生物反应器微载体放大培养Marc-145细胞及PRRSV增殖情况

目的确定不同级别生物反应器间Marc-145细胞在微载体上消化放大培养条件,实现Marc-145细胞二级放大后,在生物反应器内增殖猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)。方法在一级生物反应器(BC-7L型)内,以微载体密度4 g/L培养Marc-145细胞,培养72 h时经灭菌PBS漂洗、胰酶消化后,接种至二级生物反应器(BC-14L型)继续培养,实现反应器间微载体细胞5倍体积增殖培养。以0.05 MOI接种PRRSV(TJM-F92株),接毒后24、36、48、60、72 h分别取上清及全液样品,检测病毒效价(TCID50)。结果 Marc-145细胞经过一级生物反应器培养72 h后,细胞密度达28.7×105个/ml;消化放大后,二级生物反应器培养72 h后,细胞密度达24.9×10~5个/ml。接毒后36 h,样品效价峰值可达108.19 TCID50,上清与全液样品效价差异较小。结论 Marc-145细胞从BC-7L型到BC-14L型不同反应器之间进行放大培养是可行的,为PRRSV活疫苗新型工艺改进及大规模放大生产奠定了基础。     

Vero细胞和流感病毒在无血清条件下的微载体培养

目的探索Vero细胞和流感病毒在无血清条件下的微载体培养条件。方法在搅拌瓶中,选择合适的微载体,在无血清条件下培养Vero细胞和流感病毒。观察Vero细胞的生长状况,并检测流感病毒的血凝滴度。结果Vero细胞在Cytodex 3上生长最好,每个微载体上接种10个细胞为最佳接种浓度,以MOI=0.005和0.010 CCID50/细胞接种H1N1流感病毒后,在72h时,培养上清病毒血凝滴度达到最高。结论无血清条件下,Vero细胞在Cytodex 3上生长良好,流感病毒能在Vero细胞上成功培养。     

Vero细胞微载体悬浮培养制备人用狂犬病疫苗的研究

将“北京”及“CTN”两株中国分离的狂犬病病毒毒株适应于Vero细胞,病毒滴度可达10~(7.5)LD_(50)/ml。应用Veto细胞微载体反应器系统培养病毒,经丙内酯灭活,超滤浓缩制备的疫苗,其效力试验(NIH法)结果优于现行原代地鼠肾细胞培养疫苗。     

微载体与片状载体培养MDCK-G1细胞的比较

目的比较微载体与片状载体培养MDCK-G1细胞的效果。方法在7. 5 L生物反应器中,分别使用微载体和片状载体培养MDCK-G1细胞,比较细胞的贴壁效率,并对搅拌转速、初始细胞接种密度、载体量进行优化。结果微载体最适培养条件为搅拌转速55 r/min,初始细胞接种密度3×10^5个/mL,载体量8 g/L,在此条件下最高细胞密度为(5. 03±0. 12)×10^6个/mL;片状载体最适培养条件为搅拌转速120 r/min,初始细胞接种密度2×10^5个/mL,载体量200 g,在此条件下最高细胞密度为(10. 22±0. 69)×10^6个/mL。结论片状载体能够用于MDCK-G1细胞的培养,且相对于微载体可获得更高的细胞密度,但有不易放大的缺点,作为细胞培养系统进一步开发具有很大的应用潜力。     

Vero细胞生物反应器微载体无血清培养甲型流感病毒

目的 采用Vero细胞生物反应器微载体无血清培养甲型流感病毒。方法 将Vero细胞分别采用无血清和有血清培养基于生物反应器(pH 7.2,温度37℃,溶氧量50%,转数60 r/min)中培养24 h,均用无血清培养基进行灌流培养至7 d,进行计数,并按MOI=0.1接种H1N1型流感病毒,加入终浓度为1μg/mL的TPCK-胰酶,于生物反应器(pH 7.8,温度33.0℃,溶氧量25%,转数60 r/min)中培养18、22、42、48、66 h,取样,检测血凝效价。结果 Vero细胞经无血清和有血清培养基培养7 d的细胞数分别为(133.4±2.0)×10⁴和(193.8±1.3)×10⁴个/mL,接种H1N1流感病毒66 h后血凝效价几何平均数分别为1∶388和1∶675,前者细胞数及病毒血凝效价几何平均数均显著低于后者(t分别为7.068和4.332,P均<0.05)。结论 采用Vero细胞通过生物反应器微载体无血清培养H1N1型流感病毒的血凝效价可满足流感病毒裂解疫苗制备的要求。     

