星形神经胶质细胞对PC12神经元突起生长发育的影响

背景：星形细胞对神经元有提供营养、支持及调节突触活性作用，但它对神经元发育的影响还尚不清楚。目的：探讨体外培养的Sprague Dawley大鼠大脑皮质星形细胞对：PC12神经元突起生长发育的作用。设计：完全随机设计，对照实验研究。方法：以培养的星形细胞与PC12神经元按不同细胞数目比例(50：1～1：1)共同培养，并用其制备的条件培养液培养PC12细胞。主要观察指标：用快速灵敏的MTT比色法测定PC12神经元的细胞活力，用光学相差显微镜观察PC12细胞形态学变化。结果：①星形细胞条件培养液可增强PC12细胞活力(MTT测定的A值由0．255&;#177;0．012提高到0．510&;#177;0．036，P&;lt;0．001)，却不能促使：PC12神经元突起的生出。②当将星形细胞与PC12细胞按30：1～1：1的比例共同培养时，既可提高PC12细胞折光性和光晕又可促使其突起的生长；但按50：1～40：1的比例共同培养时，只观察到提高PC12细胞折光性和光晕，而无促使其突起生长发育的作用。结论：PC12神经元细胞活力的提高与星形细胞分泌到条件培养液中的可溶性因子有关，而PC12神经元突起生长发育可能是和与星形细胞的直接接触以及二者的细胞数目比有关。     

骨髓基质细胞条件液对PC12细胞生长与分化的影响

目的：观察骨髓基质细胞条件液对PC12细胞生长与分化的影响，分析其能否保护PC12细胞免受鱼藤酮的毒性作用。 方法：实验于2005-11／2006—04在河北省脑老化与认知神经科学重点实验室完成，PC12细胞来源于大鼠嗜铬细胞瘤。①条件液对PC12细胞增殖影响和对毒物鱼藤酮的抵抗作用：PC12细胞按实验对照原则分为对照组、条件液组，分别经正常培养液和骨髓基质细胞培养制备的条件液培养。两组分别加入鱼藤酮，浓度为0和10μmol／L，作用72h，MTT法检测细胞活性。细胞存活率=鱼藤酮孔吸光度值／对照孔吸光度值&;#215;100％。②条件液对PC12细胞的诱导分化作用：分别于接种第3，7，10天于倒置显微镜下观察细胞分化情况和突起生长情况。计数10-20个视野，按突起细胞数、3个或3个以上突起细胞数、突起长度大于2倍胞体细胞数占细胞总数的百分率3个指标对条件液组和对照组进行比较。 结果：①条件液对PC12细胞增殖的影响及对毒物鱼藤酮的抵抗作用：经鱼藤酮作用后条件液组细胞存活率显著低于对照组[（64．45&;#177;1．60）％，（78．86&;#177;4．95）％（t=6．783，P〈0．01）1。用条件液培养PC12细胞72h，条件液组与对照组的细胞存活率相比差异无显著性意义[（118．1&;#177;3．28）％，（121．3&;#177;10．54）％（P〉0．05）1。②条件液对PC12细胞的诱导分化作用：条件液作用3d，细胞开始长出突起，但与对照组无差别。至第7天，有突起细胞数、突起大于2倍胞体直径的细胞数及有3个以上突起舶细胞数均增多，占总细胞数的百分率与对照组比较差异均具有显著性意义（P〈0．05-0．01）。培养至第10天，长度大于2倍胞体直径的细胞数占总细胞数的百分率与对照组比较差异也有显著性意义（P〈0．01）。 结论：骨髓基质细胞条件液可诱导PC12细胞分化为神经元样细胞，但对其增殖及鱼藤酮所致氧化损伤均无明显作用。骨髓基质细胞的这种诱导作用可能由其分泌到细胞外的可溶性分子介导。     

