应用RT-PCR检测基因的体外转录活性

体外转录分析已广泛应用于分子生物学领域．由于体外转录所产生的ＲＮＡ的量极少,需有灵敏的方法检测生成的ＲＮＡ．本研究发展了一种基于ＲＴ－ＰＣＲ技术鉴定体外转录产物的方法．将待研究基因的启动区与任何一段已知的含转录起始位点的编码序列相连,制备成体外转录的模板．体外转录后,用ＤＮａｓｅⅠ将ＤＮＡ模板完全降解;生成的ＲＮＡ经反转录合成ｃＤＮＡ;再以ｃＤＮＡ为模板,用相应的引物进行ＰＣＲ扩增,产物用琼脂糖凝胶电泳检测．该法灵敏度高,操作简便,无需同位素,且体外转录模板制备方便．还可结合其他技术,如Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹分析,能获得更高的灵敏度．     

汉坦病毒S基因的克隆及体外转录

目的:通过基因克隆和体外转录,获得汉坦病毒汉滩型76118株及汉城型R22株S基因的RNA全长cRNA,为汉坦病毒病原学检测提供阳性定量标准品。方法:设计汉滩型76118株和汉城型R22株S基因克隆引物,PCR获得相应片段,分别克隆至含双启动子的PCRⅡ载体中,测序鉴定无误后,重组质粒分别经内切酶SpeⅠ、SacⅠ线性化,用T7 RNA聚合酶进行体外转录,产物经DNase处理、纯化后测定浓度,经RT-PCR验证。结果:获得汉滩型76118株及汉城型R22株S基因的cRNA片段,并可准确定量其拷贝数,76118株和R22株的质量浓度分别为80、17.58 ng/μL。结论:获得的cRNA样品可作为汉坦病毒核酸快速检测方法的阳性定量标准品。     

结合RT-PCR体外扩增检测HCVssRNA的研究

本研究旨在以HCV为平台,在简化RT-PCR基础上,结合体外转录,建立一种特异、高效、简便的检测血清中HCVRNA的体外转录合成系统。本法扩增终产物为特定极性的ssRNA,其特异性经凝胶电泳和斑点杂交确定;RNA定量分析结果显示本法核酸扩增效率高于巢式PCR近20倍。     

大鼠肝tRNA^Ile基因的克隆与体外转录

采用ＰＣＲ扩增出大鼠肝ｔＲＮＡ＾Ｉｌｅ基因,构建了重组质粒ｐＧＷＩＷ,并用Ｔ７ＲＮＡ聚合酶／启动子系统对其进行了体外表达。经过对转录产物片段大小及运用Ｎｏｒｔｈｅｒｍｂｌｏｔ鉴定,证明了获得了不含修饰核苷酸的大鼠肝ｔＲＮＡ＾Ｉｌｅ。生物学活性检测显示：合成基因体外转录产物氨基酰经活性是天然ｔＲＮＡ的４０％,提示修饰核苷酸在哺乳动物Ｉｌｅ－ｔＲＮＡ合成酶的识别过程中起重要作用。     

结合RT-PCR体外扩增检测HCV ssRNA的研究

本研究旨在以HCV为平台,在简化RT-PCR基础上,结合体外转录,建立一种特异、高效、简便的检测血清中HCV RNA的体外转录合成系统.本法扩增终产物为特定极性的ssRNA,其特异性经凝胶电泳和斑点杂交确定;RNA定量分析结果显示本法核酸扩增效率高于巢式PCR近20倍.     

组蛋白与hAMFR基因启动子的结合对体外转录活性的影响

采用从鸡血红细胞中分离纯化的组蛋白,从ＨｅＬａ细胞核中萃取的含有ＲＮＡ聚合酶Ⅱ和多种Ⅱ类基因转录因子的可溶性抽提物,以及从非洲爪蟾卵细胞核中撮以的萃取物热处理物上清用于核小体构建,以含有人自泌移动因子受体基因启动子序列的ＤＮＡ片段为模板进行体外转录实验,结果表明,组蛋白和转录因子在ｈＡＭＦＲ基因启动子序列上的竞争性结合对转录活性具有重要的影响作用,在启动子区域预先构建的核小体能够抑制转录活性;     

