耐碱锰超氧化物歧化酶基因(Mn-sodA)工程菌的构建及其表达条件

从Bacillus sp.110-2基因组上分离得到的耐碱锰超氧化物歧化酶基因(Mn-sodA),将其连接到原核表达载体pET-30a(+),得到重组载体pET-sodA,重组载体在大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导得到表达.SDS-PAGE分析显示,融合表达产物的分子量大小为26.5 kD.对含有sodA基因工程菌的表达情况研究表明,重组蛋白全部以可溶性形式存在;重组酶的比活力252 U/mg,为原始菌株的2.1倍,目的基因在大肠杆菌中实现了高效表达;而且,重组酶还保留了野生型酶强的耐碱能力.BL21(pET-sodA)基因工程菌的构建提供了一种可利用的耐碱蛋白资源,同时探索了一种极端酶的生产方法.     

蜡样芽孢杆菌M22锰超氧化物歧化酶基因在毕赤酵母中的表达

实验成功地构建了毕赤酵母（Pichia pastoris）表达质粒pPICZA—Mn—sod,质粒线性化后通过电激法导入毕赤酵母GSl15，抗生素zeocin抗性梯度筛选得到高拷贝重组菌株。PCR鉴定及Mut^＋表型分析表明，目标基因已经重组到宿主基因组染色体上；0．5％甲醇诱导表达后，SDS—PAGE结果显示，表达蛋白的相对分子量约为23kD，活性电泳出现明显活性条带；酶活性测定显示，重组菌株SOD活性比对照提高5倍左右；氯仿-乙醇（3：5／V：V）和KCN（5mmol／L）抑制反应进一步证明，所表达的SOD为锰超氧化物歧化酶C。来源于蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）M22的Mn—sod基因在毕赤酵母中得到正确表达。为研究该酶的生理功能提供了必要的物质条件。     

杨梅铜锌超氧化物歧化酶基因（MrCu／Zn-SOD1）的原核表达及活性鉴定

为获得高表达杨梅（Morellarubra）铜锌超氧化物歧化酶（MrCu／Zn-SOD1）的工程菌,本实验采用RT-PCR技术从杨梅果实中分离扩增了MrCu／Zn．SOD1的cDNA序列（456bp）,将该基因重组到原核表达载体pGEX-2T中,酶切、测序分析表明,重组质粒pGEX-MrCu/Zn-SOD1结构正确。重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）进行诱导表达。IPTG诱导表达分子量约41kD融合蛋白GST．MrCu／Zn．SOD1。诱导表达后的菌体超声裂解液经谷胱甘肽亲和层析纯化,得到高纯度的GST—MrCu／Zn—SOD1。采用氯化硝基四氮唑蓝法和黄嘌呤氧化法分析其活性。结果表明,GST-MrCu／Zn-SOD1具有特异性SOD酶活性。     

小麦生理型与遗传型雄性不育相关基因锰超氧化物歧化酶(Mn-SOD)及果糖1,6-二磷酸醛缩酶(FBA)的表达分析

锰超氧化物歧化酶(Mn-SOD)是一种重要的抗氧化剂,果糖1,6-二磷酸醛缩酶(FBA)是叶绿体光合碳化阶段起重要调节作用的关键酶.本研究以小麦(Triticum aestivum L.)生理型与遗传型等基因雄性不育系及其对应育性正常的保持系为材料,选取花粉小孢子发育各时期的花药及三核期子房,对供试材料花药全蛋白表达差异研究的基础上,对雄性不育相关基因(Mn-SOD)及FBA进行核酸水平的实时荧光定量PCR分析,结果发现,与可育保持系相比,(1)生理型雄性不育系Mn-SOD基因在幼穗期、单核期和三核期表达量显著下调,而酶活力在幼穗期上调,在单核期下调;遗传型雄性不育系Mn-SOD基因在幼穗期和单核期表达量下调,酶活力在幼穗期上调,在二核期下调.(2)生理型雄性不育系和遗传型雄性不育系FBA基因表达量在幼穗期和单核期均下调,而对应同时期的FBA酶活力也下调,而遗传型不育系FBA基因在三核期表达量和FBA酶活力均上调.(3)Mn-SOD和FBA在遗传型雄性不育系三核期子房和花药中表达量均高于生理型雄性不育系和正常可育系,而在生理型雄性不育系花药中,Mn-SOD表达量明显低于对照可育系,在子房中其表达量略高于正常可育系.基因表达具有组织特异性,其蛋白表达较基因表达具有一定滞后性.Mn-SOD基因过量表达(单核至二核期),从而清除花药代谢紊乱产生的过多的活性氧,维持细胞正常功能;而花粉败育(生理型和遗传型雄性不育)导致花药失去活力,从而使花药叶绿体光合能力下降,FBA下调表达.研究结果提示,不同发育时期FBA及Mn-SOD酶活力变化与基因表达水平相一致,且这两个指标的变化直接或间接的影响了小麦花药的育性程度.     

