β1整合素反义寡核苷酸抑制卵巢癌细胞粘附侵袭的实验研究

目的　观察β1整合素反义寡核苷酸对高侵袭性人卵巢癌细胞系CAOV3粘附侵袭的抑制作用。方法　合成的β1整合素反义寡核苷酸 (asODN)用脂质体转染入CAOV3细胞中 ,通过RT PCR、流式细胞术、MTT法、聚碳酸酯膜侵袭试验测定 β1整合素mRNA和细胞表面β1整合素蛋白表达及癌细胞粘附力、侵袭力的变化。结果　asODN组β1整合素 / β actinmRNA辉度值比值为 (0 .4 4 9± 0 .0 2 9) ,与对照组为 (0 .6 0 8± 0 .0 10 )相比 ,显著下降 (P <0 .0 1) ;流式细胞术检测asODN组平均荧光指数为(2 .4 30± 0 .10 4 ) ,较对照组 (6 .15 6± 0 .0 77)明显下降 (P <0 .0 1) ;asODN组粘附力为 0 .0 86± 0 .0 0 6 ,较对照组 (0 .137± 0 .0 19)显著下降 (P <0 .0 1)。asODN组穿透聚碳酸酯膜的细胞数为 16± 2 ,较对照组 (32± 4 )亦有显著差别 (P <0 .0 1)。而随机序列寡核苷酸 (rODN)组上述各指标较对照组无明显变化。结论　CAOV3细胞 β1整合素的表达与粘附侵袭能力密切相关 ,asODN能有效抑制CAOV3细胞 β1整合素基因的表达 ,从而抑制蛋白质合成 ,降低其粘附侵袭性。     

乙酰肝素酶反义寡核苷酸对人胃癌细胞株SGC 7901表达bFGF的抑制作用

目的探讨乙酰肝素酶反义寡核苷酸对人胃癌细胞株SGC 7901细胞中表达碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)的影响.方法用脂质体介导乙酰肝素酶反义寡核苷酸转染人胃癌细胞株SGC 7901细胞,采用免疫细胞化学观察细胞内bFGF的变化.结果脂质体介导转染乙酰肝素酶反义寡核苷酸前后,SGC 7901胃癌细胞内乙酰肝素酶mRNA积分光密度值(integra optical densit,IOD)分别为256.32±3.21、146.89±2.35、85.36±3.58和63.78±1.42.bFGF阳性表达率转染前72.23%,转染0.2、0.4和0.8μmol/L的AS-ODN后分别为57.15%、51.11%和42.36%.与转染前比较,转染后细胞bFGF表达明显减少,P值分别为0.007、0.003和0.001.结论转染乙酰肝素酶反义寡核苷酸可以有效抑制胃癌细胞bFGF的表达.     

人核糖体蛋白S13(RPS13)编码基因的克隆及其正反义核酸转染胃癌细胞的初步研究

目的：扩增人核糖体蛋白S13（RPS13）编码基因序列，构建其正，反义真核表达载体，分别转染胃癌细胞SGC7901及胃癌耐药细胞SGC7901/VCR，以进一步研究RPS13基因与胃癌多药耐药的关系。方法：采用RT-PCR法扩增RPS13cDNA片段编码区全长序列，利用DNA重组技术的建正，反义真核表达载体，经脂质体介导转染胃癌细胞SGC7901及胃癌耐药细胞SGC7901/VCR，筛选正，反义基因稳定转染细胞，RNA斑点杂交法检测正，反义稳定转染细胞mRNA水平的变化。结果：从高表达RPS13的SGC7901/VCR耐药细胞中提取细胞总RNA，RT-PCR法成功扩增了RPS13cDNA片段编码区全长序列，并经测序证实；目的基因因按正，反两个方向亚克隆至真核表达载体pcDNA3.1( ),并经酶切鉴定证实；经脂质体介导将正义真核表达载体转染SGC7901细胞，反义真核表达载体转染SGC7901/VCR细胞，G418筛选获得稳定转染细胞；RNA斑点杂交试验证实；正义稳定转染细胞RPS13mRNA水平上调，反义稳定转染细胞RPS13mRNA水平下调。结论：成功克隆了人RPS13编码基因序列，并构建了其正，反义真核表达载体，在胃癌细胞系SGC7901及长春新碱耐药细胞SGC7901/VCR中得到稳定转染细胞，正义转染细胞中RPS13mRNA表达明显增加，反义转染细胞中表达明显受抑。     

