2种重组真核蛋氨酸酶原核体系表达及活性比较

目的构建2种真核L-蛋氨酸γ-裂解酶(MGL1 MGL2)的高效原核表达载体,诱导表达及纯化,比较活性差异.方法通过分子克隆技术构建2种重组表达质粒pGEX-4T-1-MGL1,pGEX-4T-1-MGL2;重组质粒转化感受态大肠杆菌Dh5α,诱导表达纯化蛋氨酸酶.结果构建了高效表达载体pGEX-4T-1-MGL1,pGEX-4T-1-MGL2;pGEX-4T-1-MGL1表达的酶纯度为82.5%,活性为0.505 2 IU/mg,pGEX-4T-1-MGL2表达的酶纯度为81.4%,活性为0.305 2 IU/mg.结论 pGEX-4T-1-MGL1,pGEX-4T-1-MGL2都能表达蛋氨酸酶;pGEX-4T-1-MGL1表达的蛋氨酸酶纯度比较高,酶活性比较高.     

唾液富组蛋白5表达载体的构建

目的将唾液富组蛋白5cDNA克隆至表达载体pGEX-4T-1。方法EcoR I＋Sal I双酶切克隆载体pMD19-T-hrp5及pGEX-4T-1，回收目的片段hrp5及双酶切载体pGEX-4T-1，将二者连接后转化大肠杆菌DH5α，氨苄青霉素筛选阳性菌落，PCR、酶切、测序鉴定重组质粒。结果唾液富组蛋白5的cDNA正确克隆至表达载体pGEX-4T-1，无突变。结论重组载体pGEX-4T-1-hrp5构建成功。     

犬博卡病毒结构基因VP2多片段原核表达载体的构建及表达条件的优化

目的 构建重组pGEX-4T-3-VP2-A、pGEX-4T-3-VP2-B、pGEX-4T-3-VP2-C、pGEX-4T-3-VP2-D原核表达质粒,并在大肠杆菌中进行表达,对诱导表达条件进行优化,为下一步获得大量纯化的融合蛋白奠定基础.方法 应用蛋白二级结构软件,设计合成MVC-VP2基因片段引物.用PCR法扩增不同长度的cDNA片段,通过EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ酶切位点分别将四个不同的片段插入到pGEX-4T-3中,构建四种原核表达重组质粒,并转化E.coli DH5α,筛选阳性重组子,限制性内切酶酶切鉴定和DNA序列测定正确后,转入E.coli BL21中,异丙基硫代β-D半乳糖苷（IPTG）诱导表达,对表达条件（诱导剂浓度、诱导时间、诱导温度）进行优化,并通过SDS-PAGE鉴定.结果 酶切及测序结果证明,成功构建了四种原核表达重组体质粒pGEX-4T-3-VP2-A、pGEX-4T-3-VP2-B、pGEX-4T-3-VP2-C、pGEX-4T-3-VP2-D,成功表达四种融合蛋白,优选出IPTG诱导终浓度为0.5 mmol＆#183;L-1,诱导时间为12h,诱导温度为18℃.结论 成功构建了原核表达重组体质粒pGEX-4T-3-VP2-A、pGEX-4T-3-VP2-B、pGEX-4T-3-VP2-C、pGEX-4T-3-VP2-D,优化出最佳诱导条件,为下一步获得大量纯化的目的蛋白、制备VP2多克隆抗体奠定基础.     

重组蛋氨酸裂解酶原核体系的表达及纯化

目的 建立L-蛋氨酸γ-裂解酶的原核表达、纯化体系.方法 合成Metase基因并构建重组质粒pBSK-Metase.通过分子克隆技术,构建重组表达质粒pBV220-Metase和pGEX-4T-1-Metase,并将重组子转化到感受态大肠杆菌Dh5α中.pGEX-4T-1-Metase经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导;pBV220-Metase经42℃温度诱导;并对诱导条件进行优化,获得大量表达;建立蛋氨酸裂解酶纯化体系.结果 构建出Metase基因的两种高效原核表达体系pBV220-Metase和pGEX-4T-1-Metase,并优化各自的最佳诱导表达条件;建立重组蛋氨酸裂解酶的纯化体系.结论 成功建立重组蛋氨酸裂解酶的原核表达、纯化体系;获得高效原核表达重组子pGEX-4T-1-Metase,且获得纯度高达95%的蛋氨酸酶.     

