脂质体介导hHCN2基因转染HEK293细胞的效率研究

目的:脂质体介导重组起搏基因pIRES2-EGFP-HCN2转染HEK293细胞,观察转染效率,探讨其构建生物起搏器的可行性。方法:对含hHCN2cDNA的PTR载体进行转化和扩增,将所得hHCN2基因定向克隆到真核表达载体pIRES2-EGFP中,双酶切来鉴定克隆的正确性。将重组质粒用脂质体转染HEK293,荧光显微镜观察EGFP的表达并计算转染效率。结果:构建了重组质粒pIRES2-EGFP-HCN2。荧光显微镜下可见转染后的HEK293呈绿色荧光,其转染效率可达90%以上。结论:成功构建了重组质粒pIRES2-EGFP-HCN2,并用脂质体转染的方法导入HEK293细胞,为生物起搏的研究奠定实验基础。     

HEK293细胞上表达的人类超极化激活环核苷酸门控钾通道亚型2和亚型4的电生理

目的将人类超极化激活环核苷酸门控钾通道亚型2（hHCN2）和亚型4（hHCN4）的基因表达于HEK293细胞系上,观察其表达的通道的电生理特点。方法包含目的基因hHCN2或hHCN4的cNDA亚克隆到腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV,穿梭载体和病毒骨架载体pAdEasy-1在大肠杆菌重组,病毒经过包装和扩增后分别转染HEK293细胞。利用全细胞膜片钳技术,记录分别转染了hHCN2和hHCN4的HEK293细胞上的超极化激活钾电流（If）。结果转染hHCN2和hHCN4的HEK293细胞上产生超极化激活的内向电流。两种通道的半数最大激活电压分别为-114．8mV±3．3mV和-125．9mV±2．9mV,反向曲线斜率分别为11．1mV±1．2mV和13．7mV±1．3mV。两者的激活动力学明显不同,刺激电压为一110mV时,通道的激活时间常数分别为0．99s±0．21s和8．47s±2．85s。两种通道对钠离子和钾离子的相对通透性分别为0．40和0．34。两种电流均可被2mmol／L的氯化铯（CsCI）阻断。结论目的基因hHCN2和hHCN4在HEK293细胞上成功表达,形成的两种通道具有明显不同的激活动力学。     

小鼠Gtf2h2基因的克隆及其在真核细胞中的表达

目的:克隆小鼠Gtf2h2基因并使其在真核细胞HEK293中稳定表达?方法:采用小鼠卵母细胞cDNA为模板,经PCR扩增Gtf2h2后,利用新型In-Fusion分子克隆体系将该目的片段克隆至真核表达载体pCMV6-AC-3DDK和pCMV6-AN-mKate中?所得阳性克隆的质粒DNA在经限制性酶切电泳和测序鉴定克隆成功后,转染到HEK293细胞中进行表达?表达效果利用抗DDK和mKate标签的抗体通过免疫荧光以Western blot 的方法进行检测?结果:质粒DNA测序和酶切鉴定证明Gtf2h2基因克隆成功;Western blot 检测到GTF2H2-3DDK和GTF2H2-mKate融合蛋白在转染后的HEK293细胞内的表达;免疫荧光显示融合蛋白在转染后的HEK293细胞核内定位并呈颗粒状分布?结论:成功克隆了小鼠Gtf2h2基因并实现了其在真核细胞HEK293中的稳定表达,为进一步研究其功能和作用机制奠定了基础?     

PSNAV2-CTGF重组质粒构建及其在人胚肾293细胞中的表达

目的 构建含人结缔组织生长因子（CTGF）的腺相关病毒（AAV）表达载体,并观察其在人胚肾293（HEK293）细胞中的表达。方法 以含有人CTGF基因序列的质粒pCMV-SPORT6为模板,应用PCR克隆出CTGF基因,采用分子克隆的方法把CTGF克隆到AAV表达载体pSNAV2.0上构建重组质粒pSNAV2-CTGF。把重组质粒转染HEK293细胞,用免疫荧光法对重组质粒目的蛋白的表达进行研究,MTT法检测细胞培养上清液中CTGF蛋白的生物学活性。结果 成功构建完全正确的CTGF基因序列的AAV表达载体pSNAV2-CTGF,将其转染HEK293细胞后,免疫荧光检测到目的蛋白的表达,转染后的细胞上清具有促使成纤维细胞增殖的生物学活性。结论 成功构建了真核表达载体pSNAV2-CTGF,转染HEK293细胞后能够表达具有生物学活性的CTGF蛋白。     