Vero细胞微载体技术规模化培养轮状病毒

目的利用Vero细胞微载体技术规模化培养轮状病毒。方法利用5 L生物反应器进行Vero细胞的微载体培养,待细胞密度达1.5×106个/ml时,以0.05 MOI接种轮状病毒P[2]G3株,于37℃连续培养6 d后收获病毒,期间每天取样观察细胞病变(CPE),并检测病毒感染性滴度。结果在轮状病毒规模化培养的初期,其病毒滴度逐渐升高,至48 h达到最高。在上清中,病毒的滴度为5.5CCID50/ml;在细胞裂解产物中,病毒的滴度为3.75CCID50/ml。结论Vero细胞微载体规模化培养轮状病毒可提高病毒的滴度。     

微载体技术肝细胞体外高密度培养的实验

将大鼠肝细胞接种至2种不同微载体(实体微载体Cytodex、多孔微载体Cytopore)进行微重力高密度体外培养,观察细胞生长形态及细胞活力等情况,并通过细胞代谢功能指标葡萄糖、白蛋白、尿素等指标的测定,反映细胞在两种载体的生长和代谢情况。结果表明,Cytopore的MTT值、代谢指标值是Cytodex的1倍左右。因此,大鼠肝细胞在载体Cytopore的高密度培养比载体Cytodex更有利于细胞的生长增殖和代谢。     

微载体技术肝细胞体外高密度培养的实验

将大鼠肝细胞接种至2种不同微载体(实体微载体Cytodex、多孔微载体Cytopore)进行微重力高密度体外培养,观察细胞生长形态及细胞活力等情况,并通过细胞代谢功能指标葡萄糖、白蛋白、尿素等指标的测定,反映细胞在两种载体的生长和代谢情况。结果表明,Cytopore的MTT值、代谢指标值是Cytodex的1倍左右。因此,大鼠肝细胞在载体Cytopore的高密度培养比载体Cytodex更有利于细胞的生长增殖和代谢。     

无血清微载体培养Vero细胞和H1N1流感病毒条件的优化

目的优化无血清微载体培养Vero细胞和H1N1流感病毒的条件,为Vero细胞流感疫苗的开发奠定基础。方法在搅拌瓶中采用不同的细胞接种量和不同的微载体浓度培养Vero细胞,制备流感病毒,并检测不同的pH值、TPCK-胰酶含量、病毒接种量及病毒收获时间对流感病毒血凝滴度的影响。结果以(1.0～5.0)×105个/ml的Vero细胞接种至浓度为3mg/ml的无血清微载体中,病毒培养液pH值为7.2～7.4,TPCK-胰酶含量为1.0μg/ml,病毒接种量为1.0MOI,并在感染48h后补加TPCK-胰酶,培养72h后收获上清与细胞内病毒,血凝滴度可达1:512。结论已获得了无血清微载体培养Vero细胞和H1N1流感病毒的适宜条件,为应用生物反应器大规模制备流感病毒奠定了基础。     

无血清培养MDCK细胞生产狂犬病病毒条件的初步优化

目的开发一种适应于MDCK细胞生长和狂犬病病毒生产的无血清培养基MDCK-SFM,并对MDCK细胞生产狂犬病病毒的条件进行初步优化。方法方瓶培养MDCK细胞,考察混合脂类、微量元素、氢化可的松、酵母抽提物和鱼胨水解物对MDCK细胞生长的影响。转瓶微载体批培养MDCK细胞,以获得细胞在不同培养基中的生长动力学。以不同的感染量(MOI)和感染时间(TOI)接种狂犬病病毒,确定MDCK细胞感染狂犬病病毒的最佳MOI与TOI。比较含10%NCS的DMEM、VP-SFM和MDCK-SFM培养基培养MDCK细胞生产狂犬病病毒的效果。结果混合脂类有利于细胞贴壁,酵母抽提物和鱼胨水解物可不同程度地促进MDCK细胞生长。以MDCK-SFM培养基培养的MDCK细胞最高密度可达14.3×105个/ml。在MOI=0.5、TOI=72h的条件下,可得到最高的病毒滴度。MDCK-SFM培养基培养MDCK细胞生产狂犬病病毒,可获得较高的病毒滴度(5.13lgFFU/ml)。结论MDCK-SFM培养基适于MDCK细胞生长和培养狂犬病病毒,且成本低,成分比较明确,在MDCK细胞高密度培养生产狂犬病疫苗方面具有较高的应用价值。     