低氧大鼠脑线粒体体外转录活性的研究

目的：探讨低氧对大鼠脑线粒体DNA表达的影响及其与能量生成的关系。方法：雄性Wistar大鼠随机分为3组：急性低氧组（AH）、慢性低氧组（CH）和对照组,其中急、慢性低氧组动物分别连续暴露于模拟海拔4000m高原3d(AH)和40d（CH）。分离脑线粒体,分别测定线粒体体外转录活性、F0F1－ATP酶活性以及ATP对线粒体体外转录的影响。结果：急性低氧大鼠脑线粒体体外转录活性及F0F1－ATP酶活性显著降低,慢性低氧时有所回升,两者呈线性相关。ATP对大鼠脑线粒体体外转录活性呈双相效应。结论：低氧时脑线粒体转录活性改变可能参与低氧抑制线粒体能量代谢的机制,ATP可能通过反馈作用对线粒体转录进行微调。     

可诱导结瘤基因nodA的体外转录

报道结瘤基因nodA的体外诱导转录 :当转录体系中有一定量的调控蛋白NodD和植物诱导分子柚皮素 (naringenin )存在时 ,在体外转录的产物中始终存在着与体内转录相一致的特异产物。体外诱导转录表明 ,可诱导结瘤基因nodA在体内转录时 ,可能同样存在NodD蛋白、柚皮素诱导剂分子和nodA启动子的某种方式的直接相互作用     

SAM-V核糖开关RNA体外转录体系优化

为了提高RNA体外转录效率,选取SAM-V核糖开关晶体结构模板对RNA体外转录体系进行优化。结果表明:目的RNA相对百分含量在反应时间和Mg2+添加浓度分别为8h和85m M/L时达到最高值,优化体系较标准体系目的RNA相对百分含量提高了一倍。我们的工作为下一步准备SAMV核糖开关晶体打下了基础。     

双重实时逆转录PCR检测G2、G3型轮状病毒方法的建立

目的建立一种双重实时逆转录PCR,用于G2、G3型轮状病毒的快速检测和定量分析。方法采用G2、G3型轮状病毒VP7基因特异性引物/探针和体外转录RNAs,建立双重实时逆转录PCR,在同一反应管中同时检测G2、G3型轮状病毒VP7基因;并对该方法的灵敏度、重复性、有效性进行验证。结果双重实时逆转录PCR标准曲线R~2>0.99,扩增效率在90%～110%之间。灵敏度可达10~1拷贝,不同浓度体外转录RNAs重复性检测CV均≤4.18%。单重和双重实时逆转录PCR均可以对G2、G3型单价样本和混合样本进行有效检测,试验内CV均≤2.08%,试验间CV均≤2.52%。单重和双重实时逆转录PCR检测同一样本时具有良好的一致性,检测结果之间差异无统计学意义(P>0.05),两种方法相关性较好(R~2>0.95)。结论本方法特异、快速、灵敏且重复性好,可以在同一反应管中同时检测两种目的基因,缩短了检测周期,降低了检测成本和污染风险,为轮状病毒的分型和定量提供了更为快速、有效的检测方法。     

HCV5′端非编码区cDNA的体外转录

采用逆转录聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）从广东省一例慢性丙型肝炎病人血清中获得丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）５′端非编码区（５′ＮＣＲ）３０２ｂｐ的ｃＤＮＡ片段,经补齐和提纯后插入ｐＵＣ１９质粒,获得的重组体ｐＵＮ进行序列测定,将ｐＵＮ的目的基因亚克隆进体外转录载体ｐＳＰＯＲＴＩ多克隆位点的ＥｃｏＲｆｆＩ和ＰｓｔＩ切点之间,所得重组体ｐＳＮ线性化后由Ｔ７ＲＮＡ多聚酶及ＳＰ６ＲＮＡ多聚酶引导体外转录反应,产物     