成纤维细胞生长因子受体FGFR1真核表达质粒的构建及其在HEK293T细胞的表达

目的建立一个有效表达FGFR1的真核系统。方法从人胎盘组织提取总RNA,通过RT-PCR扩增得到FGFR1基因,并将其克隆到真核表达载体pcDNA3.1上,构建成pcDNA3.1-FGFR1质粒表达载体,并在HEK293T细胞重组表达;将pcDNA3.1-FGFR1质粒转染HEK293T细胞,通过免疫印迹和免疫荧光检测FGFR1在细胞中的表达情况。结果扩增的FGFR1序列与数据库一致;通过构建表达载体和转染细胞实现了FGFR1c DNA在HEK293T细胞膜上的表达。结论成功扩增出FGFR1 c DNA基因,经过转染HEK293T细胞,实现了FGFR1在HEK293T细胞的高效表达。     

人脂联素受体1和2的真核表达

目的 扩增和表达人脂联素受体1（AdipoR1）和人脂联素受体2（AdipoR2）基因。方法 利用RT-PCR方法扩增AdipoR1和AdipoR2全长cDNA。将AdipoR1和AdipoR2的cDNA构建到真核表达载体pcDNA3．1。重组质粒转染HEK293细胞。通过免疫荧光技术标记HEK293细胞的AdipoR1和AdipoR2融合蛋白，共聚焦显微镜观察AdipoR1和AdipoR2在细胞中的定位。结果 成功构建真核表达重组质粒pcDNA3．1-adipoR1和pcDNA3．1-adipoR2．重组质粒转染HEK293细胞后。定位于HEK293细胞膜上。结论 AdipoR1和AdipoR2重组质粒的构建和在HEK293细胞中的成功表达。为进一步研究其与胰岛素抵抗的关系创造了条件。     

NF2基因突变体真核表达载体的构建和表达

目的构建NF2突变体真核表达载体,并观察其在人胚肾细胞HEK293中的表达。方法采用分子生物学方法构建NF2突变体,将突变体克隆入真核表达载体pEGFP—N1中,进行筛选和鉴定,然后在脂质体介导下,将重组载体转染至真核细胞HEK293中,应用Western blot法检测蛋白的表达。结果通过使用重叠延伸PCR法定位突变,从野生型NF2基因cDNA模板中扩增得到预期大小的NF2突变体条带,DNA测序证实NF2突变体序列的正确性。重组载体转染HEK293后能产生merlin蛋白。结论本研究成功构建重组载体pEGFP—N1-NF2突变体,其转染HEK293后,能有效表达于HEK293中。     

乙酰胆碱受体四聚体前体α亚单位在人胚肾293细胞膜上的表达

[目的]将乙酰胆碱受体四聚体前体!亚单位重组质粒(pcDNA3.1-AchRα-BirA)转染至人胚肾293(HEK293)细胞,并在其细胞膜上获得稳定表达.[方法]提取重组质粒pcDNA3.1-AchRα-BirA,经限制性核酸内切酶Eco RⅤ单酶切后,行低熔点琼脂糖凝胶电泳检测.采用脂质体转染法,将pcDNA3.1-AchRα-BirA转染至HEK293细胞,经抗生素G418筛选后形成集落状抗性克隆细胞.将表达产物扩大培养,应用免疫荧光技术,以异硫氰酸荧光素标记,经荧光显微镜查看表达情况.[结果]电泳检查发现了大小约为6.964 kb的条带.转染后G418筛选获得抗性克隆细胞,经荧光显微镜观察到HEK293细胞膜上的绿色荧光.[结论]成功地将AchRα-BirA基因转染至HEK293细胞膜上且有表达,为下一步构建AchRα四聚体奠定了基础.     

