培养条件下分别加入雷帕霉素和3－甲基腺嘌呤（3-methyladenine,3-MA）,以正常血清培养U266细胞及淋巴瘤Jurkat细胞株为对照组;分别检测细胞的增殖及凋亡水平;单丹磺酰尸胺（ monodansylcadaverine ,MDC）荧光染色法检测细胞自噬水平;逆转录PCR检测自噬相关基因mtor、Beclin1、Atg5在细胞内水平,蛋白质印迹法检测细胞内自噬相关蛋白轻链3I／Ⅱ（ LC3I／Ⅱ）含量。结果 U266细胞及Jurkat细胞内均存在自噬,但前者水平高于后者。雷帕霉素可诱导MM细胞发生自噬,3-MA对自噬有双重作用。雷帕霉素及3-MA下调细胞增殖水平。雷帕霉素及3-MA处理24 h可上调正常培养条件下U266细胞凋亡水平（1．7％±0．2％,19．1％±1．0％和16．8％±0．61％）。延长培养时间至72 h,雷帕霉素处理组凋亡水平无明显变化（16．9％±0．48％）。而3-MA处理组凋亡水平下降（9．0％±0．70％）。结论 MM细胞株内会存在一定水平的自噬,并通过实验证明其高于淋巴瘤Jurkat细胞株的自噬水平。在正常培养条件下加入了雷帕霉素及3-MA可抑制MM细胞的增殖,并可诱导细胞凋亡。     

美洲大蠊提取物逆转BEL-7402/5-Fu多药耐药性的作用及机制研究

目的 探讨美洲大蠊提取物 CⅡ-3和脱脂膏逆转耐5-氟尿嘧啶人肝癌细胞BEL-7402(BEL-7402/5-Fu)细胞多药耐药性的作用及可能的作用机制.方法 通过测定耐5-氟尿嘧啶人肝癌细胞BEL-7402细胞生长曲线和细胞凋亡率,以及P-糖蛋白(P-gp)的摄取情况,探索美洲大蠊提取物体外逆转耐5-氟尿嘧啶人肝癌细胞BEL-7402的作用.结果 CⅡ-3和脱脂膏对耐5-氟尿嘧啶人肝癌细胞BEL-7402的抑制率、逆转倍数及细胞凋亡率随浓度增加逐渐增大,且差异无统计学意义,说明CⅡ-3与脱脂膏对耐药细胞的逆转效果及诱导凋亡作用相当.CⅡ-3和脱脂膏能减弱P-糖蛋白的外排功能,且脱脂膏较CⅡ-3作用强,细胞内药物蓄积量较多.结论 美洲大蠊提取物CⅡ-3和脱脂膏能够有效逆转人肝癌耐5-氟尿嘧啶人肝癌细胞BEL-7402细胞的多药耐药性,其逆转作用机制主要通过诱导耐药细胞凋亡和抑制P-糖蛋白蛋白的表达.     

高车前素对肝癌细胞增殖的抑制作用及作用机制研究

目的研究高车前素对肝癌细胞增殖的抑制作用,检测高车前素对Janus蛋白酪氨酸激酶/信号转导和转录活化蛋白(JAK/STAT3)信号通路的影响。方法采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测不同浓度高车前素(1,5,10,25,50,100,200μmol/L)对Bel-7402肝癌细胞株增殖的影响。高车前素(5,25,100μmol/L)预处理Bel-7402肝癌细胞48 h,采用Transwell小室检测各组细胞的体外侵袭能力,蛋白印迹法检测p-STAT3、Twist1和Bcl-2蛋白表达差异。结果高车前素能浓度依赖性抑制Bel-7402肝癌细胞株增殖。高车前素(25,100μmol/L)预处理能显著减弱Bel-7402肝癌细胞的体外侵袭力,抑制p-STAT3、Twist1和Bcl-2蛋白表达(P<0.05)。结论高车前素可能通过JAK/STAT3通路,抑制p-STAT3、Twist1蛋白活性表达,从而抑制抗凋亡的Bcl-2蛋白表达,来发挥有效抑制肝癌细胞增殖的作用。     

