腺病毒介导血管内皮细胞生长因子基因体外转染骨髓间充质干细胞

【目的】探讨腺病毒介导血管内皮细胞生长因子（VEGF165）基因转染大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）后目的基因表达情况及对MSCs增殖分化的影响。【方法】构建含VEGF基因的腺病毒表达载体，利用贴壁法分离培养MSCs后，用荧光显微镜和流式细胞仪检测转染效果和转染率，用免疫组化、Western—Blot和ELISA方法分别检测VEGF基因转染MSCs后VEGF的表达情况。【结果】腺病毒介导的VEGF基因对于MSCs具有很高的转染效率，转染效率与病毒感染复制数（multipcyties of infection，MOI）具有量效关系。MOI为150倍时，转染效率〉95％，转染VEGF后，MSCs可有效表达VEGF，9d时达到表达高峰（1125pg／mL），13d后仍可检测到VEGF的表达。转染VEGF对MSCs的增殖分化没有明显影响。【结论】腺病毒介导的VEGF基因可以有效的转染MSCs，MSCs是一种理想的基因载体细胞，其携带的VEGF基因可获得较高的表达水平。     

腺病毒介导血管内皮细胞生长因子基因体外转染骨髓间充质干细胞

 【目的】探讨腺病毒介导血管内皮细胞生长因子(VEGF165)基因转染大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)后目的基因表达情况及对MSCs增殖分化的影响。【方法】构建含VEGF基因的腺病毒表达载体,利用贴壁法分离培养MSCs后,用荧光显微镜和流式细胞仪检测转染效果和转染率,用免疫组化、Western-Blot和ELISA方法分别检测VEGF基因转染MSCs后VEGF的表达情况。【结果】腺病毒介导的VEGF基因对于MSCs具有很高的转染效率,转染效率与病毒感染复制数(multiplicyties of infection,MOI)具有量效关系。MOI为150倍时,转染效率>95%,转染VEGF后,MSCs可有效表达VEGF,9d时达到表达高峰(1125pg/mL),13d后仍可检测到VEGF的表达。转染VEGF对MSCs的增殖分化没有明显影响。【结论】腺病毒介导的VEGF基因可以有效的转染MSCs,MSCs是一种理想的基因载体细胞,其携带的VEGF基因可获得较高的表达水平。     

血管内皮生长因子基因在兔骨髓间充质干细胞中的转染和表达

目的：探讨应用人血管内皮生长因子165 (hVEGF₁₆₅)进行基因修饰的可行性，为血管化组织工程组织的构建及缺血性疾病的治疗奠定实验基础。方法：构建pcDNA3.0-VEGF₁₆₅真核表达载体，利用脂质体介导转染兔骨髓间充质干细胞（MSCs），ELISA方法检测转基因MSCs的hVEGF蛋白表达情况，MTT法检测转基因MSCs表达物对血管内皮细胞增殖活性的影响，设单纯培养MSCs及pcDNA3.0转染MSCs组为对照组。结果：成功构建hVEGF真核表达载体，并成功地将其转入MSCs中；MSCs细胞在转染 pcDNA3.0-VEGF₁₆₅ 质粒24、48和72 h后，其培养上清中hVEGF蛋白表达量均较对照组显著升高（P<0.05），至G418筛选后12代，转基因MSCs培养上清中仍有hVEGF蛋白的表达，含2%、4%、8%、16%和32%转基因细胞培养上清的培养液均明显增加血管内皮细胞的增殖率，与对照组比较，差异均具有显著性（P<0.05）。 结论： hVEGF₁₆₅基因成功地转染至MSCs中，并可进行有效地表达。     

重组腺病毒介导血管内皮生长因子基因在骨髓间充质干细胞中的表达及其影响

目的观察重组腺病毒介导血管内皮生长因子基因(AdVEGF165)转染后大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)中血管内皮生长因子的表达情况以及腺病毒载体对大鼠骨髓间充质干细胞的生长影响情况。方法体外培养大鼠骨髓间充质干细胞,用腺病毒载体转染BMSCs。采用ELISA法检测血管内皮生长子因子(VEGF)的表达和分泌。转染后用胰酶消化传代培养,MTT法绘制细胞生长曲线。结果AdVEGF165转染组上清液中VEGF蛋白表达量极显著高于空白对照组(P<0.01)。且AdVEGF165转染BMSCs后,生长曲线与正常培养细胞无显著差异(P>0.05)。结论重组腺病毒载体能够在BMSCs中介导VEGF的表达,且对BMSCs生长无影响。     

