大豆锰超氧化物歧化酶基因在乳酸乳球菌中的分泌表达

为使大豆锰超氧化物歧化酶（Mn superoxide dismutase,MnSOD）在乳酸乳球菌中高效表达,将克隆的MnSOD基因开放阅读框序列分别重组到质粒pNZ8149和经改造的质粒pNZS上,表达载体pNZ-SOD和分泌表达载体pNZS-SOD,将两者分别以电穿孔法转化乳酸乳球菌L. lactis NZ3900,经Elliker琼脂板筛选、聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）、酶切鉴定正确后,获得的两重组菌株加入Nisin进行诱导表达,对L. lactisNZ3900/pNZ-SOD和L. lactis NZ3900/pNZS-SOD的表达产物进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodiumdodecyl sulfate - polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE）和酶活性对比分析。结果显示：L. lactis NZ3900/pNZS-SOD菌株表达SOD总活性约是L. lactis NZ3900/pNZ-SOD菌株的1.6 倍,是L. lactis NZ3900/pNZ8149的13.5倍,且可将表达的约2/3的SOD分泌到胞外,表明经改造的乳酸菌分泌表达系统L. lactis NZ3900/pNZS能够分泌表达SOD,并增强SOD的表达。     

基于pyrF的乳酸乳球菌食品级表达载体的构建

基于pyrF筛选标记和来源于乳酸乳球菌(Lactococcus lactis,L. lactis)的基因组DNA为表达元件,构建L. lactis食品级表达载体,用于食品和药用多肽的表达和生产。首先,利用NZ3900 pyrF基因列构建同源重组突变盒,构建NZ3900ΔpyrF突变株;然后,分别以来源于L. lactis的repA和repC基因为复制元件、pyrF基因为筛选标记、P₃₂和P₈为启动子、以及Tusp₄₅和TpepN为终止子,构建食品级表达质粒pLD;最后以绿色荧光蛋白ZsGreen为报告基因,验证ZsGreen在NZ3900ΔpyrF突变株的表达及pLD-ZsG的遗传稳定性。实验结果表明,原养型ZsGreen阳性转化子可在普通Elliker培养基中正常生长,在荧光显微镜下观察到明显的绿色荧光信号;此外,PCR和Western blotting也证实ZsGreen能在NZ3900中表达且能稳定传代至30代,说明pLD食品级表达载体构建成功且使得外源蛋白在L. lactis中稳定表达。综上所述,基于pyrF营养...     

乳酸乳球菌NICE系统食品级载体pRNB48的构建

乳酸菌食品级NICE系统是目前较理想的可控制蛋白质生产的食品级诱导表达系统。实验构建的食品级表达载体pRNB48含α-aga食品级选择标记、θ型复制子和nisA启动子,与宿主菌L.lactisNZ9000共同构成乳酸乳球菌食品级NICE系统,可用于目的基因在乳酸乳球菌中高效诱导表达。     

乳酸乳球菌两组分食品级NICE系统载体的构建

乳酸菌食品级NICE系统是目前较理想的可控制蛋白质生产的食品级诱导表达系统。本实验构建的食品级表达载体pRNA48含α-aga食品级选择标记、θ型复制子和nisA启动子，与宿主菌L．hctis NZ9000共同构成乳酸乳球菌食品级NICE系统，可用于目的基因在乳酸乳球菌中高效诱导表达。     

构建食品级表达纳豆激酶的乳酸乳球菌重组菌株

构建整合型表达载体pFY008,以HisH基因作为同源重组的靶位点,通过同源重组将含有纳豆激酶原基因的表达盒PnisA-aprN整合到乳酸菌的基因组上,实现纳豆激酶在乳酸乳球菌中食品级的表达。构建的食品级基因工程菌安全性高、稳定性好,并赋予了其溶栓的功能。     

L-乳酸脱氢酶基因在乳酸乳球菌KLDS4.0325中的表达

本文研究了在m RNA转录水平上三种L-乳酸脱氢酶基因在乳酸乳球菌KLDS4.0325不同生长阶段的表达情况。以16s r RNA作为内参基因,应用实时荧光定量PCR技术测定不同生长阶段的菌体中L-乳酸脱氢酶基因(ldh、ldh X和ldh B)表达的动态变化规律。该菌株的生长曲线呈S型,培养2~6 h为菌体的生长对数期,随后进入稳定期。生长曲线的测定表明该菌株生长力极其旺盛;16s r RNA、ldh、ldh X和ldh B基因的扩增效率曲线显示,内参基因与目的基因的扩增效率一致且接近100%,这说明利用相对荧光定量法能够较好的反应目的基因的表达量;ldh、ldh X和ldh B基因在菌体生长的3个时间点(6 h、9 h和12 h)都有一定量的表达,随着菌体的不断生长,基因表达的变化均呈现显著性上升趋势,且上升幅度不断增加,在12 h时基因表达量达到最大值。其中ldh基因在的表达量在菌体生长的3个时间点存在显著性差异,而ldh X、ldh B基因的表达量存在极显著差异。     