骨桥蛋白融合蛋白的原核表达

目的：研究骨桥蛋白（Osteopontin ,OPN ）的作用及机制,探索可大量制备OPN的方法。方法利用重组DNA技术,将OPN 的cDNA片段插入到原核表达载体pGEX-4T-1中,转入大肠杆菌诱导表达GST-0PN融合蛋白。结果成功得到pGEX-4T-1-0PN表达载体且顺利获得大量融合蛋白。结论利用重组DNA技术,将OPN 的cDNA片段插入到原核表达载体pGEX-4T-1中可以制备大量OPN蛋白。     

结核分枝杆菌RD1区PPE68/GST融合蛋白表达质粒的构建及表达

目的:构建结核分枝杆菌PPE68/GST融合蛋白表达质粒,并在大肠杆菌JM109中诱导表达. 方法: 利用PCR技术从结核杆菌H37Rv中扩增Rv3873基因,并将其定向克隆pGEX-4T-1中,构建重组表达质粒pGEX-4T-1-Rv3873并转化E.coli JM109,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达.采用GST蛋白纯化试剂盒进行重组融合蛋白纯化,SDS-PAGE和Western Blot鉴定重组表达产物. 结果:成功构建原核表达质粒pGEX-4T-1-Rv3873并表达出约Mr 63 000大小的PPE68/GST融合蛋白,占总菌体的40%. Western Blot检测该融合蛋白能和结核患者多价抗血清发生反应. 结论:成功地构建了原核表达质粒pGEX-4T-1-Rv3873,并在大肠杆菌得到表达.     

重组原核表达载体pGEX-4T-1-MAGE-1的构建及表达

目的:构建人肿瘤相关抗原MAGE-1基因原核表达载体.方法:从人肝细胞性肝癌组织中提取总RNA,RT-PCR扩增出MAGE-1基因.酶切鉴定后,将其插入pGEM-T载体,再克隆至原核表达载体pGEX-4T-1中,构建重组表达质粒pGEX-4T-1-MAGE-1.将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),经1 mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导4 h,SDS-PAGE及凝胶密度扫描分析目的蛋白的表达情况.结果:RT-PCR扩增出长度为927 bp的MAGE-1基因.重组表达质粒pGEX-4T-1-MAGE-1转化大肠杆菌BL21(DE3)后经诱导表达,目的蛋白约57 000,占菌体总蛋白的23%.结论:成功构建出重组原核表达载体pGEX-4T-1-MAGE-1,该载体在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达.     

人端粒酶逆转录酶原核表达载体的构建

目的：构建人端粒酶逆转录酶原核表达载体pGEX-4T-1-hTERT,并观察融合蛋白的表达。方法：用RT-PCR方法从人肝癌组织中扩增出带有EcoRⅠ酶切位点的hTERT基因片段,与pGEM-T Easy连接,转化感受态大肠杆菌JM109,经蓝-白筛选、PCR扩增等筛选阳性菌落,用EcoRⅠ酶切获取目的片段,并与EcoRⅠ酶切过的pGEX-4T-1质粒连接,重组子转化BL21感受态大肠杆菌,PCR扩增筛选出阳性菌落。基因测序并用Omega 2．0软件比较分析重组质粒中hTERT基因片段与GenBank中的已知序列的同源性。通过诱导pGEX-4T-1融合蛋白表达,用抗hTERT多抗对融合蛋白进行Western blot鉴定,薄层凝胶光密度扫描测定融合蛋白表达量。结果：PCR扩增等方法证实,人端粒酶逆转录酶原核表达载体pGEX-4T-1-hTERT构建成功,其中hTERT基因片段与GenBank中相应基因同源性为98．73％,氨基酸序列同源性为99．68％。Western blot检出GST-hTERT融合蛋白,其表达量达28．4％。结论：成功构建了pGEX-4T-1-hTERT原核重组质粒并获得高度表达。     

人胰高血糖素样肽-1突变体基因的构建和表达

目的构建人胰高血糖素样肽-1突变体（^2Gly-hGLP-1）基因，并表达GST一^2Gly-hGLP-1。方法用限制性内切酶双酶切载有hGLP cDNA的重组克隆质粒PMD18T simple和原核表达质粒pGEX-4T-1，将GLP-1定向插入原核表达载体pGEX-4T-1^＊中，筛选出阳性克隆。在获得重组hGLP-1基因工程菌的基础上，利用定向突变的技术改造其第2位丙氨酸为甘氨酸，经酶切克隆于pGEX-4T-1^＊中，构建pGEX-4T-1^＊／^2Gly-hGLP-1表达载体。转化大肠杆菌BL21并进行诱导表达。结果经测序分析，证明^2Gly-hGLP-1已经克隆到pGEX-4T-1^＊中。Western blot证实，该蛋白可被特异性hGLP-1识别。结论成功构建和表达了人胰高血糖素样肽-1突变体原核表达质粒。     