斑马鱼Gfi1.1基因的克隆及其体外转录

目的:克隆斑马鱼Gfi1.1基因的全长cDNA,运用T7 RNA聚合酶对含有Gfi1.1基因的ORF区进行体外转录,在体外合成5端带有帽子结构的Gfi1.1 mRNA分子,为后续研究斑马鱼Gfi1.1基因的功能打下基础。方法:应用RT-PCR从斑马鱼组织中扩增出Gfi1.1 cDNA片段,经回收纯化与pGM-T载体连接并转化感受态细菌DH-5α,通过蓝白筛选酶切鉴定阳性菌落,小量提取质粒,Nde I限制性内切酶线性化pGM-T-Gfi1.1质粒,运用T7 RNA聚合酶对Gfi1.1基因进行体外转录及加帽。经凝胶电泳对目的片段进行鉴定。结果:RT-PCR扩增获得约1.2 kb的DNA片段,DNA序列分析的结果与GenBank上的序列(NM_001020776)一致,酶切线性化及体外转录加帽pGM-T-Gfi1.1,凝胶电泳鉴定RNA分子大小与预期完全一致。结论:成功克隆斑马鱼Gfi1.1基因并体外转录及加帽pGM-T-Gfi1.1。     

PCR扩增技术

到今年,PCR方法已经渡过了它的第25个生日,由于其扩增的性能,PCR技术已经成为实验室中不可或缺的一门技术。多年来,研究人员不断改善其性能,希望扩大PCR技术的应用范围。     

基于核酶技术的人线粒体色氨酸tRNA的高效转录及其活性鉴定

利用T7RNA聚合酶(T7 RNA polymerase,T7 RNAP)的体外转录方法因其简便、高效而在RNA制备中得到广泛应用,但该法由于T7RNAP的启动子跨越转录起始位点而会导致转录产物多出附加序列;如果去掉T7启动子的转录起始位点,则会严重降低T7RNAP的转录活性。本实验很好地消除了以上弊端,将T7RNAP的高效转录系统与核酶高度专一的自剪切技术相结合,成功构建了一种不影响转录效率的体外转录方法,而且转录后核酶能够在设计的特定位点进行自剪切并释放出目的RNA,得到了活性达113.6pmol/μg的人线粒体色氨酸tRNA(HmtRNATrp(UCA))。该方法转录效率高、重复性好,适合RNA的大量精确制备。     

实时定量PCR技术及其应用

实时定量PCR(Real—time Quantitative Polymerase Chain Reaction,RQ—PCR)技术是20世纪90年代中期发展起来的一种新型核酸定量技术。该技术具有实时监测、快速、灵敏、精确等特点,是对原有PCR技术的革新,扩大了PCR的应用范围。本文综述了RQ—PCR技术的原理、RQ—PCR仪、RQ—PCR实时定量检测系统及其应用。     

嵌合型HCV全长cDNA的构建及体外转录制备感染性RNA的研究

构建HCV la/1b嵌合型全长cDNA克隆,进行体外转录,脂质体法转染HepG2细胞,以RT-PCR法检测HCV正、负链RNA,Western印迹检测HCV蛋白表达.结果表明,细胞在转染后8代(约35d)内,能间断检测到HCV正、负链RNA以及相对分子质量约70000的HCV NS3蛋白,证明该HCV嵌合体可以在细胞中复制和表达.本研究表明含有该嵌合型全长cDNA的质粒可以为后续HCV的研究提供大量可重复的性质均一的病毒模板,有助于深入了解HCV的复制机制.     

抗马铃薯晚疫病质粒的分子克隆及其体外PCR扩增

从一株假单胞菌中分离其质粒DNA,并将其转化到大肠杆菌DH5α中。通过晚疫病抑菌实验证明此菌对马铃薯晚疫病有很强的抑制作用,对该质粒进行纯化和限制性酶切位点分析,将此质粒重组到含有绿色发光蛋白基因的质粒载体中。获得的重组质粒在体外经PCR扩增证明抗晚疫病的重组质粒已克隆到含有绿色光蛋白基因的质粒载体中。     

基于RefSeq的人类基因荧光定量PCR引物库的构建

利用NCBI提供的RefSeq序列,通过BLAT、Sim4和自主开发的剪接比对程序Ealter1.0对人类RefSeq转录本进行外显子预测,根据预测的外显子信息,采用自主开发SYBR Green I Real Time PCR引物设计程序E-qPCR-Design1.0高通量设计21,118对SYBR Green I Real Time PCR引物,同时选取5000条基因进行SYBR Green I Real Time PCR引物验证,95.92%的基因引物取得良好效果,1.64%的基因引物产生引物二聚体,1.08%的基因引物有非特异性扩增,通过生物信息技术分析与实验验证,建立了基于RefSeq的人类基因荧光定量PCR引物库。