橄榄果实氨基酸转运蛋白基因CaAAP1、CaAAP2和CaAAP4的克隆与表达分析

氨基酸通透酶(amino acid permease, AAP)参与植物氨基酸的转运、吸收、氮代谢等途径。为了解橄榄果实AAP基因在不同品种果实成熟发育过程的表达模式,本研究以呈味差异显著的两个品种普通橄榄‘长营’和清橄榄‘梅埔2号’为试验材料,通过RT-PCR方法克隆了3个APP基因的cDNA序列全长,并对其进行了生物学信息分析与亚细胞定位分析,同时利用实时荧光定量PCR技术分析了两个不同品种果实在不同发育时期的CaAAPs表达情况。结果表明：3个基因的序列长度分别为1 254 bp (CaAAP1)、405 bp (CaAAP2)、633 bp (CaAAP4),其编码的蛋白均为不稳定疏水性蛋白,分别含有7、1、5个跨膜区,保守基序差异较大;亚细胞定位结果表明,CaAAP1、CaAAP2主要在细胞质膜上表达。荧光定量结果表明随着果实的发育,CaAAP1、CaAAP2和CaAAP4在‘长营’果实的表达量均呈显著上升趋势,在‘梅埔2号’的表达量变化趋势较平缓,且在170 d时显著下降,两个品种CaAAPs家族基因表达量差异大,表明CaAAP1、CaAAP2、CaAAP4基因可能对橄榄果...     

菊花CgF3’H基因克隆及表达特性分析

根据菊花花器官表达序列标签序列设计引物,采用PCR和5’-RACE技术对类黄酮3'-羟化酶(F3’H)基因进行全长cDNA克隆.克隆获得F3'H cDNA全长为1 760 bp,其开放阅读框(ORF)为1 524 bp,编码一条包含508个氨基酸残基的多肽,GenBank登录号为AB523844.预测该基因编码的蛋白分...     

桂花OfF3'H基因的克隆与表达分析

类黄酮3'-羟化酶(F3'H)属于细胞色素P450单加氧酶家族,是苯丙烷类代谢途径关键成员,在植物色泽形成及类黄酮成分调控方面起重要作用。本研究以四季桂‘金玉台阁’为实验材料,采用cDNA末端快速扩增法(RACE)从盛花末期小花cDNA中克隆了桂花OfF3'H基因(GenBank编号:MH509392)。序列分析结果显示该基因全长为1 856 bp,其中5'端非翻译区长度为102 bp,3'端非翻译区长度为191 bp,开放阅读框长度为1 563 bp,编码由520个氨基酸残基组成的蛋白质。系统进化分析表明Of F3'H含有植物F3'H蛋白典型的保守结构域,且与猕猴桃的AcF3'H蛋白亲缘关系最近。桂花花期不同阶段生理与分子研究发现初花期OfF3'H基因表达量和总黄酮含量均为最低,而花谢期OfF3'H基因表达量和总黄酮含量达到最高。此外,Of F3'H存在10个潜在的磷酸化位点,其中第83位点的丝氨酸和第304位点的苏氨酸在不同植物间高度保守。本研究为深入研究桂花花色形成及植物类黄酮合成调控的分子机制提供一定的理论依据。     

