人肺癌细胞NHE-1基因片段的克隆及其反义表达载体的构建

构建人肺癌细胞Ｎａ＾＋／Ｈ＾＋交换泵－１（Ｎａ＾＋／Ｈ＾＋ｅｃｘｈａｎｇｅｒ－１，ＮＨＥ－１）基因的反义表达载体，为将来能在体内应用抑制ＮＨＥ－１基因表达的肿瘤治疗奠定基础。方法采用ＰＣＲ技术从人肺癌Ａ５４９细胞基因组中克隆出长为４５４ｂｐ的ＮＨＥ－１基因外显子部分序列，在上、下游引物５’－端带上ＢａｎＨⅠ和ＥｃｏＲⅠ酶切位点。然后将该片段反向插入逆转录病毒载体ＰＬＸＳＮ的多克隆位点。最后对产生的     

人TLR4及MD2基因反义真核表达载体的构建

目的构建人TLR4及MD2基因反义真核表达载体,为研究其在肺炎症反应中的作用奠定基础.方法通过PCR技术扩增出TLR4及MD2基因片段,然后分别反向插入真核表达载体pEFBOS的多克隆位点,最后对产生的重组子进行酶切和测序鉴定.结果扩增出的TLR4目的片段为2.6 kb,MD2为0.5 kb,并成功地连接到pEFBOS载体上,DNA测序结果也显示插入片段为目的片段.结论成功构建人TLR4及MD2基因反义真核表达载体.     

EBV—LMP1反义基因真核表达载体的构建及序列鉴定

目的：构建ＥＢ病毒ＬＰＭ１反义基因的真核表达载体。方法：通过ＰＣＲ方法,扩增ＥＢＶ－ＬＭＰ１基因的第一外显子片段,使之反向克隆到质粒ｐｃＤＮＡ３．１的多克隆位点中。经限制性酶切、ＰＣＲ扩增和测序鉴定重组载体。结果：酶切产物和ＰＣＲ产物的凝胶电泳显示４００ｂｐ左右的目的基因片段,测序结果显示与已知ＬＭＰ１基因序列一致。结论成功构建了ＬＭＰ１反义基因的真核表达载体。     

人肺癌细胞NHE-1基因部分正调控序列的克隆

目的 克隆人肺癌细胞Na∧ /H∧ 交换泵-1（NHE-1）基因上游正调控序列部分,为进一步将该片段导入肺癌细胞株,竞争性结合转录因子,达到抑制细胞内NHE-1基因的表达奠定基础。方法 采用PCR技术从人肺癌A549细胞基因组中扩增长约170bp的NHE-1基因调控序列中起正调控作用的片段。在上、下游引物的5′-端带上BanHI和EcoRI酶切位点。然后将该片段连接到pUC18载体上,最后对产生的重组子进行酶切、PCR和测序鉴定。结果 经酶切及PCR鉴定,所克隆的目的片段大约为180bp,而NDA测序证实克隆并插入到载体中的片段为目的的片段,长度为168bp,与报道的序列比较缺失2个t。结论 本实验已成功地克隆了人肺癌细胞NHE-1基因调控序列中正调控序列片段。     

HSV-tk基因逆转录病毒重组体的构建与DNA序列分析

目的　构建含有单纯疱疹病毒Ⅰ型胸苷激酶 (HSV1 tk)基因的逆转录病毒重组载体pLXSN TK。方法设计一对寡核苷酸引物 ,用PCR方法从质粒pHSV10 6中特异扩增HSV tk基因片段 ( 1168bp) ,分别用BamHI和Eco RI酶切后 ,定向连接到质粒pLXSN中 ,转化宿主菌TG1,分别用上述内切酶 ,PCR和DNA测序鉴定重组质粒。结果　酶切鉴定所切下的片段和PCR扩增的片段大小均与预计相符 ,测序结果与文献报道序列及预计结果一致 ,证实符合表达框架。结论　成功构建了HSV tk嵌合重组质粒pLXSN TK。     