先天性长QT综合征KCNE1基因的克隆及其真核表达载体的构建

目的：克隆先天性长QT综合征KCNE1基因，并构建真核表达载体。方法：从人胎盘组织中提取总RNA，经逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）扩增出KCNE1基因；采用T-A克隆法，将KCNE1基因克隆入pCR2．1 TOPO载体中，经限制性酶切基因重组后，构建真核表达载体pEGFP-N1-KCNE1，经DNA测序鉴定，用Effectene转染试剂介导转染HEK293细胞。结果：采用基因克隆和重组法，得到了KCNE1真核表达载体pEGFP-N1-KCNE1，并在HEK293细胞中得到了表达。结论：KCNE1基因的克隆及其真核表达载体的构建和表达为进一步的功能研究奠定了基础。     

胃肠动力药西沙比利对表达于 HEK293细胞的人 ether-a-go-go相关基因2通道的影响

目的：研究胃肠动力药西沙比利对于在 HEK293细胞异源性表达的人 ether-a-go-go 相关基因2（human ether-a-go-go related gene 2,hERG2）通道性质的影响。方法用 Lipofectamine 2000将 hERG2（AF311913）瞬时转染至 HEK293细胞,使其表达hERG2通道,利用全细胞膜片钳技术记录 hERG2电流。加入西沙比利（终浓度分别为0.001,0.01,0.1,1.0,10.0μmol/ L）,分别记录加药前和加药后2~8 min 的 hERG2电流,分析西沙比利浓度和作用时间对此通道电流的影响。结果西沙比利各浓度实验组中,hERG2时间依赖性电流和尾电流幅度均下降。在去极化电压为＋20 mV 时,随西沙比利浓度升高,电流抑制率逐渐增加。西沙比利的抑制作用随时间延长逐渐增强,西沙比利浓度为1μmol/ L 时,电流在8 min 内完全消失。结论西沙比利对HEK293细胞表达的 hERG2通道的时间依赖性电流和尾电流均有抑制作用,该抑制作用具有浓度依赖性和时间依赖性,即浓度越高,时间越长,抑制效果越明显,直至电流降低至稳态或消失。     

HEK293细胞内源性电压门控钾离子通道电生理学特性研究

目的探讨人胚胎肾细胞(HEK293细胞)内源性电压门控钾通道的电生理特性,避免HEK293细胞上内源性离子通道对外源性离子通道表达时的干扰。方法利用全细胞膜片钳技术分析了HEK293细胞内源性电压门控钾通道的电生理特性。结果在HEK293细胞上去极化电压从-80 mV开始可触发1个外向电流。在+100 mV时电流为(422.78±68.87)pA,电流密度为(21.91±3.20)pA/pF。钾通道阻断剂四乙胺(tetraethylammonium,TEA)、4-氨基吡啶(4-aminopyri-dine,4-AP),在将细胞外液钾浓度由4 mmol/L提高到40 mmol/L时,对外向电流有影响。结论正常培养的HEK293细胞本身有内源性的钾通道。该外向电流可能包括了IK、IK1、IKur和Ito。     

人PD-L1真核表达载体的构建及其在HEK293细胞系中的稳定转染

目的构建含有人PD-L1基因的真核表达载体,并通过稳定转染获得稳定表达PD-L1分子的HEK293细胞系。方法从人心脏cDNA文库中扩增出PD-L1基因,通过双酶切（Xho1和EcoR1）装入真核表达载体pIRES2-EGFP中,脂质体法转染HEK293细胞,通过G418筛选,建立稳定高表达PD-L1分子的HEK293细胞系,通过流式细胞术、RT-PCR及Westernblot分析PD-L1的表达。结果构建了真核表达载体pIRES2-EGFP/PD-L1,建立了稳定转染PD-L1目的基因的HEK293细胞系。结论成功构建了PD-L1真核表达载体并获得了稳定转染该分子的HEK293细胞系。     

Ebp1-绿色荧光蛋白融合基因的构建及在HEK293T细胞中的表达

[目的]构建绿色荧光蛋白融合表达Ebp 1基因载体,并检测其在HEK 293 T细胞中的表达.[方法]采用PCR扩增Ebp 1基因,利用其片断和质粒pEGFPC 1的EcoRⅠ及XhoⅠ限制性酶切位点构建融合表达载体pEGFPC 1-Ebp 1,通过脂质体介导将其转染到HEK 293 T细胞中,在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白融合基因的表达情况.[结果]成功地构建融合表达载体pEGFPC 1-Ebp 1,将其转染到HEK 293 T细胞后可观察到其中有EGFP表达.     