瓜叶菊F3''5''H基因cDNA的克隆、序列分析及其原核表达

蓝色花的形成主要由于是花瓣中3',5'-羟羟基花青素(飞燕草色素及其衍生物)的相对含量较高,类黄酮-3',5'-羟基化酶(F3'5H)是合成这类色素的关键酶.不同物种F3'5'H同源基因的分离与特征解析能够为蓝色花的分子育种工作提供更多的理论依据.瓜叶菊花色多变,舌状花有白色、红色和蓝紫色等.根据已知F3'5'H保守的氨基酸序列设计了3条简并引物,通过RT-PCR从蓝色的瓜叶菊舌状花中扩增出了保守序列;利用RACE方法得到了两端序列.设计全长引物RT-PCR分离出了瓜叶菊F3'5'H同源基因(PCFH).cDNA全长1 660bp,编码505个氨基酸.序列分析表明PCFH编码的氨基酸序列中包含有已确定的保守基序,包括血红素结合区、Ⅰ螺旋区和膜插入点的信号序列等.与其它物种的F3'5'H基因的序列相似性也较高.与翠菊、拟南芥和矮牵牛的序列相似系数分别为76%、59%和50%.序列相似性表明PCFH基因与茄子、矮牵牛和草原龙胆等同属于CYP75亚家族.利用pET28a载体PCFH在大肠杆菌BL21中实现了表达,IPTG诱导的差异蛋白大约为57kD,PCFH编码的多肽分子量相近,这将为进一步研究PCFH的酶学特性奠定了基础.     

绿色棉纤维类黄酮3',5'羟基化酶基因GhF3'5'H的克隆及实时定量表达分析

以发育18 d的天然绿色棉及其近等基因系白色棉纤维细胞为材料,利用cDNA-AFLP结合cDNA末端快速扩增技术,克隆了1个绿色棉纤维优势表达基因的全长cDNA。序列分析结果表明,该cDNA全长1873bp,含有一个编码509个氨基酸残基的开放阅读框。Blast分析表明,该基因的编码产物为一个类黄酮3',5'羟基化酶,将该基因命名为GhF3'5'H,序列提交到GenBank,登录号为GU062184。实时荧光定量PCR检测结果显示:GhF3'5'H在绿色棉不同组织中的表达量均显著高于其近等基因系白色棉,而且主要在纤维细胞中表达。在纤维发育过程中,GhF3'5'H在纤维发育的早期表达量最高,并随纤维发育逐渐降低。推测该基因可能在绿色棉纤维色素前体物质的形成中发挥作用。     

中国桔梗PgF3'5'H及其突变型基因在毕赤酵母中的表达差异分析

F3'5'H是催化合成蓝色花色素的关键酶,F3'5'H蛋白序列中一段编码9个氨基酸的特殊序列区段可能与F3'5'H催化合成的蓝色花色素有关,但该特殊序列区段的催化功能和作用机制尚不清楚。为了探究PgF3'5'H中,该特殊序列结构的催化功能及作用机制,本研究通过重叠延伸PCR技术去除PgF3'5'H编码的9个氨基酸特殊序列区段,获得缺失突变型基因;将PgF3'5'H野生型及其突变型基因同时导入毕赤酵母;通过qRT-PCR检测野生基因及其突变基因在酵母中转录水平基因表达量的差异;通过SDS-PAGE检测PgF3'5'H野生型基因及其突变型基因在酵母中的合成蛋白量的差异。qRT-PCR分析结果显示PgF3'5'H野生型基因较其突变型在酵母中呈现更高的表达量;SDS-PAGE电泳结果显示重组子分泌生成了分子量大小约为52.0 k D的目标蛋白,且野生型蛋白量相比其突变型蛋白量高。因此,推测Pg F3'5'H蛋白序列中9个氨基酸的特殊序列与调控该基因在RNA和蛋白水平的表达量有关,进而可能影响该基因的催化功能。研究结果将为观赏植物蓝色花色形成分子机制及蓝色花色分子育种提供一定研究基础。     

擎天凤梨花色素合成关键基因CHS、F3'H和DFR的克隆及表达分析

擎天凤梨‘Ostsra’是一种观赏红色苞片为主的高档盆栽花卉。一般认为植物苞片的呈色物质除叶绿素外多来源于花色素,而CHS、F3'H和DFR是在花色素的合成过程中的关键酶。本研究采用采用简并引物及同源克隆法获得了881 bp的CHS基因,编码276个氨基酸的序列,GenBank登录号为KX364270;采用cDNA全长文库构建、EST批量测序及目标单克隆序列测通法,获得了F3'H和DFR基因。F3'H基因长1 176 bp,可编码325个氨基酸序列,GenBank登录号为KX364271;DFR基因长1 209 bp,可编码167个氨基酸的序列,GenBank登录号为KX364272。采用实时定量PCR法检测CHS、F3'H和DFR在‘Ostsra’苞片呈色过程中的表达变化,结果表明,3个基因在苞片变色过程中(绿苞-半红苞-全红苞)都呈现出递增的趋势,即随着苞片颜色的变深,3基因的表达量逐渐增加,全红状态时,表达量最高,而作为对照的绿叶,表达水平都是最低的。     