蛇毒cystatin基因转染抗人胃腺癌细胞体外侵袭作用的研究

目的:探讨蛇毒半胱氨酸蛋白酶抑制剂(sv-cystatin)对人胃腺癌细胞SGC7901侵袭转移的抑制作用.方法:采用人工拼接方法合成蛇毒cystatin cDNA,构建pcDNA3.1/sv-cystatin真核表达质粒,经脂质体转染将pcDNA3.1/sv-cystatin质粒和pcDNA3.1质粒分别导入胃腺癌细胞系SGC7901:利用RT-PCR和Western blot检测SGC7901细胞中sv-cystatin基因的表达;应用细胞-基质粘附实验、细胞运动实验及重建基底膜侵袭实验分析svcystatin表达对SGC7901细胞粘附、运动和侵袭能力的影响.结果:转染sv-cystatin基因后,SGC/sv-cystatin细胞克隆中可检测到sv-cystatin的明显表达,SGC/sv-cystatin细胞的运动能力和体外穿越重建基底膜的能力明显低于转染空载体细胞和未转染的SGC7901细胞,但其体外粘附能力未见明显变化.结论:sv-cystatin基因的表达可使胃癌SGC7901细胞体外运动能力及侵袭能力明显减弱,提示sv-cystatin具有抑制胃癌细胞侵袭转移的作用.     

反义survivin核酸增强胃癌细胞对多西他赛敏感性及其逆转耐药机制的探讨

目的探讨反义survivin核酸(anti-pcDNA3-svv)对胃癌细胞系SGC7901的凋亡诱导和化疗增敏作用,及其与多药耐药基因(mdr-1)的相关性。方法采用电转染法转染胃癌细胞系SGC7901,并筛选阳性克隆。以Western blot法检测survivin蛋白的表达,用透射电镜观察转染后对SGC7901的凋亡诱导作用,RT-PCR检测mdr-1 mRNA的表达,MTT法检测转染细胞对多西他赛的敏感性。诱导SGC7901细胞耐药,检测耐药mdr-1和survivin的表达。结果转染anti-pcDNA3-svv的SGC7901细胞中,survivin蛋白表达较未转染组明显降低;透射电镜下,转染组细胞呈凋亡晚期变化;转染组的mdr-1 mRNA较未转染组明显降低,转染组与未转染组的MDR指数分别为0.196±0.013和3.126±O.019;转染组多西他赛的IC50值为(16.7±1.98)μg/L,而未转染组为(55.7±1.89)μg/L,差异有统计学意义。耐药SGC7901细胞的survivin mRNA表达随着mdr-1 mRNA表达增加而明显增强。结论反义survivin核酸可诱导SGC7901细胞凋亡,增强多西他赛化疗敏感性,其逆转耐药的机制与mdr-1低表达有关。     

反义寡核苷酸对骨肉瘤细胞MTA1基因表达及侵袭性影响的研究

目的:合成人肿瘤转移相关基因(MTAl)的反义脱氧寡核苷酸,观察其转染后对人骨肉瘤MG-63细胞系中MTA1表达及骨肉瘤侵袭性的影响.方法:免疫细胞染色观察人工合成正义、反义及无意义MTA1基因片段转染人骨肉瘤细胞MG-63后,人肿瘤转移相关基因的表达;RT-PCR和蛋白质印迹法检测MTA1基因mRNA和蛋白质表达水平的变化;Boyden小室体外侵袭实验检测转染前后细胞侵袭力的变化.结果:反义寡核苷酸处理骨肉瘤细胞后,MTA1 mRNA的表达下降(吸光度之比为25.09±0.21),与正义链组、无意义链组和空白对照组(35.19±0.17、33.20±0.23和37.17±0.18)相比差异有统计学意义,P<0.05.Boy-den小室体外侵袭实验检测显示,反义寡核苷酸处理后骨肉瘤细胞的透膜能力明显下降.结论:MTA1同骨肉瘤的转移能力密切相关,反义寡核苷酸的转染可阻遏骨肉瘤细胞中MTA1的表达,并因此有可能限制骨肉瘤的侵袭和转移.     