锰超氧化物歧化酶（Mn-SOD）基因的分子改造及在毕赤酵母中的表达

根据毕赤酵母（Pichia pastoris）的密码子偏好性,以不改变氨基酸序列为原则,对源于蜡样芽孢杆菌M22（Bacillus cerues M22）的Mn-SOD基因进行分子改造,设计、合成新的基因序列Mn-SOD-2。构建酵母表达载体pPICZαA/Mn-SOD-2,并整合至毕赤酵母GS115染色体。结果表明,所构建的酵母工程菌株YM103,经0.5%甲醇诱导表达后,Native-PAGE检测证实有清晰活性条带;SDS-PAGE检测证实重组蛋白的分子量为24kD,与预期大小一致。酶活分析表明,外源蛋白的活性较改造前增加了2.2倍,且表达稳定性良好。     

蜡样芽胞杆菌M22Mn-SOD基因的分子改造及在毕赤酵母中的表达

根据毕赤酵母(Pichia pastons)密码子的偏好性,以氨基酸序列不变为原则,对源于蜡样芽胞杆菌(Bacillus cernes)M22的Mn-SOD基因进行分子改造,设计、合成了新的基因序列Mn-SOD-2.构建酵母表达载体pPICZαA/Mn-SOD-2,并整合至毕赤酵母GS115染色体.结果表明,所构建的重组体经0.5%甲醇诱导表达后,Native-PAGE检测证实有清晰单一活性条带;SDS-PAGE检测证实重组蛋白的分子量24 kD.酶活分析表明,外源蛋白的活性较改造前增加了2.2倍,且表达稳定性良好.     

蜡样芽胞杆菌905铜锌超氧化物歧化酶基因的克隆及原核表达

蜡样芽孢杆菌905（Bacillus cereus 905）是从小麦体内分离获得的一株植物有益内生细菌。为从氧自由基毒性角度分析该细菌在植物体内的定殖机制,本研究利用PCR方法得到了B. cereus 905的CuZn-SOD基因全长（sodC）。该基因由537 bp组成,编码179个氨基酸残基。构建表达载体pET-22b-sodC,转化Escherichia coli BL21(DE3),IPTG诱导表达结果表明：该基因表达出的蛋白表现出SOD功能,化学抑制法验证其为CuZn-SOD。     

人乙醛脱氢酶2的原核表达及其条件优化

为实现人乙醛脱氢酶2（ALDH2）基因在原核生物中高效表达,将含有6×His标签和SUMO融合蛋白标签的人乙醛脱氢酶2基因的表达载体转化至宿主菌BL21（DE3）中。在异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导下,目的基因在大肠杆菌内高效表达。通过对表达条件的优化,37℃使用终浓度0.3mmol/L的IPTG诱导3h,重组大肠杆菌的表达量可占全菌蛋白的16%。SUMO融合蛋白标签的加入以及较低的诱导温度（16℃）有利于提高人乙醛脱氢酶2基因在大肠杆菌内的可溶性表达。     

牛nanog基原核表达载体构建及其在大肠杆菌中的表达

从6周龄的胎牛(Bos taurus)原始生殖嵴中提取总RNA,通过RT-PCR扩增nanog基因,将其克隆到PMD-18T载体,然后再亚克隆到pGEX-KG表达载体上,获得原核表达质粒pGEx-KG-nanog,限制性内切酶分析和DNA测序证明所插入片段为牛nanog基因编码序列.重组质粒转化大肠杆菌JM109(Escherichia coli),在不同的培养温度(25、30和37℃)和不同浓度的IPTG(0.10、0.25、0.50、1.00和2.00mmol/L)诱导下均获得了表达,结果表明,培养温度和IPTG浓度对GST-Nanog融合蛋白在大肠杆菌中的表达影响甚微;经Western blot检测证实该蛋白约60kD,并具有GST抗原活性,证实目的蛋白为Nanog蛋白.     