原核表达重组牛凝乳酶原及重组牛凝乳酶酶学特性

凝乳酶能够专一性裂解κ-酪蛋白,是制造干酪的关键酶。运用大肠杆菌表达系统对牛凝乳酶原进行了原核表达和初步纯化,活化重组凝乳酶原及测定凝乳活性,对重组凝乳酶的酶学特性进行分析。结果表明:大肠杆菌表达的重组蛋白约占菌体总蛋白的66.3%,每升培养液可纯化约200 mg的重组凝乳酶原,活化后的凝乳酶活力可达600 000 SU/g。经测定凝乳酶最适作用温度为57⁶2℃,并在pH 262℃,并在pH 2⁷、低于40℃的温度范围内稳定。金属离子中Al3+,Fe3+和Cu2+能显著增强酶活;胃蛋白酶抑制剂pepstatin A对酶有明显的抑制作用。     

乳酸乳球菌表达系统及其启动子的研究进展

乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）是工业应用中一种重要的模式菌株,具有非致病性、分泌蛋白能力强、容易分离培养等特性,是异源蛋白表达和分泌的理想宿主。高效可控的启动子是实现外源蛋白高效表达的关键因素之一。根据诱导机制,启动子可分为组成型和诱导型。本文阐述了乳酸乳球菌表达系统及其启动子结构,总结了生物信息学预测启动子及筛选克隆新启动子的方法,并对乳酸乳球菌启动子未来的研究方向进行了展望,可为深入研究启动子的结构和功能并进一步在工业上生产外源蛋白提供参考。     

具有溶栓活性的重组乳酸乳球菌的构建

利用PCR方法从纳豆芽孢杆菌(Bacillus subtilis subsp.natto)基因组DNA中扩增纳豆激酶原基因,构建了纳豆激酶原基因的表达载体pFY002,转化Lactococcus lactis NZ9000,得到活性表达纳豆激酶的重组菌Lactococcus lactis NZ9000/pFY002。利用纤维蛋白平板法检测其溶栓活性,并对诱导剂乳链菌肽(NisinA)的浓度、温度、诱导时间对重组菌产酶的影响进行探究。     

重组抗冻肽在乳酸乳球菌中表达及其抗冻活性研究

为了优化抗冻蛋白SF-P的重组表达,利用乳酸链球菌素Nisin对已构建的重组乳酸乳球菌进行表达。通过对诱导时间、诱导pH、诱导温度和诱导剂Nisin浓度等诱导表达条件进行优化,利用SDS-PAGE和Western blot确定最佳的表达条件;通过比较冷冻胁迫前后菌体的生长状况、发酵活力和细胞内钠钾离子含量的变化,研究重组菌在冷冻胁迫作用下的生理功能特性。结果表明:优化后的最佳表达条件为pH 7.0,诱导剂Nisin浓度15ng/mL,温度25℃,诱导时间6h;SF-P2诱导重组菌株可以显著改善乳酸菌由于经受冷冻胁迫导致的对数生长延滞期和稳定生长延滞期的增加,表现出较强的酸化活力,并且可以有效降低冷冻胁迫过程对乳酸菌细胞膜通透性的影响,起到保护细胞生理功能的作用,表明SF-P2诱导重组菌具有显著的抗冷冻胁迫保护作用。     

Extracellular Expression of a Recombinant Ganoderma lucidium Immunomodulatory Protein by Food-Grade Lactococcus lactis System

Lactococcus lactis is a food-grade microorganism of major commercial importance in food industry. For commercial application of genetically modified L. lactis, a food-grade expression system is strongly recommended. In this study, two food-grade selection markers, nisin immunity gene nisI and nisin resistance gene nsr, were evaluated as dominant markers for the L. lactis food-grade expression system. By using an efficient P_SlpAl promoter fused to a signal peptide from subtilisin YaB (SP_YAB), a functional recombinant Ganoderma lucidium immunomodulatory protein rLZ8 was expressed extracellularly in L. lactis. Replacing the antibiotic marker gene into the proper food-grade selection marker nsr gene, the rLZ8 was expressed extracellularly in the food-grade L. lactis system. This study provides a rationale basis for a food-grade system to express functional peptides extracellularly as an important tool for oral administration of genetically modified L. lactis.     