17aα-D-高炔雌二醇-3-乙酯抑瘤活性及与γ-射线协同增效作用研究

目的:研究新型雌激素17aα-D-高炔雌二醇-3-乙酯(DHEA)的抑瘤活性。方法:对DHEA进行肺腺癌细胞系A549、肝癌细胞系Bel-7402的体外抑瘤试验,计算半数抑制浓度(IC50);在小鼠体内进行宫颈癌细胞U14抑瘤实验及与γ-射线协同作用的肉瘤细胞S180的抑瘤增效实验,计算抑瘤率。结果:体外试验中DHEA对A549和Bel-7402的IC50分别为12.28、17.79μg·mL-1;体内实验中对U14抑瘤率最高达64.3%,对S180抑瘤率合用及DHEA单用的抑瘤率均高于50%,且合用组更高。结论:DHEA具有体内、外抑瘤活性,且与γ-射线合用具有协同增效作用。     

上调miR-320a对注射用核糖核酸Ⅱ诱导的肝癌Bel-7402细胞凋亡和迁移的影响

目的研究上调miR-320a对注射用核糖核酸Ⅱ(BP素)诱导的肝癌Bel-7402细胞凋亡和迁移的影响。方法用定量逆转录-聚合酶链反应(qRT-PCR)检测miR-320a在正常肝细胞与肝癌细胞中的表达差异;将miR-320a mimic转染到Bel-7402细胞中,qRT-PCR法检测miR-320a的表达水平;CCK-8法检测注射用核糖核酸Ⅱ对肝癌细胞增殖的影响;FCM检测细胞周期分布及凋亡变化;Transwell法检测注射用核糖核酸Ⅱ对肝癌细胞迁移和侵袭的影响;Western blot检测细胞周期蛋白D1的表达及凋亡相关蛋白p53、Bax、Bcl-2,迁移相关蛋白MMP-3的表达。结果与正常肝细胞相比,miR-320a的表达水平在肝癌细胞中明显下调。转染miR-320a mimic的Bel-7402细胞命名为Bel-7402-miR-320a,CCK-8结果显示,给予注射用核糖核酸Ⅱ(100、200、300、400、500 mg·L~(-1))后,Bel-7402及Bel-7402-miR-320a细胞的增殖均受到了抑制。在Bel-7402和Bel-7402-miR-320a中,12h半数抑制浓度为250、200 mg·L~(-1),24 h半数抑制浓度为150、120 mg·L~(-1)。FCM检测结果显示,注射用核糖核酸Ⅱ可诱导Bel-7402、Bel-7402-miR-320a细胞周期阻滞在G0/G1期,上调miR-320a后细胞凋亡率明显增加。Transwell结果显示,与Control组和加药组相比,Bel-7402-miR-320a+Ribonucleic acidⅡ组细胞迁移和侵袭明显受到抑制。Western blot结果显示,注射用核糖核酸Ⅱ作用Bel-7402和Bel-7402-miR-320a细胞后,凋亡相关蛋白p53、Bax的表达增加,而Cyclin D1、Bcl-2、MMP-3蛋白的表达下调。结论 miR-320a在肝癌Bel-7402细胞中的表达水平明显低于正常肝细胞。注射用核糖核酸Ⅱ可以通过下调细胞周期蛋白Cyclin D1的表达,将细胞周期阻滞在G0/G1期,激活p53信号通路,下调Bcl-2、上调Bax,破坏Bcl-2/Bax的比例,促进人肝癌Bel-7402细胞的凋亡,并通过抑制MMP-3的表达抑制人肝癌细胞的迁移和侵袭。而过表达miR-320a后,可提高肝癌细胞对注射用核糖核酸Ⅱ的敏感性,增强注射用核糖核酸Ⅱ对肝癌细胞Bel-7402的作用。     