逆转录病毒Pmscv/Hyg介导的RNA干扰表达载体的构建与鉴定

目的构建逆转录病毒Pmscv/Hyg介导的RNA干扰表达载体,并在HEK293细胞株中观察其基因沉默效果。方法PCR方法扩增人U6启动子,下游引入核酸内切酶位点BamHI、SalI,反向插入质粒Pmscv/Hyg的3′端LTR上游。扩增EGFP基因,插入载体Pmscv/Hyg的多克隆位点。合成干扰P53基因表达的寡核苷酸序列,退火复性后插入U6启动子下游BamHI、SalI酶切位点间。重组质粒经酶切、测序鉴定正确后转染病毒包装细胞PT67,产生具有一次感染能力的病毒颗粒。病毒上清感染靶细胞HEK293,经潮霉素筛选,RT-PCR和western blot检测靶基因P53表达情况。结果质粒酶切及DNA测序表明成功构建重组病毒载体,并在PT67细胞中包装成具有一次感染能力的逆转录病毒。经Hygromycin筛选,HEK293细胞中P53蛋白和mRNA表达显著下调。结论成功构建以Pmscv/Hyg为基础的RNA干扰表达载体,重组载体包装出的逆转录病毒可有效介导基因沉默。     

mTOR反义RNA真核表达载体的构建及其在血管平滑肌细胞中的表达

目的：构建哺乳类动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）的反义RNA真核表达载体，观察其对血管平滑肌细胞（VSNC）功能的影响。方法：提取人VSMC总RNA，反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）扩增mTOR基因cDNA序列，经pGEM-T载体克隆后双酶切，将cDNA序列反向插入绿色荧光蛋白表达载体pEGP-C1，构建mTOR基因反义RNA真核表达载体。转染VSMC，采用Western blot法检验反义表达载体对mTOR蛋白表达的影响，流式细胞仪检测细胞周期的变化。结果：经RT-PCR获得664bp产物，T载体克隆后，经DNA测序，确定该片段为mTOR基因cDNA，进而构建反义RNA真核表达载体pEGFP-C1-mTOR，测序证明序列正确后转染VSMC，证实其能够显著抑制mTOR蛋白产物表达，VSMC的分裂、增殖过程受阻。结论：已经成功构建mTOR基因的反义RNA真核表达载体。     

鼠牙乳头细胞核心结合因子cDNA片段的克隆与序列测定

目的 从培养大鼠牙头细胞中克隆核心结合因子（cbfal）的cDNA片段。方法 原代培养大鼠牙乳头细胞,提取培养细胞的总RNA,逆转录合成cDNA,用PCR的方法扩增cbfal基因片段。将获得的预期大小的PCR产物插入pUC18克隆载体中,转化TOP10感受态细胞,蓝白筛选白色克隆,进行体外扩增,提取质粒进行酶切鉴定,含目的插段的克隆在PE317-A自动测序仪上进行序列测定。结果 从培养的鼠牙乳头细胞提取的总RNA中成功克隆出691bp cbfal基因片段,测序结果和GenBank报道序列完全一致。结论 从鼠牙乳头细胞中成功克隆到cbfal基因片段,确切的证实了核心结合因子（cbfal）基因在鼠牙乳头细胞中的表达。     

组织型纤溶酶原激活剂cDNA克隆及其乳腺特异性表达载体的构建

目的：克隆组织型纤溶酶原激活剂(tissue—type plasminogen activator,tPA)基因及构建其乳腺特异性表达载体。方法：以PCR技术克隆2．1kb tPA cDNA片段;应用体外连接技术,连接乳腺特异性表达载体pWA和2.1 kb tPA cDNA片段;转化连接产物,以内切酶酶切、琼脂糖电泳及插入片段序列分析鉴定阳性克隆。结果：琼脂糖电泳显示,2．1 kb tPA cDNA片段克隆成功;内切酶酶切片段与预期片段长度一致;插入片段序列与文献报道一致。结论：tPA基因克隆及其乳腺特异性表达载体构建成功。     

大鼠MeCP2基因HSV-1型反义表达载体的构建与鉴定

目的以真核表达载体单纯疱疹病毒Ⅰ型(Herpes simplex virus type 1,HSV-1)质粒型载体(pHSV)作为表达载体,构建大鼠MeCP2基因反义表达载体.方法用PCR方法扩增出大鼠MeCP2 cDNA部分片段,将其反向插入表达载体pHSV,并以PCR、酶切电泳以及DNA测序等方法对重组质粒进行鉴定.结果经过PCR、酶切电泳以及DNA测序,鉴定出连接方向和插入序列正确的反义表达载体.结论成功构建了大鼠MeCP2基因HSV-1型反义表达载体,为进一步研究该基因的功能打下了基础.     

