犬瘟热病毒水貂分离株F1基因的克隆表达

本研究旨在利用基因工程的方法,制备犬瘟热(canine distemper,CD)疾病诊断用抗原。提取犬瘟热病毒基因组,RT-PCR扩增犬瘟热病毒(canine distemper virus,CDV)F1基因序列,克隆并测序。将F1基因定向克隆到原核表达载体pET28a多克隆位点,阳性重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,IPTG诱导表达。SDS-PAGE和Western blotting鉴定表达产物,并用Ni柱亲和层析纯化目的蛋白。结果显示表达的F1重组蛋白能与犬瘟热标准阳性血清发生反应,具有良好的反应原性,可以作为犬瘟热疾病的诊断用抗原。     

水貂源犬瘟热病毒F基因真核表达载体的构建及鉴定

通过T-A克隆技术,成功地构建了克隆载体PMD-18T-CDVF,用KpnI和BamHI双酶切克隆质粒PMD-18T-CDVF后,回收F基因,并将此基因定向克隆至相同双酶切回收后的pcDNA3.1真核表达载体中,获得重组质粒pcDNA3.1-CDVF。经DNA测序、限制性内切酶分析和PCR鉴定,证实成功地构建了重组质粒,从而为研究犬瘟热新型疫苗奠定了基础。     

犬瘟热病毒贵州株融合蛋白基因原核表达质粒的构建

为了研究犬瘟热病毒贵州株(CDV-GZ1)完整融合蛋白(F),试验采用PCR方法以pMD18-F质粒为模板,利用特异性引物扩增获得大小为1 989 bp的目的 DNA,并将其克隆至pET32a(+)原核表达载体中,获得重组质粒pET32a(+)-F。结果表明:目的基因插入位置和阅读框均正确,说明F基因原核表达质粒构建成功;质粒pET32a(+)-F在BL21(DE3)中经诱导表达未获目的蛋白,说明CDV融合蛋白可能不适合在该表达系统中进行完整蛋白的表达。     

水貂犬瘟热病毒受体SLAM的原核表达

为了获得犬瘟热病毒受体信号淋巴激活分子(SLAM)蛋白,本试验以pMD18-T-SLAM为模板,应用PCR方法扩增得到水貂SLAM基因,将SLAM基因连接到经EcoRⅠ和SalⅠ双酶切处理后的pGEX-6p-1原核表达载体中,获得重组质粒pGEX-6p-1-SLAM,转化至大肠埃希菌BL21中进行诱导表达,并通过SDS-PAGE和Western blot进行鉴定。结果表明,目的基因插入位置和阅读框正确,经诱导成功表达出分子质量约为63.2ku的SLAM-GST融合蛋白,该融合蛋白能与鼠抗GST标签单克隆抗体发生特异性反应,具有良好的抗原性。     

犬瘟热病毒小熊猫株H、F和N基因的克隆及表达

根据GenBank中发表的犬瘟热病毒（CDV）的核苷酸序列，设计并合成了扩增CDVH、F和N基因的3对引物，经RT—PCR分别扩增获得了CDV小熊猫株（LP株）H、F和N基因，并对H、F及N基因进行了克隆和序列测定。序列分析表明，CDV LP株属于强毒谱系，与CDV流行株的亲缘关系近．H基因含有较多潜在的糖基化位点．F和N基因相对比较保守。将CDV LP株H、F和N基因克隆入真核表达栽体pVAX1的CMV启动子下游，构建了CDV基因疫苗表达载体pVAXLPH、pVAXLPF、pVAXLPN，体外转染BHK-21细胞．用间接ELISA方法检测到目的蛋白的表达。用构建的3个表达质粒免疫小鼠，从小鼠血清中检测到了抗CDV抗体．初步证实用CDVH、F和N基因作为核酸疫苗免疫动物，可以激活机体的免疫应答。     