野木瓜果实总皂苷对BEL-7402/5 FU细胞多药耐药性的逆转作用

目的 研究野木瓜果实总皂苷对人肝癌耐药细胞BEL-7402/5 FU多药耐药(MDR)的逆转作用,并初步探讨其耐药逆转机制.方法 采用MTT法测定5-氟尿嘧啶(5-FU)、阿霉素(ADM)、丝裂霉素(MMC)和野木瓜果实总皂苷对BEL-7402细胞、BEL-7402/5 FU细胞的毒性及野木瓜果实总皂苷逆转MDR的效果;利用蛋白质印迹法检测P-糖蛋白(P-gp)的表达情况.结果 BEL-7402/5 FU细胞对5-FU、ADM、MMC的耐药指数分别为21.71,2.73,2.11;野木瓜果实总皂苷能有效抑制BEL-7402/5 FU细胞增殖,无细胞毒性剂量为5,10 μg/mL,逆转耐药倍数分别为1.36、1.93;野木瓜果实总皂苷联合5-FU作用BEL-7402/5 FU细胞,可降低P-gp蛋白表达.结论 野木瓜果实总皂苷能部分逆转BEL-7402/5 FU细胞MDR,其机制可能是通过下调P-gp的表达而实现的.     

半夏生物碱对人肝癌细胞Bel-7402增殖的影响

目的:研究半夏生物碱对人肝癌细胞Bel-7402增殖的影响。方法:将Bel-7402与半夏生物碱(400、200、100μg·mL-1)共同培养,采用MTT比色法测定半夏生物碱对Bel-7402增殖的影响,TUNEL技术检测其对Bel-7402细胞凋亡的影响,免疫组化SABC染色法检测B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)和Bcl-2相关X蛋白(Bax)的表达情况。结果:作用24h后,半夏生物碱高、中、低剂量(400、200、100μg·mL-1)对Bel-7402增殖有显著抑制作用,且抑制作用随着药物浓度增加而加强,最高抑制率可达到36.98%。TUNEL结果显示,半夏生物碱高、中、低剂量(400、200、100μg·mL-1)能有效诱导Bel-7402细胞凋亡,且呈量效关系。半夏生物碱高、中、低剂量(400、200、100μg·mL-1)可使Bax表达显著升高而Bcl-2表达显著下降。结论:半夏生物碱对Bel-7402生长有一定的抑制作用,可诱导其凋亡,其作用机制可能为上调Bax和下调Bcl-2。     

半边旗提取物5F-Na盐溶液的制备及体外抑癌作用研究

目的:制备5F-Na盐,并观察其对肺癌细胞株NCL-H460和肝癌细胞株BEL-7402的杀伤作用。方法:加入0.5mol·L-1NaOH使半边旗提取物5F完全溶解,稀HCl调节pH值为7.4,加入磷酸盐缓冲液使其pH值稳定,高效液相色谱法测定5F-Na盐溶液中5F的含量。通过MTT法检测所制备5F-Na盐溶液对肺癌细胞株NCL-H460和肝癌细胞株BEL-7402的杀伤作用。结果:所制备5F-Na盐溶液中5F为标示量的(100.51±2.18)%,其对NCl-H460细胞株24、48、72h的IC50分别为23.7、14.2、7.0μg·mL-1,对BEL-7402细胞株24、48、72h的IC50分别为157.3、41.5、21.0μg·mL-1。结论:本研究制备的5F-Na盐溶液能有效抑制癌细胞株生长增殖。     

人肝癌Bel7402/5-FU耐药株多药耐药与凋亡关系的研究

目的　从凋亡的角度探讨人肝癌细胞Bel74 0 2 / 5 FU多药耐药的分子机制。方法　采用SRB法检测Bel74 0 2 / 5 FU耐药株的多药耐药性 ,用AnnexinV FITC/PI双标流式细胞术检测Bel74 0 2细胞及其耐药株的凋亡程度 ,PI单染检测细胞周期变化 ,RT PCR方法检测凋亡相关因子bcl 2、bcl xl、bcl xs、bax、fas、p5 3和cpp32的表达情况。 结果　Bel74 0 2 / 5 FU耐药株具有多药耐药性 ;相同剂量 30 μmol·L-1及 15 0 μmol·L-15 FU处理 ,Bel74 0 2细胞凋亡明显增加 ,G0 /G1期增加 ,S期、G2 /GM减少 ,耐药株不出现凋亡增加及细胞周期改变 ;耐药株凋亡相关因子bcl xl、bcl xs和bax表达上调 ,p5 3和cpp32表达下调。 结论　人肝癌Bel74 0 2 / 5 FU耐药株的多药耐药性可能和凋亡减少有关 ,抗凋亡因子bcl xl表达上调 ,促凋亡因子 p5 3和cpp32表达下调可能参与Bel74 0 2 / 5 FU耐药株的多药耐药。     