人胰岛素样生长因子-1真核表达载体的构建及在神经干细胞中的表达

目的:构建人胰岛素样生长因子-1(IGF-1)真核表达载体,并在人脐血神经干细胞(NSCs)中表达。方法:采用RT-PCR法从人胎肝中克隆IGF-1基因,将其导入真核表达载体pcDNA3.1中,用脂质体转染法将重组质粒转染人脐血NSCs。分别采用RT-PCR和免疫荧光细胞化学法检测转基因NSCs中IGF-1mRNA和蛋白的表达。结果:琼脂糖电泳显示RT-PCR扩增出462bp的条带;重组载体pcDNA3.1-IGF-1经HindⅢ与BamHⅠ双酶切后,得到5428bp和462bp的两个条带;目的基因转染的NSCs经RT-PCR扩增出一条与目的基因一致的条带;免疫荧光细胞化学检测到IGF-1蛋白的表达。结论:成功构建了人IGF-1基因的真核表达载体,转染后IGF-1重组蛋白在人脐血NSCs中能成功表达。     

人外周血IL-12 P35 cDNA的巢式PCR扩增、克隆与测序

目的 克隆中国汉族人IL—12P35 cDNA序列，并进行序列测定。方法 利用反转录巢式PCR从健康人外周血总RNA中扩增IL—12P35 cDNA序列，插入T载体PMD—T中，重组质粒转化大肠杆菌JM109，所获克隆经PCR初筛后进行酶切鉴定，阳性克隆进行DNA测序。结果 从健康人外周血总DNA中扩增出约670bp条带，与预期大小相同，PCR与酶切鉴定证明得到PMD／P35阳性克隆，DNA测序证实了插入片段的正确性。结论 在体外成功的扩增、克隆了中国汉族人IL—12P35 cDNA序列。为继续开展IL—12的基础与应用研究奠定了基础。     

BALB/c小鼠H-2Kd胞外段基因 cDNA的克隆及序列测定

目的 克隆小鼠H-2K^d胞外段基因,构建相关表达载体。方法 通过逆转录-聚合酶链反应（RTP-PCR）技术从BALB／c品系小鼠（H-2K^d）脾细胞中扩增出目的基因,构建载体后进行PCR、酶切鉴定及序列测定。结果 克隆基因产物鉴定结果与理论预期值一致,DNA测序完全吻合。结论 该实验克隆H-2K^d基因胞外段成功。     

胰腺癌反义K-ras癌基因片段的分离和克隆

目的：分离及克隆胰腺癌基因组中K—ras基因片段，构建重组反义K—ras癌基因逆转录病毒载体，并探讨其意义。方法：设计2对PCR引物，分别在上下游引物中引进BamHI和EoRI位点，以胰腺癌细胞株BxPC-3基因组DNA为模板扩增K—ras基因外显子1及侧翼序列，并采用重组DNA技术将目的基因插入逆转录病毒载体LZRSpBMN—Z中，并经菌液PCR和限制性内切酶酶切鉴定。结果：K—ras基因外显子1及侧翼序列已成功地克隆入LZRSpBMN—Z中。结论：LZRSpBMN—Z是胰腺癌反义基因治疗中新型候选载体之一。应用PCR方法获取反义K—raS目的基因外显子1方便可行，可用于重组反义K—ras癌基因逆转录病毒载体的构建。     

大鼠金属蛋白酶组织抑制物-1反义基因片段TA克隆载体的构建

目的：构建含大鼠金属蛋白酶组织抑制物-1(tissue inhibitor of metalloproteinase-1，TIMP-1)反义基因片段TA克性载体，为进一步研究TIMP-1在肾组织纤维化中的作用奠定基础。方法：本实验利用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR），从提取的大鼠肾组织总RNA中特异地扩增含313bp的TIMP-1cDNA片段，并将其克隆到TA载体。结果：用限制性内切酶鉴定313bp的TIMP-1cDNA片段插入方向，测序结果证实扩增片段为目的片段。结论：成功地构建了含大鼠TIMP-1反应基因片段TA克隆载体。     