水貂肠炎病毒VP2基因原核表达及鉴定

采用PCR技术扩增MEV VP2基因,将该基因片段定向克隆原核表达载体PET-30a,构建MEV VP2基因原核表达重组质粒PET-30a-VP2。将该重组质粒转化到宿主菌BL21(DE3),IPTG诱导后进行SDSPAGE和Western-blotting分析。结果表明:该基因全长1 755 bp,其目的基因序列完全正确,能编码584个氨基酸。利用载体上的His标签对其进行纯化,经SDS-PAGE鉴定该重组蛋白以包涵体的形式存在,大小约为70 ku;Western-blotting验证该重组蛋白具有被抗MEV血清识别的特性,具有良好的反应原性,可为MEV基因工程亚单位疫苗、免疫学诊断方法等提供参考。     

水貂肠炎病毒VP2基因的原核表达及鉴定

在分析水貂肠炎病毒VP2基因主要抗原位点分布的基础上,设计了1对特异性引物,克隆一段长为846 bp,编码主要抗原位点的基因片段。将该基因片段定向插入表达载体PET-32a中,转化BL21(DE3)菌株,IPTG诱导实现高效表达。诱导表达比较实验结果表明,在37℃,IPTG浓度为1.0 mM,诱导时间为6 h,诱导表达达到最大效率。重组蛋白以包涵体形式存在,大小约为50 KD,应用兔抗水貂MEV抗体,经Western-blotting验证该重组蛋白具有MEV的抗原性,可为今后抗MEV单克隆抗体制备及相关免疫学检测方法的建立提供良好的抗原物质。     

水貂和狐犬瘟热病毒F基因的克隆与序列分析

为探寻免疫失败的原因,对山东某养殖场免疫后的发病水貂和狐犬瘟热组织病料分别提取RNA进行RT-PCR扩增。将PCR得到的部分F基因克隆到pMD18-T载体上测序,并与疫苗株ND进行序列分析。结果表明,水貂和狐的CDV与OND的核苷酸同源性为98.6%9、8.6%,氨基酸同源性为98.0%9、8.0%。水貂和狐两者核苷酸同源性为98.0%,氨基酸同源性为95.9%。     

一株水貂犬瘟热病毒的分离与鉴定

为寻找免疫失败的原因,有效防治犬瘟热的流行,对临床一水貂犬瘟热疑似病例,取其肝、脾、脑等组织研磨后接种Vero和BHK细胞分离病毒,并对分离毒株进行一系列鉴定。通过电镜观察,发现了大小约150 nm的副黏病毒样粒子。结果表明,分离株对鹅、鸡、小鼠、家兔、山羊、猪红细胞均无凝集性,该分离株的毒价TCID50为10-4.87;分离株病毒对乙醚、氯仿敏感,病毒的核酸型为RNA。经间接免疫荧光试验,接种病毒的BHK细胞出现特异性的亮绿色荧光。对分离株和对照毒株分别提取RNA进行RT-PCR扩增,最后得到与预期扩增片段(294 bp)相符的核酸电泳带,充分证明分离病毒为犬瘟热病毒。     

水貂IFN-β基因的克隆与原核表达

从水貂基因组中通过PCR方法克隆得到β干扰素基因(IFN-β),将IFN-β成熟肽插入原核表达栽体pET32a,在E.coli BL21(DE3)工程菌中表达重组蛋白.结果表明,IFN-β片段长561 bp,与已报道的水貂IFN-β基因相比较同源性为100%,IFN-β成熟肽可编码179个氨基酸.重组质粒经ITPG诱导6 h后蛋白表达产物较高,表达量占菌体表达量的50%,分子质量约为34 ku,与预期结果相符.     