小牛凝乳酶原基因在乳酸克鲁维酵母中的表达及遗传稳定性研究

目的:构建小牛凝乳酶原乳酸克鲁维酵母分泌型表达载体,表达重组凝乳酶原.方法:通过PCR获得小牛凝乳酶原cDNA片段,将目的基因插入酵母表达载体pKLAC1 α结合因子分泌信号下游,得到重组载体pKLAC1-prochymosin.SacII线性化后氯化锂转化乳酸克鲁维酵母GG799,用含5mmol/L乙酰胺的YCB固体培养基筛选转化酵母菌,PCR鉴定目的基因,利用特异性引物筛选多拷贝转化子.阳性转化子经摇瓶表达,取上清TCA沉淀后做Tricine SDS-PAGE分析并检测凝乳酶的活力,通过检测阳性转化子产凝乳酶的活力考察其遗传稳定性.结果:经测序及PCR证实,凝乳酶原cDNA准确插入酵母表达载体pKLAC1中,转化后重组载体通过同源重组整合进入酵母基因组中.Tricine SDS-PAGE分析证明凝乳酶的分子量约为36kD,酸处理后测得培养基中凝乳酶的酶活为83SU/ml,阳性转化子遗传稳定性好.结论:成功构建出酵母表达载体pKLAC1-prochymosin,在培养基中获得分泌的重组凝乳酶原,经过酸处理后凝乳酶原转化为有活性的凝乳酶.     

基于基因水平研究乳酸乳球菌的有氧呼吸代谢

本研究旨在对能和不能有氧呼吸代谢的乳酸乳球菌呼吸链基因同源性和细胞色素氧化酶活力进行分析,为确定乳酸乳球菌的有氧呼吸必要条件奠定基础。首先,分别测定已筛选到的菌株KLDS4.0325和KLDS4.1102在发酵和有氧呼吸代谢时的生长曲线;其次,提取KLDS4.1102的基因组DNA,随后利用PCR扩增其呼吸链编码基因并进行DNA测序;最后,从Gen Bank数据库下载KLDS4.0325的呼吸链编码基因序列,利用DNAMAN软件比较这两株菌呼吸链编码基因的同源性,并测定这两株菌的细胞色素氧化酶活性。结果表明在有氧呼吸条件下KLDS4.0325的生物量和p H都显著增大,而KLDS4.1102在两种条件下呈现一致的生长趋势,呼吸链编码基因的同源性分析显示KLDS4.1102具备完整的呼吸链,而酶活测定结果却显示KLDS4.1102无细胞色素氧化酶活性,这表明KLDS4.1102不能进行有氧呼吸代谢不是由于编码基因缺陷造成的,可能是某些编码基因不能正常表达,导致其细胞色素氧化酶不能正常发挥作用。     

Expression of milk-derived angiotensin I-converting enzyme-inhibitory peptides in Lactococcus lactis

Angiotensin I-converting enzyme (ACE) plays a key role in the regulation of blood pressure. Currently, most single or tandem repeats of ACE-inhibitory (ACE-I) peptides have been expressed in Escherichia coli. However, in this study, a food-grade system was constructed using Lactococcus lactis (L. lactis) to simultaneously express four different milk-derived ACE-I peptides with antihypertensive activity. Mixed peptides (MPs) fused with green fluorescent protein (GFP) and eight histidines were synthesized. To ensure potent ACE inhibition by the MPs in human digestive juice, pepsin and trypsin cleavage sites were introduced among the four ACE-I peptides. The MP fusion gene was inserted into expression vector pSEC-E7 with nisin induction and expressed in L. lactis NZ9000, then purified by affinity chromatography. The transformants containing pSEC-MP:GFP were identified based on green fluorescence using Leica laser scanning confocal microscopy. The target proteins were detected by SDS-PAGE analysis and displayed obvious immunogenicity by western blot. After hydrolysis with digestive enzymes, the IC₅₀ of the MPs was 118.63 μM. These results suggested that multiple milk-derived ACE-I peptides with antihypertensive properties could be produced using a food-grade lactococcal expression system.     

乳源血管紧张素转移酶抑制肽在乳酸乳球菌中的表达

在乳酸乳球菌中表达乳源血管紧张素转移酶抑制肽。选取了4种不同的来源于牛酪蛋白的血管紧张素转移酶(ACE)抑制肽,为了确保能够在人体消化液作用下正常发挥它们的ACE抑制活性,4种短肽以串联多肽(TP)的形式进行表达,并在各短肽单体间引入了人体内主要消化酶的酶切位点。根据TP的氨基酸序列和乳酸乳球菌的偏爱密码子,人工合成TP基因。然后将TP基因和绿色荧光蛋白(GFP)基因串联于载体pSEC-E7,从而构建了pSEC-TP:GFP质粒,实现了2种蛋白在乳酸乳球菌中的共表达。经电击转化,将该重组质粒转入乳酸乳球菌NZ9000中,获得重组菌株NZ9000(pSEC-TP:GFP)。用Nisin诱导TP:GFP蛋白表达。RT-PCR、激光共聚焦扫描显微镜和SDS-PAGE鉴定表达产物。RT-PCR结果表明,TP:GFP蛋白在RNA水平表达成功;SDS-PAGE表明目标产物是35 ku的条带。在乳酸乳球菌中实现了乳源血管紧张素转移酶抑制肽的表达。