血管内皮细胞生长因子基因转染骨髓间充质干细胞移植治疗疾病研究进展

骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cell,BMSC）是存在于骨髓基质中,具有干细胞特性,能够进行自我更新,有多向分化潜能的一类细胞。血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）是目前发现的促血管生成作用最强的因子,其具有促进血管生成,改善细胞的生存环境,从而提高细胞的存活率。目前,采用BMSC移植治疗各种疾病,已经取得了很大的疗效,但为了追求进一步的完善,许多学者利用BMSC具有独特的细胞增殖分裂模式,容易导入和表达外源基因,将VEGF基因转染入BMSC来治疗缺血性疾病,     

血管内皮生长因子转染骨髓间充质干细胞心肌移植对心肌梗死后大鼠心功能及血管新生的作用

目的建立重组人血管内皮生长因子(VEGF)165基因转染大鼠骨髓间充质干细胞(MSC)的方法,探讨该细胞心肌移植对缺血性心脏病心功能及血管新生的影响,并比较联合治疗与单独基因或细胞治疗的疗效差异。方法采用密度梯度离心-贴壁培养法获取Wistar近交系大鼠MSC,用脂质体将pcDNA3.1-hVEGF165转入该细胞,通过ELISA、RT—PCR和Western印迹检测后者VEGF的表达情况;以Wistar近交系大鼠建立心肌缺血模型,随机分成4组(每组12只),心肌梗死模型建立2周后,联合组在心肌梗死区移植转染VEGF165基因的MSC,细胞组移植等量的MSC,基因组注射脂质体-pcDNA3.1-VEGF165DNA复合物,对照组注射等容积培养液;另取12只未结扎冠脉的大鼠为假手术组。细胞移植4周后,用Buxco系统检测心功能;然后处死动物,取心肌标本,测量心肌梗死面积;用5-溴脱氧尿嘧啶(Brdu)、肌钙蛋白T免疫组化双染法确定移植细胞的存活与分化;用Ⅷ因子染色法检测血管新生,RT-PCR法检测VEGF165基因的体内表达情况。结果(1)pcDNA3.1-hVEGF165基因通过脂质体转染大鼠MSC后获稳定表达;(2)移植4周后,联合组心肌梗死面积(27．8％±3．0％)明显低于细胞组(37．0％±10．1％)与基因组(37．1％±5．2％,均P<0．05),心功能改善优于细胞组与基因组;(3)联合组心肌梗死区毛细血管密度(每视野40．2个±5．5个)高于细胞组(27．2个±6．3个,P<0．01)和对照组(18．5个±5．8个,P<0．01),较基因组(35．8个±7．7个)亦有增加的趋势(P=0．189);(4)Brdu、肌钙蛋白T双染示各治疗组心肌梗死区心肌细胞数量不同程度的多于对照组;(5)联合组VEGF基因的体内表达(hVEGFmRNA相对含量0．18±0．04)高于基因组(0．10±0．03,P<0．01)。结论转染VEGF基因的MSC移植可使鼠冠脉结扎造成的心肌梗死面积缩小、心功能明显改善,其疗效优于单独应用基因或细胞治疗,为缺血性心脏病的细胞基因联合治疗提供了理论依据。     

骨髓间充质干细胞旁分泌促血管生成的研究进展

骨髓间充质干细胞（BMSC）是目前常用于细胞移植治疗的组织工程种子细胞,很多研究致力于BMSC移植修复各种缺血梗死的机体组织。BMSC可能通过多种途径改善组织供血状况,目前认为其旁分泌促血管生成因子及具有向血管内皮细胞分化的潜能是其促血管再生的重要机制。     