星形胶质细胞条件培养液体外诱导胎鼠室管膜前下区神经干细胞向多巴胺能神经元的分化

背景:在神经干细胞移植治疗神经系统退行性变及修复神经系统功能损伤过程中,有效的神经干细胞体外增殖与多巴胺能神经元的定向诱导分化尤为关键.目的:以星形胶质细胞条件培养液为诱导剂,观察胎鼠室管膜前下区神经干细胞体外向多巴胺能神经元的分化.设计、时间及地点:细胞学体外对照观察,于2006-12/2007-08在解放军第三军医大学新桥医院实验中心完成.材料:清洁级新生2d龄KM小鼠15只,孕16d Wistar大鼠40只,均由解放军第三军医大学实验动物中心提供.方法:采用差速黏附法和振荡分离法纯化培养KM小鼠星形胶质细胞,收集传至第3代、培养5d的星形胶质细胞条件培养液,-20℃冻存待用.体外分离Wistar胎鼠室管膜前下区神经干细胞,加入含B27和碱性成纤维细胞生长因子的DMEM/F12无血清培养基进行原代培养,传至第3代后按0.5×108L-1密度接种,设立2组:对照组单纯加入含体积分数0.1为胎生血清的DMEM/F12培养基予以自然分化,实验组加入已制备的星形胶质细胞条件培养液进行诱导分化.主要观察指标:免疫细胞化学染色鉴定胎鼠室管膜前下区神经干细胞,流式细胞仪检测胎鼠室管膜前下区神经干细胞向多巴胺能神经元分化的阳性率.结果:培养的神经球细胞袁达巢蛋白,可分化为神经元特异性烯醇化酶、胶质纤维酸性蛋白阳性细胞.诱导分化7d后,实验组可见酪氨酸羟化酶阳性细胞,胞体呈圆形或椭圆形,酪氨酸羟化酶位于胞质及突起中;对照组酪氨酸羟化酶阳性细胞在数量、细胞成熟形态上均未达到实验组水平.实验组酪氨酸羟化酶阳性细胞分化率明显高于对照组(t=35.296,P<0.01).结论:在体外星形胶质细胞条件培养液可显著促进胎鼠室管膜前下区神经干细胞向多巴胺能神经元分化.     

骨髓基质细胞条件液对PC12细胞生长与分化的影响

目的:观察骨髓基质细胞条件液对PC12细胞生长与分化的影响,分析其能否保护PC12细胞免受鱼藤酮的毒性作用。方法:实验于2005-11/2006-04在河北省脑老化与认知神经科学重点实验室完成,PC12细胞来源于大鼠嗜铬细胞瘤。①条件液对PC12细胞增殖影响和对毒物鱼藤酮的抵抗作用:PC12细胞按实验对照原则分为对照组、条件液组,分别经正常培养液和骨髓基质细胞培养制备的条件液培养。两组分别加入鱼藤酮,浓度为0和10μmol/L,作用72h,MTT法检测细胞活性。细胞存活率=鱼藤酮孔吸光度值/对照孔吸光度值×100%。②条件液对PC12细胞的诱导分化作用:分别于接种第3,7,10天于倒置显微镜下观察细胞分化情况和突起生长情况。计数10～20个视野,按突起细胞数、3个或3个以上突起细胞数、突起长度大于2倍胞体细胞数占细胞总数的百分率3个指标对条件液组和对照组进行比较。结果:①条件液对PC12细胞增殖的影响及对毒物鱼藤酮的抵抗作用:经鱼藤酮作用后条件液组细胞存活率显著低于对照组[(64.45±1.60)%,(78.86±4.95)%(t=6.783,P<0.01)]。用条件液培养PC12细胞72h,条件液组与对照组的细胞存活率相比差异无显著性意义[(118.1±3.28)%,(121.3±10.54)%(P>0.05)]。②条件液对PC12细胞的诱导分化作用:条件液作用3d,细胞开始长出突起,但与对照组无差别。至第7天,有突起细胞数、突起大于2倍胞体直径的细胞数及有3个以上突起的细胞数均增多,占总细胞数的百分率与对照组比较差异均具有显著性意义(P<0.05～0.01)。培养至第10天,长度大于2倍胞体直径的细胞数占总细胞数的百分率与对照组比较差异也有显著性意义(P<0.01)。结论:骨髓基质细胞条件液可诱导PC12细胞分化为神经元样细胞,但对其增殖及鱼藤酮所致氧化损伤均无明显作用。骨髓基质细胞的这种诱导作用可能由其分泌到细胞外的可溶性分子介导。     