类泛素化修饰蛋白SUMO3/GST融合蛋白表达载体的构建及表达

目的:构建pGEX-4T- 1/SUMO3重组表达质粒,并在大肠杆菌中表达和纯化出类泛素化修饰蛋白SUMO3/GST融合蛋白.方法:采用PCR技术利用pcDNA3.1-SUMO3质粒为模板,扩增出SUMO3全长编码序列(312 bp),并将其重组于谷胱甘肽硫转移酶(GST)融合蛋白表达质粒pGEX-4T-1中,酶切、测...     

PRL-3基因的克隆及其原核表达载体的构建表达

目的 克隆人PRL-3基因并构建其原核表达载体.方法 设计PRL-3特异性引物,提取人大肠癌细胞系SW480总RNA,用RT-PCR方法获取人PRL-3 cDNA.经T-A克隆,通过双酶切鉴定及测序确认后,构建人PRL-3基因的原核表达载体pGEX-4T-1-PRL-3.结果 成功扩增出人PRL-3全长cDNA,并构建pGEX-4T-1-PRL-3原核表达载体,测序结果表明PRL-3全长cDNA与GenBank中PRL-3序列完全一致,SDS-PAGE胶分析表明,在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达了重组蛋白.结论 获得人PRL-3基因全长cDNA并构建其原核表达载体,使其在大肠杆菌中获得了高效表达,为深入研究PRL-3基因在大肠癌发生发展中的作用奠定了基础.     

日本血吸虫（中国大陆株）Sj16基因的体外扩增及克隆

为了构建日本血吸虫（中国大陆株)Sj16基因原核表达重组质粒pGEX-4T-1-Sj16。根据曼氏血吸虫Sm16基因已知序列设计合成一对引物,用PCR技术从日本血吸虫（中国大陆株）成虫cDNA库中扩增Sj16基因;将Sj16基因定向克隆入pGEX-4T-1;转化感受态BL21/DE3菌;用酶切,PCR扩增鉴定筛选得到的重组阳性克隆。结果表明,从日本血吸虫（中国大陆株）成虫cDNA库中获取Sj16基因,重组质粒中含有Sj16基因。结果提示,成功构建日本血吸虫（中国大陆株）Sj16基因原核表达重组质粒pGEX-4T-1-Sj16,为进一步研究Sj16基因功能打下基础。     

人Tau基因多表位肽段原核表达载体的构建与表达

目的构建含人Tau多表位肽段基因的原核表达载体,在大肠杆菌中诱导表达并纯化目的蛋白,检测Tau多表位DNA疫苗免疫小鼠后特异性抗体产生情况。方法以质粒pVAX1-Tau为模板,用PCR扩增人Tau多表位肽段基因,插入表达载体pGEX-4T-2中,构建原核表达质粒pGEX-4T-2-TauP1/P2。将鉴定后的阳性重组质粒转入E.coli BL21(DE3)中,经异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导表达,并采用GST法纯化、SDS-PAGE鉴定目的蛋白的表达。以TauP1/P2 DNA疫苗免疫小鼠获取血清,Dot-blot检测TauP1/P2特异性抗体产生情况。结果 PCR扩增出约300 bp的基因片段,克隆至表达载体后,经酶切和测序验证正确;获得了纯化的目的蛋白,并证实了GST-TauP1/P2融合蛋白的表达。Dot-blot检测到特异性TauP1/P2抗体的产生。结论成功构建和表达人Tau多表位肽段基因的目的蛋白GST-TauP1/P2,能够识别Tau多表位DNA疫苗免疫后小鼠产生的特异性TauP1/P2抗体。     

MAGE-3目的基因原核表达载体的构建和表达

目的构建原核表达载体pGEX-4T-1-MAGE-3并检测其在大肠杆菌（E．coli）BL21中的表达，为制备以黑色素瘤抗原-3（MAGE-3）基因片段为基础的肽疫苗及特异诊断试剂提供抗原打下基础。方法通过逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR）法制备MAGE-3目的基因，以pGEM—T Easy为克隆载体，DGEX-4T-1为原核表达载体，将MAGE-3目的基因克隆至pGEM—TEasy载体和亚克隆至pGEX-4T-1载体上。筛选、鉴定阳性克隆并将其转化E．coli BL21．经IPTG诱导，12％SDS—PAGE电泳分离和Western Blot表达鉴定。结果正确构建了原核重组表达质粒pGEX-4T-1-MAGE-3；在E．coli BL21中检测到含该重组表达质粒的转化菌表达出分子量35kD的融合蛋白；基因测序结果表明，阳性克隆中的MAGE-3目的基因序列与GenBank公布的已知序列完全一致。结论成功构建的原核重组表达载体pGEX-4T-1-MAGE-3及其所表达的融合蛋白，为以MAGE-3目的基因为基础的肽疫苗及特异诊断试剂的研制提供抗原打下了基础；为后续实验提供了依据。     