转染血管内皮细胞生长因子基因的同种异体骨髓间充质干细胞移植大鼠缺血心肌的实验研究

目的 腺病毒介导血管内皮细胞生长因子基因（AdVEGF165）转染同种异体大鼠骨髓间充质干细胞（BM-SCs），移植到大鼠缺血心肌后，观察其对心功能的影响。方法 体外培养同种异体大鼠BMSCs，用AdVEGF165转染同种异体大鼠BMSCs，采用ELISA法检测血管内皮细胞生长因子（VEGF）的表达和分泌。结扎Wistar大鼠冠状动脉前降支，4周后随机将其分为4组，组Ⅰ：移植转染后的BMSCs；组Ⅱ：移植单纯BMSCs；组Ⅲ：心肌内注射AdVEGF。（基因治疗）；组Ⅳ：心肌内注射DMEM（对照组）。4周后通过超声检查观察心脏射血分数（EF）变化，评价其对心功能的影响；免疫组织化学观察移植的BMSCs在局部存活、分化情况。结果 ELISA检测提示：转染后BMSCs的培养上清液中有大量VEGF表达，较未转染组差异有极显著性意义（P〈0．01）。超声检查结果提示：组IEF改善幅度较组Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ明显（均P〈0．01）。免疫组织化学检测提示：组Ⅰ、Ⅱ中大部分移植细胞能够在移植处存活并转化为心肌细胞。结论 转染AdVEGF165的同种异体BMSCs能有效修复大鼠心肌，并能改善其心功能。     

人VEGF基因转染大鼠骨髓间充质干细胞的实验研究

目的：建立人血管内皮生长因子165（hVEGF165）基因转染大鼠骨髓间充质干细胞的方法。方法：采用密度梯度离心-贴壁培养法获Wistar大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）,测定其生长曲线和表面标志CD34,CD44,CD45及SH3,检测其向成骨细胞及脂肪细胞诱导分化潜能后;用脂质体介导法将pcDNA3.1-hVEGF165导入MSCs,观察转染后细胞形态和生长状况,通过RT-PCR,Western blot和ELISA鉴定VEGF在MSCs中的表达情况。结果：大鼠MSCs经检测为CD44和SH3阳性,CD45和CD34阴性,可诱导分化为成骨细胞和脂肪细胞;经RT-PCR,Western和ELISA检测证实阳离子脂质体能成功地将hVEGF。转染至大鼠MSCs,并获得有效的表达。结论：真核表达载体pcDNA3.1-VEGF165在MSCs中获有效表达。     

血管内皮生长因子C诱导骨髓间充质干细胞分化为淋巴管内皮细胞的研究

目的 研究骨髓间充质干细胞向淋巴管内皮细胞分化的潜能及条件,为淋巴管再生和重建提供理想的细胞来源。方法 分离SD大鼠骨髓间充质干细胞,流式细胞仪检测骨髓间充质干细胞表面抗原CD31、CD14、CD29和CD90。将纯化的骨髓间充质干细胞加血管内皮生长因子C(VEGF-C)50ng/mL诱导培养10d,Western-blot法与免疫荧光染色法检测细胞中淋巴管内皮细胞标记物Prox-1和LYVE-1的表达。结果 骨髓间充质干细胞呈现典型的梭形和旋涡状排列;经VEGF-C诱导后,细胞变短、呈多边形。流式细胞学显示,分离培养的骨髓间充质干细胞表面抗原CD29、CD90呈阳性表达,CD31、CD14呈阴性表达;Western-blot检测显示,经VEGF-C培养诱导后,细胞明显表达淋巴管内皮特异性标记物Prox-1和LYVE-1;免疫荧光染色显示,诱导后细胞均明显表达Prox-1和LYVE-1,而未分化的骨髓间充质干细胞Prox-1和LYVE-1均不表达。结论 VEGF-C可以诱导骨髓间充质干细胞表达淋巴内皮细胞特异性标记物,促进其向淋巴管内皮转化。     