人趋化因子受体CCR6的克隆、表达及其功能分析

目的构建人趋化因子受体6（CCR6）cDNA序列的真核表达载体．并在HEK293细胞中表达．为研究CCR6生物学功能和筛选CCR6拮抗剂奠定基础。方法采用RT-PCR方法从人扁桃体克隆CCR6受体的DNA片段．并将该片段插入真核表达质粒pcDNA3．1（＋）中,构建重组真核表达质粒pcDNA3、1（＋）-CCR6;将该质粒pcDNA3、1（＋）-CCR6转染HEK293细胞．用流式细胞术检测转染pcDNA3．1（＋）-CCR6质粒的HEK293细胞;采用体外趋化实验、钙流实验,验证转染pcDNA3.1（-）．CCR6质粒的HEK293细胞表面表达的CCR6的生物学活性。结果经RT-PCR获得了编码人CCR6受体的DNA片段．构建了重组真核表达质粒pcDNA3．1（＋）-CCR6：转染HEK293细胞．经流式细胞仪检测、趋化实验、钙流实验证实．表达CCR6的HEK293细胞具有趋化因子受体CCR6的生物学活性。结论重组人趋化因子受体CCR6克隆成功．并在HEK293细胞中获得了表达．为研究CCR6的生物学功能及筛选CCR6拮抗剂奠定了基础。     

遗传性长QT综合征HERG基因真核表达载体的构建和在HEK293细胞中的表达

目的构建HERG基因的真核表达载体，并在人胚胎肾细胞（HEK293）中进行表达。方法先将pGH19-HERG通过限制性酶SacⅠ和EcoR Ⅰ酶切得到HERG cDNA，将pIRES2-EGFP用SacⅠ和EcoRⅠ进行双酶切，把HERGcDNA定向克隆到pIRES2-EGFP中，即构建了HERG基因的真核表达载体pIRES2-EGFP—HERG。然后利用电穿孔法将pIRES2-EGFP-HERG转染HEK293细胞。结果在卵母细胞异源表达载体pGH19-HERG基础上，获得了真核表达载体pIRES2-EGFP—HERG，并在HEK293细胞中成功进行了表达。结论在HERG基因卵母细胞异源表达载体的基础上，构建了HERG基因的真核表达载体piRES2-EGFP-HERG，利用电穿孔法将其转染至HEK293细胞中并成功地进行了表达，为下一步进行膜片钳的研究奠定基础。     

G418抗性HEK293细胞的培育

目的　培育具有G418抗性的HEK2 93细胞 ,用于建立猪内源性反转录病毒感染人HEK2 93细胞的模型。方法　通过脂质体转染的方法 ,将含有neo基因的质粒pIRESneo导入HEK2 93细胞中 ,利用G418的选择特性 ,对转染细胞进行压力筛选 ,并对其进行了PCR鉴定。结果　经 6 0 0 μg ml的G418压力筛选后 ,获得了抗性细胞克隆。抗性细胞的形态和生长速度与筛选前细胞没有差异 ,特异性核苷酸引物检测抗性细胞基因组DNA ,可以扩增出对应的核苷酸片段。结论　成功地培育了G418抗性HEK2 93细胞 ,为建立猪内源性反转录病毒感染人HEK2 93细胞的模型奠定了基础。     

人基质金属蛋白酶组织抑制剂1腺相关病毒表达质粒的构建及检测

目的构建含人基质金属蛋白酶组织抑制剂1（tissue inhibitor of metalloproteinases1，TIMPl）的腺相关病毒（adenoassociatedvirus，AAV）表达质粒并观察其在人胚肾293（HEK293）细胞中的表达，为进一步逆转椎间盘退变提供依据。方法以含有人TIMP1基因序列的质粒pBLAST49-hTIMP1为模板，通过PCR的方法扩增出TIMP1基因，再采用分子克隆的方法，把TIMP1克隆到AAV表达质粒pSNAV2．0构建重组质粒pSNAV2-TIMP1。把重组质粒转染HEK293细胞，用免疫荧光和Westernblot的方法对重组质粒的表达进行研究，ELISA法检测细胞培养上清液中TIMP1蛋白的含量。结果PCR、酶切、DNA测序等方法均证实成功构建了含有完全正确的TIMP1基因序列的AAV表达质粒pSNAVz-TIMP1。体外成功转染入HEK293细胞，免疫荧光、Westernblot及ELISA的结果表明重组质粒能够高表达TIMP1蛋白。结论成功构建了表达TIMP1的重组质粒pSNAV2-TIMP1，并证实在蛋白质水平获得了表达，为进一步逆转椎间盘退变研究奠定了基础。