犬瘟热病毒OP株囊膜糖蛋白F基因片段表达产物的免疫原性

根据已发表的犬瘟热病毒OP株核酸序列设计2对引物,以犬瘟热病毒OP株感染Vero细胞收获病毒提取的RNA为模板,应用RT-PCR扩增出F基因的769、832 bp片段.将PCR产物按正确的阅读框架定向克隆进pGEX-6p-1载体中谷胱甘肽-S-转移酶(GST)基因的下游,再将重组质粒转化入宿主菌BL21中,在37℃1.0 mmol/LPTG诱导下,F基因2个片段获得了良好的表达.表达产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定,确定所表达的融合多肽大小分别为54 000、56 000.将表达产物回收后混合免疫小鼠,IFA显示,免疫小鼠血清能与病毒感染细胞呈现特异反应,并表现出116的中和抗体活性,表明体外表达的F多肽保留了天然蛋白的部分抗原性.     

非典型犬瘟热病毒核衣壳蛋白基因序列分析及其在大肠杆菌中的表达

为分析当地非典型犬瘟热病毒(CDV)核衣壳蛋白(N)基因的序列特征及其表达产物的抗原性,根据已发表CDV的N基因序列设计引物,用RT-PCR方法从引起非典型症状的CDV细胞培养物中扩增N基因,进行克隆和序列分析,结果表明:该非典型CDV的N基因与已发表的12个CDV强毒株的核苷酸序列和氨基酸序列同源性分别在96.6%～99.2%和97.9%～99.4%之间,与已发表的4个CDV疫苗弱毒株的同源性分别在93.2%～93.6%和96.4%～97.5%之间;在N基因系统发育进化树上,非典型CDV与12个强毒株处在同一亚群,而且与9个中国分离毒株的亲缘关系近于3个国外毒株。N基因在大肠杆菌中表达的重组N蛋白的分子量为62 ku,主要以包涵体的形式存在;用western blot分析,重组N蛋白可与CDV阳性血清发生特异性反应;以纯化的重组N蛋白为抗原建立的CDV抗体间接ELISA检测方法具有良好的特异性。     

犬瘟热病毒A株核衣壳蛋白基因的克隆、表达及特性分析

根据GenBank中A75／14株犬瘟热病毒（CDV）核衣壳蛋白（N）基因的核苷酸序列设计合成一对引物，经RT-PCRgA病毒总RNA中扩增出1600bp的N基因，将其克隆于pMD18-T载体对其进行序列分析。结果表明A株CDV与其它毒株N基因序列的同源性较高。将N基因定向克隆于原核表达栽体pPROEXX^TM HT，用重组质粒pPROEX^TM HT-N转化感受态E．coli DH5a细胞，用IPTG于37℃诱导表达了分子量约63Ku的重组N蛋白，占菌体总蛋白18％。经Western blot分析证实所表达的重组N蛋白具反应活性，将表达产物用ProBond^TM纯化试剂盒进行了纯化。用所获得的重组蛋白免疫家兔制备的多克隆抗体可与CDV全病毒发生特异性反应，经琼扩试验测定其效价为1：16。本实验为下一步用重组N蛋白作为诊断用抗原，建立特异的CDV抗体检测方法奠定了基础。     

犬瘟热病毒R／20-8株核衣壳蛋白基因的克隆和表达

应用RT-PCR技术扩增出犬瘟热病毒（CDV）核衣壳（N）蛋白基因的高度保守序列，将其克隆至质粒pMD18-T中，获得了重组质粒pMD18-T-N。将N基因的目的片段克隆到表达载体pGEX-4T-1中谷胱甘肽转移酶（GST）基因的下游，并将该重组质粒转化大肠杆菌BL21株，经IPTG诱导，N基因融合蛋白获得了高效表达。SDS-PAGE电泳和Western—blot分析结果显示，表达产物的分子质量为55ku，与CDV标准阳性血清呈阳性反应。表明，大肠杆菌表达的CDVN蛋白在免疫原性上与天然N蛋白具有一定的相似性，可作为诊断用抗原。     

犬瘟热病毒F基因克隆及序列分析

从犬瘟热病毒检测阳性的3份(KM1、KM2、KM3)病料中进行F基因的克隆测序,并与其他5株代表性参考毒株的同一基因序列进行比较(国内外流行毒株以及疫苗毒株).结果表明,KM1与KM2有95.7%的核苷酸同源性,其氨基酸序列完全相同;KM3株与KM1有1个氨基酸的差异,与参考的5株犬瘟热病毒的F基因核苷酸和氨基酸分析同源性分别为91.1%～96.5%和96.8%～100%.     