生物反应器细胞培养制备人用狂犬病疫苗

目的应用生物反应器培养细胞和病毒,大规模生产人用狂犬病疫苗。方法以巴斯德PV2061为毒种,以143代以内Vero细胞为培养基质,应用生物反应器,每升投放25g微载体,灌流式细胞培养,连续收获病毒液,经浓缩、灭活、纯化,制成Vero细胞狂犬病疫苗。结果细胞培养密度达1.2×107～1.5×107个/ml,病毒感染后可连续收获18～22d,病毒最高滴度8.5LogLD50/ml,平均滴度7.6LogLD50/ml。经柱层析纯化,杂蛋白去除率达99.95%以上,总蛋白含量≤80μg/g,DNA含量≤10pg/0.5ml,GP含量3.5～4.5IU/0.5ml,效力≥4.5IU/0.5ml。结论应用生物反应器细胞培养,可以大规模生产优质Vero细胞人用狂犬病疫苗。     

低血清培养Vero细胞和流感病毒条件的优化

目的优化低血清培养Vero细胞和流感病毒的条件,为开发Vero细胞流感疫苗奠定基础。方法分别在DMEM/F12和SLM-199培养基中,添加不同浓度的血清,培养Vero细胞,观察细胞连续传代的生长状态;接种流感病毒后,检测病毒培养液不同pH值、不同浓度TPCK-胰酶和病毒不同接种量对病毒血凝效价的影响。结果用SLM-199在1.0%血清浓度下培养的Vero细胞接种流感病毒血凝效价较高,病毒培养液pH值为7.2,TPCK-胰酶含量为1.0μg/ml,接种病毒MOI为1.0时,72h收获的病毒血凝效价最高。结论已筛选出低血清培养Vero细胞和流感病毒的适宜条件。     

生物反应器制备Vero细胞乙型脑炎纯化疫苗

目的建立利用生物反应器制备Vero细胞乙型脑炎纯化疫苗的新工艺。方法以Vero细胞作为乙型脑炎病毒增殖的细胞基质,使用微载体Cytodex-Ⅰ在15L生物反应器中进行高密度培养,采用2.5～4.5g/L的载体浓度培养乙型脑炎病毒,制备3批纯化乙型脑炎疫苗并进行检定。结果随着微载体浓度的增加,细胞密度升高。采用2.5～4.5g/L微载体培养的病毒收获液的平均滴度为7.38～7.56lgPFU/ml,收获量最高可达到12～15个有效罐体积。制备的3批疫苗各项质量指标均符合《中国药典》三部(2005版)相关要求。结论已建立了15L生物反应器制备Vero细胞乙型脑炎纯化疫苗的新工艺,为进一步放大生产规模奠定了基础。     

阿维菌素产生菌培养条件的优化

对阿维链霉菌（Streptomyces Avermitilis）3～6的培养条件进行优化。结果表明：斜面培养基成分中酵母粉的产地、斜面种子的培养周期及棉塞的重量对斜面种子的质量及发酵结果的影响程度较大,经分析,得到最适酵母粉为湖北产,最佳培养周期为8d,最适棉塞重量为7g。通过正交实验优化了发酵培养基配方,发酵产量可提高7.35%。此外,还研究了前体物质丙酸钠的添加对发酵结果的影响,结果表明发酵过程中在培养基内加入一定浓度的前体物质丙酸钠,可以显著提高发酵产量,其中发酵24h时在培养基中加入2.5mmol/L的前体物质丙酸钠,发酵产量可提高9.89%。     

Culture Condition of Bone Marrow Stromal Cells Affects Quantity and Quality of the Extracellular Vesicles

Extracellular vesicles (EVs) released by bone marrow stromal cells (BMSCs) have been shown to act as a transporter of bioactive molecules such as RNAs and proteins in the therapeutic actions of BMSCs in various diseases. Although EV therapy holds great promise to be a safer cell-free therapy overcoming issues related to cell therapy, manufacturing processes that offer scalable and reproducible EV production have not been established. Robust and scalable BMSC manufacturing methods have been shown to enhance EV production; however, the effects on EV quality remain less studied. Here, using human BMSCs isolated from nine healthy donors, we examined the effects of high-performance culture media that can rapidly expand BMSCs on EV production and quality in comparison with the conventional culture medium. We found significantly increased EV production from BMSCs cultured in the high-performance media without altering their multipotency and immunophenotypes. RNA sequencing revealed that RNA contents in EVs from high-performance media were significantly reduced with altered profiles of microRNA enriched in those related to cellular growth and proliferation in the pathway analysis. Given that pre-clinical studies at the laboratory scale often use the conventional medium, these findings could account for the discrepancy in outcomes between pre-clinical and clinical studies. Therefore, this study highlights the importance of selecting proper culture conditions for scalable and reproducible EV manufacturing.