人分泌型内皮抑素质粒的构建及序列测定

目的：旨在获得人内皮抑素(endostatin)分泌型基因片段。方法：合成含信号肽的上游引物，用聚合酶链反应技术克隆人分泌型内皮抑素基因，10g／L琼脂糖凝胶电泳后回收，将其重组入PGEM-T载体，双脱氧末端终止法测定其核苷酸序列。结果：经Genbank分析证实，所获得的645bp基因片段序列属于信号肽及人内皮抑素功能区段基因，翻译为蛋白质序列正确。结论：本研究为应用内皮抑素基因进行肿瘤的抗血管生成治疗奠定了基础。     

癌胚抗原cDNA真核表达重组质粒的构建

目的：将人特异表达的癌胚抗原（ＣＥＡ）－ｃＤＮＡ克隆到逆转录病毒质粒载体ｐＬＸＳＮ中,构建成真核表达重组质粒ｐＬＸＳＮ－ＣＥＡ,为进一步表达表达人ＣＥＡ的动物肿瘤细胞模型作准备。方法：用内切酶ＥｃｏＲＩ酶切质粒ｐＬＸＳＮ及ｐ９１０２３Ｂ－ＣＥＡ－１７,得到线状载体ｐＬＸＳＮ及外源基因ＣＥＡ－ｃＤＮＡ,然后通过连接酶的连接反应将ＣＥＡ－ｃＤＮＡ插入到ｐＬＸＳＮ的ＥｃｏＲＩ位点,用ＥｃｏＲＩ和ＢａｍＨＩ鉴定。结果：成功地将ＣＥＡ－ｃＤＮＡ克隆到ｐＬＸＳＮ中,通过鉴定筛选获得有意义的正向重组质粒ｐＬＸＳＮ－ＣＥＡ。结论：利用基因克隆技术能将人ＣＥＡ－ｃＤＮＡ定向插入逆转录病毒质粒载体中,构建成真核表达重组质粒ｐＬＸＳＮ－ＣＥＡ,为进一步建立ＣＥＡ阳性动物肿瘤细胞模型及研究ＣＥＡ阳性肿瘤的免疫防治奠定了基础。     

人卵透明带重组融合基因及其表达载体的构建

目的构建人卵透明带蛋白3（zona pelludda 3，ZP3）／GST蛋白融合基因原核表达载体。方法利用PCR法扩增出去N端的信号肽和C端的跨膜区huZP3成熟蛋白编码基因。先将其克隆到pGEM-T载体，进行序列测定和分析，然后将huZP3核心DNA片断克隆入GST蛋白融合原核表达载体pGEX4T-1内。结果获得一个核苷酸长度约为1000bp的基因，与GenBank（NCBI：M60504）公布的ZP3基因序列有99％的同源性。DNA序列分析发现。有一个氨基酸出现变异。酶切鉴定后证明ZP3基因完整插入GST融合蛋白原核表达载体pGEX4T-1中。结论成功构建出含ZP3基因的GST融合蛋白原核表达载体。     

大鼠寡霉素敏感相关蛋白的克隆及真核表达载体的构建

目的:克隆大鼠寡霉素敏感相关蛋白(OSCP)的基因并构建pEGFP-N1真核表达载体。方法:采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)从大鼠脑组织中扩增出OSCP基因,将其插入到pTA2克隆载体中,测序鉴定后亚克隆至pEGFP-N1真核表达载体并进行酶切、测序鉴定。结果:PCR扩增出约为700 bp的基因片段;重组克隆载体pTA2-OSCP经测序鉴定证明pTA2载体中插入了目的基因片段;重组表达载体pEGFP-N1-OSCP经酶切、测序鉴定证明其构建成功。结论:OSCP基因克隆和真核表达载体构建成功,这为下一步开展该基因的重组蛋白表达及功能研究奠定了基础。     

人TAT-Survivin融合蛋白原核表达载体的构建

目的:构建人TAT-Survivin融合蛋白原核表达载体。方法:以人胸腺细胞瘤cDNA为模板,采用RT-PCR扩增survivin基因成熟蛋白编码的全部序列,克隆入原核表达载体pET28a(+)中,经限制性内切酶双酶切及DNA序列分析鉴定目的基因。结果:PCR扩增的特异性片段长度为462bp,以此构建的重组质粒pET28a-TAT-survivin,经HindIII和BamHI双酶切后显示5.9kb和462bp左右的两条片段,测序结果与Genbank中的人survivin基因cDNA(Genbank序列号)序列一致。证明人survivin已成功克隆到了原核细胞表达载体pET28a(+)中。结论:成功构建了pET28a-TAT-survivin重组原核表达载体。