血管内皮生长因子在急性髓系白血病细胞中的表达

目的探讨血管内皮生长因子(VEGF)在成人急性髓系白血病(AML)的发生发展中的作用。方法采用逆转录PCR(RT-PCR)和酶联免疫吸附(ELISA)的方法研究50位AML病人及16位正常人骨髓细胞及血浆VEGF的表达。结果部分正常人和大多数AML病人的骨髓细胞及白血病细胞系均表达VEGF。AML病人骨髓细胞VEGF表达阳性率(82%)明显高于正常人(30.76%)及骨髓移植后的AML病人(41.76%)。难治型和非难治型AML病人血浆中VEGF浓度均显著高于正常人和AML骨髓移植后病人(P<0.01)。除正常人与骨髓移植后AML病人血浆中VEGF浓度比较无统计学差异外(P>0.05),另与其他两者之间均有显著性差异(P<0.01)。难治型和非难治型白血病病人骨髓细胞分泌的VEGF分别比正常人高11.0和7.3倍,且两者之间比较有显著性差异(P<0.01)。结论VEGF在AML病人中存在异常表达,在AML的发病机制中可能起一定的作用,且可能成为判断AML病人预后指标之一。     

VEGF基因真核表达载体的构建及其在骨髓间充质干细胞中的表达

目的探讨经腺病毒表达载体转染血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)165基因的骨髓间充质干细胞(mesenchymal stemcells,MSCs)体内外基因表达的特点。方法构建VEGF基因腺病毒表达载体,将VEGF165基因转染到MSCs中。用RT-PCR法检测转基因MSCs中基因表达情况。结果转基因MSCs及其分化的子代细胞均有VEGF165的表达,并持续2周左右时间。结论经腺病毒表达载体转染VEGF165基因的MSCs在体内外均有良好的基因表达。     

血管内皮细胞生长因子基因转染诱导大鼠骨髓基质干细胞分化为内皮细胞

目的：评价经腺病毒介导的血管内皮细胞生长因子(VEGF)基因转染后的大鼠骨髓基质干细胞(BMSCs)诱导成内皮细胞的可行性。方法：从大鼠骨髓中分离培养获取BMSCs，分别经Adv-VEGF、Adv-GFP转染，Western印迹分析检测VEGF蛋白的表达情况．细胞生长曲线测定BMSCs增殖特性．同时进行免疫表型鉴定．并与未转染细胞组比较。结果：Adv-VEGF转染组BMSCs可分泌VEGF蛋白，而其杂两组不分泌VEGF蛋白。转染VEGF基因后,BMSCs生长速度变快．向内皮细胞分化。与Adv-VEGF转染组BMSCs相比．Adv-GFP转集细胞组、未转染细胞组的BMSCs生长速度较慢．未有向内皮细胞分化的证据。结论：腺病毒介导的VEGF基因转繁可诱导BMSCs分化成内皮细胞。     

人VEGF基因腺病毒表达载体修饰大鼠骨髓间充质干细胞

目的 探讨含人血管内皮细胞生长因子(VEGF)基因腺病毒表达载体Ad-VEGF转染大鼠骨髓间充质干细胞(BM-MSCs)的可行性.方法 采用贴壁培养筛选法富集大鼠BM-MSCs.将HEK293细胞中扩增并经效价分析后的Ad-VEGF转染大鼠BM-MSCs,通过对细胞转染效率、生长和活力的观察分析,以确定理想的感染复数(MOI)值.结果 本实验经HEK293细胞扩增制备的Ad-VEGF的病毒效价达8×108 pfu/ml;当MOI值为50时,Ad-VEGF转染大鼠BM-MSCs效率可达最高值53％;而MOI值高于50时,Ad-VEGF转染对BM-MSCs活性抑制明显.结论 成功实现Ad-VEGF转染大鼠BM-MSCs,其最适MOI值为50.     