油用牡丹PsFAD6基因的克隆与表达分析

本研究以油用牡丹(Paeonia suffruticosa)叶片为试验材料,采用RACE和RT-PCR的方法克隆得到油用牡丹ω-6脂肪酸脱氢酶(ω-6 FAD)基因cDNA全长,命名为PsFAD6(GenBank登录号:KY233120)。序列分析表明,该基因cDNA序列全长1 819 bp,其中开放阅读框1 326 bp,编码441个氨基酸,3'端非编码区长271 bp,5'末端非编码区长192 bp;多序列比对表明,油用牡丹PsFAD6氨基酸序列含有3个保守结构域,系统发育分析显示油用牡丹与葡萄处于同一分支,其亲缘关系最近。TMHMM和TargetP亚细胞定位分析得知,PsFAD6蛋白无信号肽,具有3个跨膜域,可能定位于叶绿体中发挥功能。组织特异性分析表明,PsFAD6在油用牡丹的根、茎、叶、花瓣、雌蕊、雄蕊、种子中均有表达,其中,在叶片中表达量最高,雄蕊次之,在雌蕊中表达量最低;不同发育时期种子中,80 d表达量最高,60 d次之,在20 d中表达量最低     

草莓PIF3基因的克隆及表达分析

光敏色素互作因子(phytochrome-interacting factors, PIFs)是一类bHLH转录因子。为探究其基因功能,本研究根据预测的栽培草莓(Fragaria×ananassa) PIF3序列设计引物,从‘红颜’(cv.Benihoppe)草莓中克隆得到FaPIF3的编码区及启动子区序列,其开放阅读框(ORF)长度为2 121 bp,编码706个氨基酸残基。生物信息学预测表明,FaPIF3具有HLH家族保守结构域,而无跨膜结构域和信号肽;系统进化树显示,该蛋白与蔷薇科植物具有很近的亲缘关系。通过获得的2 652 bp的启动子区序列进行启动子元件预测,发现FaPIF3具有大量的光响应元件。半定量PCR显示,FaPIF3在草莓果实成熟期间表达量稳定,在花和嫩叶中表达量较高。亚细胞定位结果证实,Fa PIF3位于细胞核内。     

百子莲开花相关基因ApVIN3的克隆及表达分析

研究以百子莲(Agapanthus praecox ssp. orientalis)茎尖组织为材料,利用RACE (cDNA末端快速扩增)方法,获得百子莲VIN3基因c DNA全长序列,命名为ApVIN3,GenBank登录号为KJ472789。序列分析表明,百子莲ApVIN3基因cDNA全长1 943 bp,其中开放阅读框为1 680 bp,编码559个氨基酸,5’非编码区(5’UTR)和3’非编码区(3’UTR)分别为88和175 bp。ApVIN3编码一个具有C4HC3 (cys4-His-cys3)保守序列结构的PHD-finger蛋白,与二穗短柄草(XP＿003573553.1) VIN3蛋白有很高的相似性。实时荧光定量分析表明,ApVIN3在百子莲茎尖中的表达量受温度调控的影响,其表达量随着低温时间的延长逐渐上升。ApVIN3可能在百子莲成花诱导过程中发挥着重要的作用。     