Anti-proliferative activity of fenretinide in human hepatoma cells in vitro and in vivo

N-(4-hydroxyphenyl)-retinamide (fenretinide) is a synthetic derivative of all-trans-retinoic acid and induces apoptosis in several cancer cell lines. We determined the anti-cancer activity of fenretinide using human hepatoma cell lines, Bel-7402, HepG2 and Smmc-7721. An in-vitro 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide assay showed that fenretinide exhibited growth inhibition in these cell lines, with IC50 values ranging from 13.1 to 15.5 micromol/l. In Bel-7402 cells, apoptosis with 15 micromol/l fenretinide for 0 and 48 h was 3 and 48%, respectively. In-vivo studies using the Bel-7402 xenografted athymic mouse model showed tumor inhibition rates ranging from 37.2 to 57.2%, with fenretinide administration once per 3 days at the rate of 25-100 mg/kg. Western blot analysis further showed down-regulation of procaspase-3, X-linked inhibitor of apoptosis protein and poly(ADP-ribose) polymerase cleavage in Bel-7402 cells treated with 15 mumol/l fenretinide for 48 h. Overexpression of p53 was observed in a time-dependent manner, along with a decrease in the Bcl-2/Bax ratio. Depolarized mitochondrial membranes were found in fenretinide-induced apoptotic cells, in a time-dependent manner. We conclude that fenretinide effectively inhibits the proliferation of Bel-7402, both in vitro and in vivo. Both procaspase-3 and p53-mediated apoptotic pathways are involved in its potent anti-cancer activity.     

MiR-195 regulates cell apoptosis of human hepatocellular carcinoma cells by targeting LATS2

Recently, we have reported tissue- and stage-specific expression of miR-195 in human hepatocellular carcinoma cells and so far, not many reports discuss the function of this microRNA (miRNA). Expression profiling of miRNAs revealed a limited set of miRNAs with altered expression in drug resistant hepatocellular carcinoma cell line BEL-7402/5-FU compared to its parental BEL-7402 cell line. Real-time PCR confirmed down-regulation of miR-195 in BEL-7402/5-FU cells. Western blots were performed to determine protein levels of LATS2, P53 and CDK2. MTT analysed the cell proliferation activity. Flow cytometry were performed to determine apoptosis rate. Up-regulation of miR-195 increased expression of LATS2 and increased apoptosis of HCC cells, while Anti-miR-195 treatment inhibited expression of LATS2. miR-195 over-expression inhibited the luciferase activity of a LATS2 3' untranslated region-based reporter construct in BEL-7402/5-FU cells. These results indicate that miR-195 could increase cell apoptosis by targeting LATS2 in hepatocellular carcinoma cells.     

Synthesis of substituted benzylamino- and heterocyclylmethylamino carbodithioate derivatives of 4-(3H)-quinazolinone and their cytotoxic activity

A new series of substituted benzylamino- and heterocyclylmethylamino carbodithioate derivatives of 4-(3H)-quinazolinone were synthesized via four steps starting from 2-amino-5-methylbenzoic acid and initially screened against A-549 (human non-small cell lung cancer), HCT-8 (human colon cancer), and Bel-7402 (human liver cancer) cell lines at the single concentration of 5 microg/mL using the colorimetric MTT assay. The IC50 values were determined for the compounds reaching > or = 70% inhibition in primary screening by serial dilution. Among the newly synthesized compounds, 9n exhibited potent in vitro cytotoxicity against A-549, HCT-8, and Bel-7402 cell lines with the IC50 values of 1.65, 0.93, and 1.43 microM, respectively.