Integrinβ1 asODN-inhibition of Cell Attachment and Invasion of the Human Gastric Cancer Cell Line SGC7901

OBJECTIVE To study the inhibition of adhesion and invasion of SGC7901cells into the ECM by integrinβ1 antisense oligodeoxynucleotide asODN.METHODS asODN and control ODN were transfected into SGC7901 cells using liposomes as vectors. The distribution of the ODN was followed by immunochemistry and changes in the expression of integrinβ1 mRNA and protein were determined by RT-PCR and FCM, respectively. The adhesion and invasion into the ECM were measured by the MTT and Boyden chamber methods, respectively.RESULTS Integrinβ1 asODN which was transfected into SGC7901 cells distributed evenly in the cytoplasm and nucleus. PCR and FCM revealed a weakened band at 489bp and a left-shift curve, respectively. Adhesion and invasion assays showed decreased activity with an inhibition rate of 54% and 76%. The extent of decrease induced by integrinβ1 asODN was larger than that caused by random control ODN (P＜0.001).CONCLUSION Transfection of integrinβ1 asODN into SGC7901 cells induced a decrease in the expression of integrinβ1 mRNA and protein,resulting in a decrease in adhesion and invasion into the ECM, with a greater effect than random control ODN.     

cyclin D1反义寡核苷酸对胃癌细胞生长和G1期调控的影响

目的：研究cyclin D1反义寡核苷酸(ASODN)对胃癌细胞SGC7901和HS746T的生长、细胞周期和G1期调控的影响。方法：采用脂质体Lipofect AMINE2000包裹硫代修饰的cyclin D1 ASODN转染细胞，观察量效曲线和生长曲线，应用RT-PCR检测cyclin D1 mRNA的表达，流式细胞仪检测细胞周期，并用免疫组织化学技术检测胃癌细胞中cyclin D1、p21、p27、pRb蛋白的表达。结果：cyclln D1 ASODN对胃癌细胞产生剂量依赖性的抑制效应，0．2μmol/L cyclin D1 ASODN转染24h能显著抑制胃癌细胞生长，cyclin D1 mRNA表达分别是对照组的26．3％(SGC7901)和17．3％(HS746T)，G0／G1期比例明显增加，并使2种细胞中cyclin D1、pRb表达降低，p21表达升高，在HS746T中p27表达下降，但在SGC7901中p27表达无改变。结论：cyclin D1反义寡核苷酸能有效抑制胃癌细胞的生长，降低cyclin D1 mRNA表达水平，并能影响细胞周期及其调控的表达。     

骨桥蛋白反义寡核苷酸抑制胃癌细胞MKN28粘附侵袭的实验研究

目的：骨桥蛋白（Osteopontin，OPN）是一种分泌型、粘附性的糖基化磷蛋白，许多肿瘤在发生发展过程中均伴有OPN的表达，而表达OPN的肿瘤也更易表现出侵袭、转移的倾向。本研究将观察OPN反义寡核苷酸（antisense oligonucleotide，ASODN）抑制高分化人胃癌细胞株MKN28粘附侵袭的作用。方法：用脂质体将骨桥蛋白ASODN转染胃癌细胞MKN28，实验分3组，对照组、随机序列寡核苷酸（random oligonucleotide，rODN）组和ASODN组。通过荧光定量RT—PCR、免疫组化方法、粘附细胞计数法、穿透小室聚碳酸酯膜侵袭实验分别测定骨桥蛋白mRNA和细胞表面骨桥蛋白的蛋白表达及癌细胞粘附力、侵袭力的变化。结果：转染后ASODN组骨桥蛋白mRNA的相对定量比值较对照组显著降低（1．83±0．10m3．32±0．16，P〈0．05）；免疫组化检测骨桥蛋白表达结果显示，转染后荧光强度明显降低，细胞表面骨桥蛋白表达下降（P〈0．01）；转染后ASODN组粘附力和侵袭力均较对照组显著下降（粘附细胞百分数为20．50±4．58vs41．50±8．40，穿透聚碳酸酯膜细胞数为21．80±6．90vs．42．00±9．40，P均小于0．01）。而rODN组上述各指标较对照组无明显变化。结论：骨桥蛋白的表达与粘附侵袭能力密切相关，反义寡核苷酸能有效抑制胃癌细胞株MKN28细胞骨桥蛋白基因的表达，从而抑制蛋白质的合成，降低其粘附侵袭能力。     