苹果MdPDS基因的克隆及表达分析

八氢番茄红素脱氢酶(PDS)是苹果类胡萝卜素生物合成途径的关键酶。本研究运用电子克隆与RACE技术克隆得到‘澳洲青苹’苹果Md PDS基因(Gen Bank登录号:KU508828),该c DNA序列全长2 005 bp,包含1 725个碱基(121~1 845 bp)的完整开放阅读框,编码575个氨基酸。氨基酸同源性分析表明,Md PDS编码的氨基酸序列与其他植物的PDS蛋白具有很高的同源性;其同样含有一个二核苷酸结合域和一个类胡萝卜素结合域。系统进化树分析表明,Md PDS与杏、碧桃和草莓蛋白亲缘关系较近,聚为一类。实时荧光定量PCR结果表明,Md PDS在‘澳洲青苹’苹果不同组织均有表达,其在树皮、果皮及叶片中的表达要明显高于花中的表达。此外,Md PDS在着色期套袋果实果皮中的表达量随果色增加而上升,而在非套袋果皮中的表达则变化不明显。上述结果表明Md PDS在苹果果实色泽发育过程中起着重要作用,也为进一步研究其生物学功能奠定了基础。     

大叶蛇葡萄类黄酮-3'-羟化酶基因(F3'H)的克隆及生物信息学分析

类黄酮-3'-羟化酶(F3'H)是黄酮化合物生物合成过程中的关键酶之一,本研究从大叶蛇葡萄转录组数据库中筛选出类黄酮-3'-羟化酶基因(F3'H),利用RT-PCR等技术克隆了其全长序列,并分析F3'H基因编码蛋白的理化性质和结构特征。结果表明,该序列全长为1 718 bp,开放阅读框(ORF)长度为1 530 bp,相对分子质量为55.89 kD,编码509个氨基酸,等电点为7.3,分子式为C_2(513)H_(3974)N_(696)O_(70)5S_(21),不稳定指数为38.26,为稳定蛋白;脂肪族指数为96.42,总平均疏水性为-0.004,为亲水性蛋白;具有多个磷酸化位点,有信号肽,存在一个跨膜区,亚细胞定位于内质网膜,二级结构以α-螺旋为主。系统进化分析和多重序列比对表明该序列与藤茶的亲缘关系最近。密码子偏性分析表明该基因以G/C结尾的密码子使用频率较高,最适合该基因的异源表达宿主是大肠杆菌。本研究结果为进一步研究大叶蛇葡萄F3'H蛋白功能,以及揭示该植物中具生物活性的黄酮类成分的生物合成机制提供了一定的基础。     

火把梨14-3-3基因的克隆与序列分析

依据火把梨(Pyrus pyrifolia Nakai)14-3-3蛋白的EST序列设计基因特异引物,采用快速扩增cDNA末端技术(Rapid amplification of cDNA ends,RACE),从云南火把梨中克隆一个新的14-3-3基因(Pp14-3-3)的全长cDNA序列。Pp14-3-3全长cDNA为1 107 bp,具有84 bp 5’非编码区(Untranslated Regions,UTR)、786 bp开放读码框(Openreading frame,ORF),以及237 bp 3’UTR,编码含261个氨基酸的蛋白质。Pp14-3-3与其他物种14-3-3蛋白在中间功能区域高度保守,包含典型的14-3-3结构域。与已知植物14-3-3s家族成员间的氨基酸序列进行聚类分析,将Pp14-3-3聚为非ε大类14-3-3。Pp14-3-3在火把梨接受光照和没有光照的果皮以及幼嫩叶片中大量表达,且表达量稳定。对Pp14-3-3的基因克隆以及表达特性进行了分析,为后期深入研究该新基因的功能奠定了基础。     