HCK SH3结构域与HIV-1 Nef蛋白体外结合活性的检测

目的构建重组原核表达质粒pGEX-4T-1/SH3,检测原核表达的SH3蛋白的生物学活性。方法利用PCR方法扩增HCK SH3基因,并将其克隆到原核表达载体pGEX-4T-1中,构建原核表达质粒pGEX-4T-1/SH3,转化E.coli DH5α,进行双酶切和测序鉴定。筛选阳性质粒,转化至E.coli BL21(DE3)中进行表达,对表达产物进行SDS-PAGE和蛋白质印迹检测,同时纯化SH3蛋白。表达并纯化HIV-1 Nef蛋白,利用GST pull-down方法检测SH3蛋白与Nef蛋白的结合活性。结果成功获得重组质粒pGEX-4T-1/SH3,测序正确,高效表达并纯化了SH3蛋白。GST pull-down实验结果显示SH3与HIV-1 Nef蛋白具有良好的结合活性。结论成功地克隆、表达和纯化了GST-SH3蛋白,SH3与Nef蛋白具有体外特异性结合活性,为进一步研究针对Nef与SH3结合的靶向药物的筛选提供了实验基础。     

布鲁氏菌猪种标准株外膜蛋白OMP25的原核表达

目的克隆布鲁氏菌外膜蛋白Omp25基因并构建基因的原核表达系统。方法用聚合酶链反应技术扩增得到布鲁氏菌基因组，得Omp25基因片段，T—A克隆后测定核苷酸序列，将目的基因定向插入原核表达载体pGEX-4T-1，经双酶切和DNA测序测定，将构建的重组质粒转化大肠杆菌（E．coli HB101，TOP10），经IPTG诱导后，用SDS—PAGE检测重组蛋白rOrap25表达情况。结果经DNA测序显示Omp25DNA序列和插入位点正确，成功构建了重组质粒DGEX-4T-1-Omp25，经IPTG诱导，特异性表达出以包涵体形式存在48kDa的Omp25融合蛋白。结论制备、克隆了布鲁氏菌外膜蛋白Omp25基因片段，并在大肠杆菌中表达出Omp25融合蛋白。     

人颗粒裂解肽突变子在大肠埃希菌中的构建与表达研究

目的构建NKG5突变基凶的原核表达载体并进行表达研究。方法采用寡核苷酸合成的方法,拼接成为NKG5-Set的编码序列．克隆到pGEMT载体上,测序正确后,再切下编码序列连接到质粒pGEX-4T—1中,重组表达载体转化大肠埃希菌BL21（DE3）plysS,用IPTG诱导使融合蛋白高效表达。结果成功获得重组表达载体pGEX-4T-1-NKG5-Ser,转染大肠埃希菌BL21（DE3）pLysS,诱导表达后,SDS—PAGE和免疫印迹反应均显示显示出相对分子量（Mr）为35kD的蛋白条带,证明融合蛋白表达成功。结论获得了突变NKG5与GST的融合蛋白,为进-步的工作打下了基础。     

重组模型人肿瘤坏死因子α的克隆及GST—TNF融合基因的构建

目的：构建膜结合型人肿瘤坏死因子与谷胱甘肽－S－转移酶（GST）的融合基因表达载体。方法：用RT－PCR一步法扩增出人膜结合型TNF基因片段,定向克隆到质粒pUC19中。再通过定向亚克隆插入真核表达质粒pGEX-4T-3中GST下游。结果：从激活的单核细胞中扩增出700bp左右的膜型TNF基因;限制性酶切产物和以重组载体为模板的PCR扩增证实了重组载体构建成功。结论：从激活的单核细胞中扩增出700bp左右的膜型TNF基因;限制性酶切产物和以重组载体为模板的PCR扩增证实了重组载体构建成功。结: 重组模型TNF的GST融合表达及纯化优化,为进一步定点突变,设计高效低毒的非分泌性膜结合TNF,用于肿瘤的基因治疗打下了良好的基础。