牛nanog基因原核表达载体构建及其在大肠杆菌中的表达

从6周龄的胎牛（Bos taurus）原始生殖嵴中提取总RNA,通过RT-PCR扩增nanog基因,将其克隆到PMD-18T载体,然后再亚克隆到pGEX-KG表达载体上,获得原核表达质粒pGEX-KG-nanog,限制性内切酶分析和DNA测序证明所插入片段为牛nanDg基因编码序列。重组质粒转化大肠杆菌JM109（Escherichia coli）,在不同的培养温度（25、30和37℃）和不同浓度的IPTG（0．10、0．25、0．50、1．00和2．00mmol／L）诱导下均获得了表达,结果表明,培养温度和IPTG浓度对GST-Nanog融合蛋白在大肠杆菌中的表达影响甚微;经Western blot检测证实该蛋白约60kD,并具有GST抗原活性,证实目的蛋白为Nanog蛋白。     

代谢木糖的重组工业酿酒酵母构建及其乙醇发酵

为了使工业酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)能直接利用木糖发酵乙醇,本研究设计带有 kanMX和ura两种不同筛选标记的强启动子TPI的载体,并将启动子插入木酮糖激酶(xylulokinase gene,XKS1)及非氧化磷酸戊糖途径(pentose phosphate pathway, PPP)关键基因之前,并构建木糖异构酶基因(xylose isomerase gene,XylA)表达载体pYES2-FBA-xylA,将该载体转入XKS1及PPP关键基因增强表达的重组菌株,XylA在工业酿酒酵母里成功表达,其活性为0.39 U/mg蛋白.qRT-PCR结果显示,XKS1及PPP四个关键基因TAL、RPE、RKI和TKL分别比出发菌株表达量提高4.08、1.62、3.98、17.36和4.17倍.重组菌株葡萄糖和木糖共发酵,重组菌株木糖代谢比原始菌株提高17.64％;研究结果表明,通过增强木糖代谢流关键基因的表达以及XI的表达,使工业酿酒酵母获得直接代谢木糖能力,这为工业酿酒酵母生产纤维素乙醇提供参考.     

表达猪源链球菌类M-MRP融合蛋白基因工程菌的构建及免疫保护试验

利用PCR技术,分别扩增马链球菌兽疫亚种(Streptococcusequisubsp.zooepidemicus)ATCC35246株类Mszp基因583￣1063位碱基和猪链球菌(S.suis)2型HA9801株mrp基因298￣827位碱基的片段。通过在类M基因片段的3!端和mrp基因片段的5!端引物添加共同的SacⅠ酶切位点,利用T4连接酶连接,克隆至pET-32a( )载体。将重组质粒转化大肠杆菌(Escherichiacoli)BL21,经IPTG诱导,可获得分子量约为60kD的融合蛋白。通过MRP和类M蛋白的多克隆抗体进行ELISA反应和免疫印迹分析表明:表达的融合蛋白同时具有类M蛋白和MRP的抗原性。用组氨酸亲和层析柱纯化的重组融合蛋白,和链球菌的全菌二联灭活疫苗分别免疫两组仔猪,重组蛋白的免疫保护率达60"。     

重组球孢白僵菌表达目标产物类枯草杆菌蛋白酶的发酵特性研究

采用单因子筛选和正交试验,研究了碳源、氮源、微量元素及无机盐等营养成分对重组球孢白僵菌(Beauveria bassiana)菌株Bb0062-15-4-CDEP-1产生目标产物类枯草杆菌蛋白酶CDEP-1的影响,并通过摇瓶发酵和30 L发酵罐发酵对其发酵特性进行了研究.结果表明,其优化发酵培养基为2.0%玉米粉,1.0%麦麸,0.25%豆粕粉,0.4%NaNO3,0.1%MgSO4·7H2O.摇瓶发酵结果表明,在对数生长期,随着菌体生物量的增加,CDEP-1产量上升,二者呈一定的平行关系;当菌体生长到稳定期,CDEP-1产量继续上升,并达到产酶高峰;此后,随着菌体生长的衰退,CDEP-1产量出现快速下降趋势.扩大培养时,30 L发酵罐中60 h产酶量最高,比摇瓶培养(168 h)缩短了108 h,单位体积的产酶量比摇瓶培养提高80%.结果对研究和利用该球孢白僵菌重组菌株的代谢产物,提高真菌杀虫剂的杀虫效果奠定了基础.     

肠毒素性大肠杆菌mSTⅠ-linker-LTB融合蛋白基因工程菌的构建及免疫保护试验

用分子生物学方法拼接成肠毒素性大肠杆菌(ETEC)mSTⅠ-linker-LTB融合基因，并定向克隆到pET32a(+)中，转化宿主菌BL21（DE3）。重组菌经1mM IPTG诱导，在30℃下，5h时表达产物（分子量约为37KD）达到高峰，表达量约占菌体总蛋白30%。表达产物主要存在包涵体中，经Western blot鉴定呈阳性。乳鼠胃内接种试验证明,融合蛋白无野生型STⅠ的生物毒性。将融合蛋白与矿物油乳化后免疫ICR小鼠，对K88、K99、987P和F41的保护率分别为83.3%、100%、66.7%和66.7%。     