番木瓜成熟衰老蛋白基因CpSSA的克隆与表达分析

衰老相关蛋白(senescence-associated protein,SSA)基因在果实成熟衰老中起重要作用。为了探究番木瓜衰老相关蛋白基因,以‘大白八号’番木瓜果实为材料,采用RACE技术扩增出番木瓜SSA基因全长cDNA序列,命名为CpSSA(登录号:KX885408)。生物信息学分析显示,CpSSA全长1 203 bp,包含一个420 bp的开放性阅读框。番木瓜SSA蛋白含有139个氨基酸,分子质量为15.172 4 kD,等电点为9.61。该蛋白的氨基酸序列与桃、葡萄、杨树、菠菜的氨基酸序列有较高的同源性。系统进化树显示,番木瓜SSA与葡萄SSA表现出最小的进化距离,亲缘关系最接近。用荧光定量PCR分析在不同处理不同成熟度番木瓜果实中CpSSA基因的表达差异,结果显示在乙烯处理后的6 h和12 h表达量显著升高,在1-MCP处理中表达量较低,在乙烯/1-MCP处理果实中的表达模式与成熟衰老有一定相关性,推测CpSSA基因可能参与了番木瓜果实的成熟衰老进程。     

甘蔗类甜蛋白基因ScTLP2和ScTLP3的生物信息学分析及表达

类甜蛋白(thaumatin-like proteins,TLPs)是一类与作物抵抗真菌病害紧密相关的病程相关蛋白。本研究从课题组前期构建的甘蔗(Saccharum spp.)转录组数据库中筛选获得两个甘蔗类甜蛋白基因(ScTLP2和ScTLP3),利用生物学软件对ScTLP2和ScTLP3基因进行序列特征、结构功能及聚类分析,采用qRT-PCR技术,检测ScTLP2和ScTLP3基因在不同甘蔗组织和黑穗病菌(Sporisorium scitamineum)胁迫下的表达情况。生物信息学分析显示,ScTLP2基因全长1835 bp,包含1个969 bp的完整开放读码框,编码322个氨基酸;ScTLP3基因全长1259 bp,包含1个765 bp的完整开放读码框,编码254个氨基酸。ScTLP2和ScTLP3编码蛋白均含有THN家族的保守结构域和糖苷水解酶家族的64结构域(GH64-TLP-SF),两者分别隶属于TLPs家族中的Ⅵ类和Ⅰ类。q RT-PCR结果表明,ScTLP2和ScTLP3基因在甘蔗中均为组成型表达,其中ScTLP2基因在蔗叶中的表达量最高,是蔗皮的11.2倍,而ScTLP3基因在蔗芽中的表达量最高,是蔗皮的45.3倍。受黑穗病菌侵染后,ScTLP2基因在甘蔗抗黑穗病品种‘崖城05-179’中上调表达,而在感黑穗病品种‘ROC22’中无明显变化;相反的,Sc TLP3基因表达量在‘崖城05-179’中无明显变化,在‘ROC22’中上调表达。以上结果为深入研究甘蔗ScTLP家族基因的结构和功能积累了基础资料。     

金花茶黄烷酮3-羟化酶基因CnF3H的克隆及表达分析

本研究利用反转录PCR和RACE方法,从中国珍稀濒危植物金花茶(Camellia nitidissima)花瓣中获得了黄烷酮3-羟化酶(flavanone 3-hydroxylase,F3H)基因的c DNA全长,命名为Cn F3H,Gen Bank登录号为HQ290517。碱基序列分析表明,该Cn F3H基因c DNA序列全长为1 360 bp,5'非翻译区(untranslated regions,UTR)长54 bp,3'UTR长202 bp,开放阅读框长为1 104 bp编码367个氨基酸。氨基酸序列比对分析表明,Cn F3H与茶(C.sinensis)F3H同源性高达99%。二级结构预测表明,无规则卷曲在Cn F3H蛋白结构中所占比例最大,其次为α-螺旋和延伸链。相对荧光定量PCR分析表明,Cn F3H基因的表达量在幼蕾期、初蕾期和膨大期的表达量较高,之后逐渐降低;Cn F3H基因在花器官不同部位中均有表达,其表达量高低顺序为雄蕊、花瓣、萼片、雌蕊和苞片。本研究为全面深入地研究金花茶花色形成的分子调控机理提供了充实的理论依据。     