Bmi-1基因RNAi对胃癌细胞SGC7901及AGS作用的初步研究

目的:构建Bmi-1基因的RNAi表达载体,观察其对胃癌细胞SGC7901与AGS增殖、侵袭能力的影响.方法:利用慢病毒表达体系pHelper1.0/pHelper2.0/pGCL-GFP,构建Bmi-1基因的RNAi重组质粒vshRNA-Bmi-1.适时定量PCR和蛋白质印迹法分别检测稳定转染vshRNA-Bmi-1后胃癌细胞中Bmi-1 mRNA及蛋白的表达;MTT法及小室侵袭实验检测胃癌细胞增殖和侵袭能力的变化.结果:稳定转染vshRNA-Bmi-1后SGC7901及AGS细胞Bmi-1 mRNA表达均明显下降,抑制率分别为85%及80%.SGC7901细胞中Bmi-1蛋白表达无明显变化,而在AGS细胞中明显下降.Bmi-1干扰后SGC7901细胞的生长及侵袭能力无明显变化,而AGS细胞增殖减慢、侵袭能力减弱.结论:成功构建Bmi-1基因的RNAi表达载体,vshRNA-Bmi-1重组质粒明显下调Bmi-1 mRNA 在胃癌细胞SGC7901和AGS中的表达.Bmi-1基因的RNAi能抑制胃癌细胞AGS的增殖和侵袭能力.     

ets-1基因的反义寡核苷酸治疗胃癌的研究

目的：研究ets1反义寡核苷酸对胃癌的治疗作用及其机制。方法：应用ets1反义、正义寡核苷酸转染SGC7901细胞，并设PBS对照组。转染后应用逆转录聚合酶链式反应检测ets1mRNA的变化，克隆形成试验检测细胞增殖活性的变化，Transwell小室检测癌细胞体外侵袭力的变化，并应用裸鼠胃癌皮下转移模型观察对体内侵袭力的影响。结果：转染ets1反义寡核苷酸后，ets1mRNA表达降低，形成克隆数目较正义组、对照组明显减少（24.2±4.8 vs 47.6±8.1 vs 44.3±7.6，P<0.01），穿过小室滤膜细胞数目明显减少（97.1±11.1 vs 198.7±18.3，205.8±22.2，P<0.01），裸鼠胃癌生长明显受到抑制。结论： ets1反义寡核苷酸对胃癌有治疗作用，其机制可能与降低胃癌细胞体内外侵袭力有关。     

沉默MTA1表达对胃癌SGC7901细胞增殖和侵袭能力的影响

目的:观察转移相关基因1（MTA1）基因沉默对人胃癌细胞SGC7901增殖和迁移侵袭能力的影响,探讨 MTA1基因在胃癌发生发展中的作用。方法:利用脂质体法将靶向MTA1的小分子干扰 RNA（siRNA） 转染到胃癌细胞株 SGC7901中。运用Real time PCR 和Western blot 技术检测SGC7901细胞内MTA1的 mRNA和蛋白表达水平。CCK-8法检测细胞增殖能力,Transwell小室实验观察细胞迁移和侵袭能力。结果:MTA1 siRNA 可有效抑制SGC7901细胞MTA1基因在 mRNA 和蛋白水平上的表达（P﹤0.01）。CCK-8实验表明MTA1 siRNA 转染后细胞增殖不受影响;Transwell小室实验表明细胞迁移和侵袭能力明显下降。结论:沉默MTA1表达可抑制胃癌细胞株 SGC7901迁移和侵袭,而不影响细胞增殖。MTA1在胃癌侵袭转移过程中可能发挥重要作用。     