睾丸酮丛毛单胞菌工程菌构建及稳定性分析

本研究根据同源重组原理,利用电穿孔法将重组质粒pKtac1-act1和pKtac1-act2分别转化睾丸酮丛毛单胞菌（Comamonas testosteroni）,经PCR和Southern blot筛选获得2株睾丸酮丛毛单胞菌基因工程菌。对这两株基因工程菌的关键酶3α-羟基类固醇脱氢酶/碳酰基还原酶（3α-hydroxysteroid dehydrogenase/carbonyl reductase,3α-HSD/CR）表达情况和细菌稳定性的分析结果表明：两株基因工程菌在没有诱导剂诱导的情况下,其3α-HSD/CR的表达量比原始菌提高了近20倍。添加抗生素进行培养,两株工程菌的activator和3α-HSD/CR表达均较稳定;而在不添加抗生素的培养基上培养时,两株工程菌的activator和3α-HSD/CR的表达变化较大,蛋白总体表达水平比添加抗生素时低。研究结果可以初步推断,3α-HSD/CR的表达受activator基因的表达调控。     

普鲁兰酶产生菌的诱变选育及其发酵工艺的优化

为了提高普鲁兰酶产酶酶活,以GX-6为出发菌株,采用低能离子束修饰技术对其进行诱变,并通过响应面法优化其发酵培养基。结果表明,最佳离子束诱变参数为:注入能量10 keV、诱变剂量1×10¹⁵ ions·cm^-2、诱变时间38 s,此条件下菌株正突变率比负突变率高,利用离子束诱变技术反复诱变,最终获得一株普鲁兰酶酶活较高且遗传性稳定的突变菌株GX-6-2,其酶活为2.13 U·mL^-1,较出发菌株酶活(0.65 U·mL^-1)提高了2.28倍。由Plackett-Burmen试验分析得到影响普鲁兰酶酶活的3个显著因素分别是玉米淀粉、麦芽糖和吐温-80。通过响应面试验得到最佳发酵培养参数为:玉米淀粉56.5 g·L^-1、麦芽糖11.5 g·L^-1、吐温-80 1.0 mL·L^-1、黄豆饼粉 25 g·L^-1、pH值7.0、发酵温度37℃、接种量3%、发酵时间24 h、装液量50 mL、转速180 r·min^-1,此条件下诱变菌株的酶活为2.57 U·mL^-1,较出发菌株酶活提高了2.95倍。对突变菌株的发酵特性进行初步研究发现,发酵培养24 h时,突变菌株酶活达到2.67 U·mL^-1,较出发菌株提高了3.11倍。本研究结果为利用低能离子束修饰技术诱变选育普鲁兰酶产生菌提供了一定的理论参考。     

一株耐盐解磷真菌的筛选、鉴定及其发酵优化

从黄河三角洲盐碱土壤中分离到一株真菌PSF2,该菌具有极强的溶磷能力,在改良孟金娜液体培养基中培养72 h,发酵液中的可溶性磷含量高达1042.0 mg L-1,且兼具耐盐特性,最高可以耐受12.5%的盐浓度。经形态观察及ITS序列分析,初步确定该菌株为草酸青霉(Penicillium oxalicum),Gen Bank登录号为KJ957935。在单因素试验基础上,采用正交试验设计对菌株PSF2的发酵条件进行了优化,结果表明菌株PSF2的最佳培养基组成是蔗糖15 g L-1、尿素0.14 g L-1、Na Cl 3.0%,p H 9.0。进一步研究表明,在含盐量0.45%的土壤中添加PSF2,培养20 d,土壤中有效磷含量可增加20.9%。     

串联抑制素基因克隆与重组质粒的构建

根据GenBank中报道的猪抑制素基因序列设计两对引物，克隆含有抑制素抗原决定簇基因片段α(1～32)的p1INH和p2INH，在这两个片段中都设有限制性内切酶XbaⅠ的酶切位点，通过XbaⅠ把p1INH与p2INH串联起来。串联抑制素基因片段与pcDNA3.1载体通过EcoRⅠ、HindⅢ酶切位点连接后经过转化DH5α感受态细菌构建重组载体。以重组载体作为模板，以含有EcoRⅠ、HindⅢ酶切位点的引物PCR，产物经验证为含串联的抑制素基因。串联的抑制素基因产生的融合蛋白具有抑制素的免疫原性，也不会与体内其他蛋白发生免疫交叉反应。串联后的基因片段在单位体积内的抗原位点数增多，免疫效果也会加强。可以反馈性地抑制FSH的分泌，提高母畜的排卵数，提高产仔数。