肾毒血清对骨髓内皮祖细胞增生及血管内皮生长因子表达的影响

目的 研究肾毒血清对骨髓内皮祖细胞(EPCS)增生及血管内皮生长因子表达的影响.方法 分离SD大鼠骨髓内皮祖细胞,将其分为对照组和肾毒血清组[后者按所含肾毒血清的不同体积浓度(1.25%、2.5%、5.0%)分3个亚组,肾毒血清取自成模12周后的5/6肾切除模型大鼠];利用MTT检测EPCs的增生率,ELISA检测培养上清VEGF的浓度,RT-PCR检测VEGF mRNA的表达.结果 不同浓度的肾毒血清在不同时间点对培养EPCs均有不同程度的增生抑制作用(除1.25%的肾毒血清在12 h时外,其他均P＜0.01);同一浓度的肾毒血清对EPCs的增生抑制作用随着刺激时间的延长而增加,24 h的增生率显著低于12h(均P＜0.01),48 h的增生率显著低于24 h(均P＜0.01);12 h时,各肾毒血清组EPCs分泌的VEGF均显著高于对照组(均P＜0.01),24 h时,5.0%肾毒血清组EPCs分泌的VEGF则显著低于对照组(P＜0.01);48 h时,各肾毒血清组EPCs分泌的VEGF均低于对照组.对照组12 h、24 h和48 h时VEGF mRNA表达分别为(0.55±0.03)、(0.53±0.02)和(0.49±0.04),2.5%肾毒血清组12 h、24 h和48 h时VEGF mRNA表达分别为(0.50±0.02)、(0.34±0.02)和(0.15±0.01),2.5%肾毒血清组各时间点之间的VEGF差异有显著性(均P＜O.05).结论 肾毒血清能抑制EPCs的增生可能是通过抑制EPCs的VEGF mRNA表达、进而减少VEGF分泌而实现的.     

骨髓间充质干细胞的肌源性诱导分化及转染VEGF基因的表达

目的 体外诱导兔骨髓间充质干细胞向肌源性细胞分化,并观察血管内皮生长因子AdTrackCMV-hVEGF165真核表达质粒转染骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)后的表达。方法 将20只兔随机分为对照组和实验组,从骨髓液中分离MSCs,对照组以低糖DMEM培养,实验组加用5-氮胞苷(10 mmol/L)诱导培养,第28天进行肌钙蛋白I免疫组化染色。另构建AdTrackCMV-hVEGF165真核表达质粒,通过脂质体转染对照组MSCs,用Northern blotting和Western blotting鉴定血管内皮生长因子(VEGF)的表达,并用ELISA法测定培养上清液中VEGF的浓度。结果 成功分离培养出兔MSCs,实验组经5-氮胞苷诱导后MSCs向肌源性细胞分化,肌钙蛋白I免疫组化染色阳性。成功构建AdTrackCMV-hVEGF165真核表达质粒并通过脂质体转染MSCs,Northern blotting示转染的MSCs VEGF165表达信号明显强于未转染细胞,Western blotting 示转染VEGF165基因的MSC表达VEGF,ELISA法测定培养上清液中VEGF的浓度在转染后第3天(1 011 pg/ml)和第5天(1 027 pg/ml)达高峰,此后逐渐下降,但至第13天(349 pg/ml)仍显著高于空白对照(116 pg/ml)和pAdTrackCMV组(125 pg/ml),P<0.01。结论 兔骨髓间充质干细胞可在体外向肌源性细胞分化,转染VEGF基因可表达VEGF,有望将干细胞移植和基因治疗结合以治疗缺血性心脏病。     

大鼠骨髓间充质干细胞向内皮细胞分化潜能的研究

目的体外研究大鼠骨髓间充质干细胞(rMSCs)分化为血管内皮细胞的潜能。方法采用密度梯度离心法分离rMSCs,体外扩增并进行鉴定。在内皮细胞生长培养基(EGM-2)中以血管内皮细胞生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)定向诱导rMSCs向血管内皮细胞分化,观察细胞形态学变化。采用免疫细胞化学法和Dil荧光标记法,分别检测诱导后rMSCs的内皮细胞表型表达及对乙酰化低密度脂蛋白(Ac-LDL)的摄取能力。结果形态学观察显示,诱导后的rMSCs可见类似内皮细胞样改变,并表达血管内皮细胞特异的表面标志vWF和CD31,但仅少数细胞具有摄取Dil-Ac-LDL的能力。结论VEGF和bFGF在体外能够诱导rMSCs出现内皮细胞表型,但尚不完全具备成熟内皮细胞的功能特性。rMSCs具有向血管内皮细胞分化的潜能。