miR-200a通过β-catenin/TCF-4信号通路抑制胃癌细胞系生长侵袭能力的体外研究

  目的  研究miR-200a通过β-catenin/TCF-4信号通路对SGC7901胃癌细胞增殖活性及侵袭迁移能力的影响。  方法  化学合成miR-200a mimics, 采用脂质体Lipofectamine 2000转染胃腺癌细胞SGC7901, qRT-PCR检测转染效果, 细胞免疫荧光、Western blot检测转染后目的蛋白的表达, TOP/FOP荧光素酶检测β-catenin/TCF-4活性, Transwell、划痕实验检测细胞迁移侵袭能力、MTT法检测细胞的增殖活性, 流式细胞术检测细胞周期分布的改变。  结果  脂质体介导的miR-200amimics转染SGC7901后, β-catenin/TCF-4蛋白的表达均降低, β-catenin的表达出现了细胞核向胞浆的转移。TOP荧光素酶活性下降2.27倍, 而FOP荧光素酶活性基本不变。转染miR-200amimics组细胞的增殖活性、迁移、侵袭能力比空白组和阴性对照组明显下降, 细胞周期出现G₀/G₁期阻滞。  结论  提高miR-200a表达可以降低β-catenin/TCF-4信号通路的活性, 抑制SGC7901的生长侵袭迁移能力。      

乙酰肝素酶反义硫代寡核苷酸对人肝癌细胞珠BEL-7402侵袭力的影响

目的:探讨乙酰肝素酶(Hpa)反义硫代寡脱氧核苷酸(AS-ODN)对人肝癌细胞BEL-7402侵袭力的影响。方法:设计合成互补于HpamRNA起始密码区的AS-ODN,以阳离子脂质体Oligofectami-neTMReagent包埋后转染BEL-7402细胞。采用RT-PCR和Western-blot检测不同浓度AS-ODN转染后细胞HpamRNA及蛋白表达的变化,以基底膜重建实验检测细胞侵袭力的变化。结果:0、100、200和300nmol/LAS-ODN转染组BEL-7402细胞HpamRNA的表达量分别为0·911、0·898、0·774和0·280;Hpa65×103蛋白表达量分别为0·923、0·875、0·834和0·237;Hpa50×103蛋白表达量分别为1·872、1·919、0·821和0·325。300nmol/LAS-ODN转染后BEL-7402细胞HpamRNA和蛋白的表达明显下降;0、100、200和300nmol/LAS-ODN转染组侵袭细胞数分别为137±15、141±13、134±18和49±7,300nmol/L,AS-ODN转染组侵袭细胞数较正常对照组明显减少,P=0·000。结论:一定浓度的HpaAS-ODN可通过下调HpamR-NA和蛋白的表达抑制肝癌细胞的侵袭力。     

基质金属蛋白酶-9反义寡核苷酸对卵巢癌细胞侵袭黏附能力的影响

目的 观察基质金属蛋白酶-9（MMP-9）反义寡核苷酸（ASODN）转染对卵巢癌细胞体外侵袭黏附行为的影响,并探讨其作用机制。方法 以Lipofectinmin介导的MMP-9反义寡核苷酸转染至经纤黏连蛋白诱导MMP-9表达的卵巢癌细胞株HO-8910PM,利用RT—PCR、Western blot及明胶酶谱法检测转染寡核苷酸后HO-8910PM细胞MMPO的mRNA、蛋白表达及酶活性的变化;通过细胞体外侵袭、迁移实验和黏附实验,检测细胞侵袭黏附能力的变化。结果 卵巢癌细胞HO-8910PM转染MMP-9反义寡核苷酸后,MMP-9的mRNA及蛋白的表达受到抑制,抑制率分别为34．8％和42．5％,与对照组比较,差异有统计学意义（P〈0．05）;明胶酶活性也受到了抑制。反义寡核苷酸的转染降低了肿瘤细胞体外侵袭、迁移和黏附能力,侵袭和迁移抑制率分别为22．4％和24．8％,在60min和90min黏附抑制率分别为49．8％和38．3％。结论 MMP-9反义寡核苷酸可抑制卵巢癌细胞的侵袭黏附能力,MMP-9有可能成为抗卵巢癌侵袭转移的分子靶点。     

反义MUC2体外抑制胃癌细胞侵袭活性的研究

目的：探讨应用反义脱氧寡核苷酸（ASODN）体外抑制粘蛋白MUC2对人胃癌细胞株SGC7901侵袭活性的影响。方法：采用人工合成MUC2ASODN经阳离子脂质体包裹后转染入胃癌细胞株SGC7901中,应用免疫组化及Boyden小室体外侵袭实验比较转染前后癌细胞侵袭能力的改变。结果：转染MUC2ASODN后,癌细胞穿膜细胞相对百分率较处理前明显下降;免疫组化S-P法染色提示转染MUC2ASODN后,SGC7901细胞的组织蛋白酶D及基质金属蛋白酶2表达水平明显降低。结论：使用人工合成MUC2ASODN能有效抑制胃癌细胞侵袭能力。     