沙棘3-磷酸甘油脱氢酶基因生物信息学及表达分析

沙棘果肉和种子组织中均富含生物活性油。3-磷酸甘油脱氢酶(GPD1)是促进油脂合成前体甘油-3-磷酸(G3P)合成的限速酶。本研究对沙棘HrGPD1基因进行生物信息学分析(氨基酸序列,保守域,亚细胞定位等),及其在沙棘不同组织(果肉和种子)中的表达情况。研究发现:HrGPD1开放阅读框为1 143 bp,编码380个氨基酸,无信号肽和跨膜结构域,存在多个磷酸化位点,定位于质体中,蛋白高级结构以α-螺旋为主,该蛋白序列与桑、梅、烟草和拟南芥的GPD表现出较高的序列相似性。qRT-PCR分析发现,HrGPD1基因在沙棘品系‘新俄3号’成熟种子和果肉中的相对表达量分别为0.52和1.35,与二者的含油率高低规律相一致。这为进一步研究HrGPD1基因在沙棘生物活性油合成过程中的作用机理提供科学依据。     

飞机草类黄酮3’-羟化酶基因(CoF3’H)的克隆及其在烟草中的表达

利用RT-PCR和RACE技术从飞机草中克隆得到1628 bp的类黄酮3’-羟化酶c DNA的全长序列,命名为Co F3’H,Gen Bank登录号为HQ268505.1。Co F3’H基因的编码区长度为1524 bp,编码507个氨基酸。氨基酸序列含P450蛋白结构域和半胱氨酸亚铁血红素结合域保守区(F××G×R×C×G),利用DNAMAN软件比对显示,Co F3’H与其他植物的F3’H蛋白的同源性很高。通过农杆菌介导成功地将Co F3’H基因导入烟草,T2代的转Co F3’H基因烟草植株的黄酮含量显著高于野生型。说明Co F3’H在黄酮的生物合成中起重要作用,为后续研究飞机草的化感作用及综合利用提供基础。     

芒果FLC同源基因的克隆和表达分析

开花抑制基因FLC (FLOWERING LOCUS C)是春化作用中的关键基因,为探索MADS-box转录因子在芒果花器官发育中的作用,本研究利用RT-PCR克隆得到芒果MADS-box转录因子MiFLC的cDNA全长,序列分析显示该基因具有MADS_MEF2_like和K-box结构域,属于MADS-box基因家族,MiFLC基因编码区长576 bp,编码191个氨基酸,蛋白质相对分子质量22.08 kD,等电点为9.18。MiFLC的生物信息学分析表明该蛋白序列的二级结构主要由α螺旋、无规则转曲及延伸链构成,属于亲水性氨基酸。序列分析和系统进化树分析显示,MiFLC基因编码的蛋白与橙子、枳、龙眼、克莱门柚的蛋白序列同源性高,亲缘关系较近。组织特异性表达分析表明,MiFLC基因在芒果不同品种和每个品种的不同组织部位均有表达,在‘桂七’、‘金煌’、‘凯特’3个品种的表达量呈现出一致性,在营养器官中表达量最高,在花器官中表达量较低,表达量顺序依次是叶茎果花。     

灵芝金属硫蛋白基因的克隆及序列分析

采用RT-PCR和3′-RACE相结合的方法获得了灵芝（Ganoderma lucidum）金属硫蛋白的cDNA序列。该序列全长为315bp,5′-端非翻译区为47bp,3’端非翻译区具有166bp,开放阅读框长度为102bp（包括一个终止密码子）,可编码33个氨基酸。在其编码的氨基酸序列中半胱氨酸（Cys）含量最高,占21.2%,其次是丝氨基酸Ser(S)和丙氨基酸Ala(A),均占12.1%。对其编码的氨基酸序列进行分析发现该序列具有金属硫蛋白的保守序列模式,是金属硫蛋白家族的成员。