犬瘟热病毒蓝狐分离株融合蛋白基因的序列分析

根据已发表的犬瘟热病毒(Canine distemper virus,CDV)Onderstepoort株序列设计1对引物,RT-PCR法扩增出约1 000 bp的融合蛋白基因片段,通过T-A克隆技术,将PCR产物克隆至pMD18-T载体。序列分析表明CDV蓝狐分离株F蛋白基因片段由1 044 bp组成,编码348个氨基酸,与其它CDV25259株、2544-Han95株、A75-17株、DOGDK91C株、5804P株、ONP株、PDV-2株核苷酸序列同源性分别为94.5%、94.1%、94.7%、94.2%、94.2%、97.6%和94.9%;氨基酸序列的同源性分别为98.6%、97.1%、98.0%、98.0%、98.3%、97.7%和98.6%;与其它CDV毒株相比,蓝狐分离株存在核苷酸缺失突变(1 030位～1 038位)和氨基酸缺失突变(344位～348位)。     

犬瘟热病毒重组核蛋白间接ELISA方法的建立

将已构建成功的重组质粒pGEX-4T-1-N转化大肠杆菌BL21株,在最佳诱导条件下获得犬瘟热病毒(CDV)重组N蛋白。将表达产物纯化后进行SDS-PAGE和W estern-b lot分析,与CDV标准阳性血清呈阳性反应。本研究初步建立了以纯化的N蛋白为包被抗原的间接ELISA检测方法,经初步试验证实,该方法敏感、特异。试验结果表明,大肠杆菌中表达的CDV N蛋白在免疫原性上与天然核衣壳蛋白具有较高相似性,可作为诊断用抗原。     

RT-PCR检测贵州犬瘟热病毒

根据犬瘟热病毒H基因核苷酸序列 ,设计合成一对引物对贵州临床诊断为犬瘟热 (CD)病死犬的心、肝、脾、肾、粪便进行RT PCR检测。结果表明 :从心、脾、肾病料上清液中可扩增出 760bp的特异性带 ,与预期扩增片段长度相同 ;粪便和肝脏上清液RT PCR结果为阴性 ,但粪便上清液接种Vero细胞后连续传代 3代 ,每代细胞培养液RT PCR结果均为阳性 ;在检测的 2 2条病死犬中 ,有 1 9条病死犬检测到犬瘟热病毒H基因的特异性核酸片段 ,阳性率为 86 4% (1 9/ 2 2 )。     

同时检测犬瘟热病毒和犬细小病毒双重PCR方法的建立

为建立可以同时检测犬瘟热病毒(CDV)和犬细小病毒(CPV)的双重PCR方法,本研究根据GenBank登录的CDV N蛋白序列和CPV NS基因保守序列,设计合成2对特异性引物。通过优化反应条件,对CDV阳性病毒株反转录后的cDNA模板和CPV的DNA模板进行双重PCR扩增,同时得到2条与试验设计相符的669 bp(CDV)和392 bp(CPV)特异性条带,建立了同时检测CDV和CPV的双重PCR方法。实验结果表明:在同一PCR反应体系中可以同时检测这2种病毒,而对犬腺病毒Ⅰ型、犬腺病毒Ⅱ型、狂犬病毒检测均为阴性;CDV和CPV的最低检出限分别为101.8TCID50和101.4TCID50。采用该方法对在黑龙江省不同地区所采集的30份犬病料样品进行检测,CDV阳性率为30%;CPV阳性率为23.33%,表明建立的PCR方法可以用于临床诊断。