MALAT -1对胃癌细胞系 SGC7901侵袭和迁移能力的影响

目的:探讨MALAT-1对胃癌细胞系SGC7901侵袭和迁移能力的影响。方法:用实时定量聚合酶链反应(RT-PCR)的方法在mRNA水平测定MALAT-1在20对胃癌组织及癌旁正常组织的表达,以及在GES和SGC7901细胞中的表达。RNA干扰(RNAi)技术下调胃癌细胞系SGC7901中MALAT-1的表达后,以高内涵细胞运动试验检测其运动能力,Transwell实验检测其侵袭和迁移能力。结果:RT-PCR结果显示MALAT-1在胃癌组织中的表达高于癌旁正常组织;相比GES,MALAT-1在SGC7901中的表达升高。下调MALAT-1在SGC7901中的表达后,高内涵细胞运动试验和Transwell实验结果显示SGC7901的运动、侵袭和迁移能力均明显减弱。结论:MALAT-1能够促进胃癌细胞SGC7901的侵袭和迁移能力。     

下调CACNA2D1对胃癌耐药细胞系SGC7901/ADR药物敏感性的影响

目的:探讨下调CACNA2D1对胃癌耐药性细胞系SGC7901/ADR耐药的影响。方法:采用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)的方法检测16对胃癌及癌旁组织以及胃癌细胞系SGC7901和SGC7901/ADR中的CACNA2D1 的mRNA表达水平;蛋白免疫印迹技术（Western blot）检测CACNA2D1的蛋白表达情况;MTT法检测SGC7901、SGC7901/ADR及转染CACNA2D1 siRNA后SGC7901/ADR的IC50值;流式细胞仪检测细胞凋亡。结果:qRT-PCR结果显示:CACNA2D1在胃癌组织中的表达明显高于癌旁组织(P＜0.01);CACNA2D1在耐药细胞系SGC7901/ADR中的表达明显高于其亲本细胞系SGC7901(P＜0.01)。蛋白免疫印迹技术结果显示相对于转染CACNA2D1 negative control（NC）组,转染CACNA2D1 siRNA组的胃癌细胞CACNA2D1表达降低;MTT结果显示细胞系SGC7901与SGC7901/ADR的阿霉素半数抑制浓度（IC50）分别为（1.3±0.6）μg/ml与（5.5±0.45）μg/ml;SGC7901/ADR转染CACNA2D1 siRNA后对阿霉素的IC50明显下降。流式细胞术检测凋亡结果显示,CACNA2D1的表达下调后,SGC7901/ADR细胞的凋亡比明显增加。 结论:CACNA2D1能够促进胃癌SGC7901/ADR细胞系产生多药耐药。     

siRNA沉默Snail基因对胃癌SGC7901细胞株增殖及侵袭能力的影响

目的探讨转录因子Snail在胃癌SGC7901细胞株增殖及侵袭转移过程中的作用,为胃癌的基因治疗提供有效靶点。方法化学合成针对Snail的靶向siRNA,同时以转染阴性对照siRNA、转染脂质体转染试剂和空白细胞作为对照。RT-PCR检测转染效率,MTT检测Snail siRNA对SGC7901细胞增殖能力的影响,Boyden chamber检测Snail siRNA对SGC7901细胞侵袭能力的影响。结果与各对照组相比,转染SnailsiRNA组SGC7901细胞Snail mRNA的表达下降,且随转染时间延长,Snail mRNA的表达下降明显(P<0.05)。MTT结果显示转染Snail siRNA组SGC7901细胞在转染后48、72 h较对照组增殖能力明显下降(P<0.05);Boyden chamber结果显示转染Snail siRNA组SGC7901细胞在转染后48、72 h较对照组穿膜细胞数明显下降(P<0.05);转染Snail siRNA组各时间点之间增殖能力和侵袭转移能力的差异也有统计学意义(P<0.05)。结论转录因子Snail在胃癌的发生、发展及侵袭转移中发挥重要作用,可作为胃癌基因治疗的有效靶点。