醒脑启智胶囊药物血清对PC12细胞缺糖损伤的保护作用

目的:探讨缺糖对PC12细胞的影响以及醒脑启智胶囊药物血清对其的保护作用。方法:采用血清药理学方法,体外培养PC12细胞,用无糖Earle's液产生缺糖损伤,观察PC12细胞形态学、MTT法细胞活力、乳酸脱氢酶(lactatedehydrogenase,LDH)活性的变化。结果:PC12细胞在缺糖作用下有明显的损伤,镜下可见细胞肿胀圆缩,折光性下降,贴壁功能下降,部分细胞裂解成碎片;给予醒脑启智胶囊药物血清均能明显减轻缺糖对PC12细胞形态学变化的影响,表现为细胞折光性较好,细胞碎片形成减少。缺糖损伤后的PC12细胞活力降低0.20±0.03,LDH活性升高犤(1.85±0.23)kU/L,加入醒脑启智胶囊犦血清后,细胞活力明显增高,LDH活性明显降低。结论:醒脑启智胶囊药物血清能明显减轻PC12细胞的缺糖损伤,并呈现一定的剂量依赖关系。     

嗅鞘细胞条件培养液和星形胶质细胞条件培养液对受损海马神经元保护作用的对比研究

目的:观察嗅鞘细胞条件培养液(OECCM)和星形胶质细胞条件培养液(ACM)对受损海马神经元的保护作用。方法:分别采用2种胶质细胞条件培养液预处理受损海马神经元(谷氨酸诱导损伤),对比其对受损海马神经元活力、凋亡率和胞浆内游离钙离子浓度的影响。结果:与谷氨酸组相比,OECCM组神经元活力明显增高(P0.01),ACM组神经元活力增高(P0.05);与OECCM组相比,ACM组神经元活力降低(P0.05)。与谷氨酸组相比,ACM组神经元凋亡率和胞内游离钙浓度降低(P0.05),OECCM组明显降低(P0.01);OECCM组神经元凋亡率和胞内游离钙浓度低于ACM组(P0.05)。结论:OECCM和ACM均可明显提高受损海马神经元活力、降低凋亡率和胞浆内游离钙离子浓度,OECCM的保护作用优于ACM。     

骨髓基质细胞条件培养液通过p38信号转导通路诱导中脑神经干细胞分化

目的：骨髓基质细胞条件培养液能够诱导中脑神经干细胞分化为高比例神经元，但具体机制尚不十分清楚。选择p38信号转导通路作为观察切入点，剖析其在诱导分化途径中所扮演的角色。方法：实验于2006—04／2007—03在河北省脑老化与认知神经科学实验室完成。①实验方法：将SD大鼠麻醉后处死，分离股骨和胫骨，冲洗骨髓腔，将洗出的细胞悬液离心，悬浮后接种，培养48h后弃去未贴壁细胞，更换新的培养基，6d左右可进行传代，约铺满85％瓶底后弃去培养液，更换为含2％B27的Neurobasal培养液，24h后经过离心的上清液即为骨髓基质细胞条件培养液。取新生SD大鼠中脑，机械分散成单细胞后离心弃上清，加入培养液分散过滤，接种时加入含2％B27的DMEM／F12培养基和20μg／L碱性成纤维细胞生长因子，7d左右的单个神经干细胞便可增殖形成球体。将第2-3代神经干细胞球种植于预先包被多聚赖氨酸的培养皿中，贴壁后更换培养液。设立对照组和抑制剂组，均加入骨髓基质细胞条件培养液，此外抑制剂组还加入p38信号转导通路抑制剂SB203580至终浓度4μmol／L。②实验评估：第7天进行免疫细胞化学染色，检测表达微管相关蛋白2的神经元与表达胶质原纤维酸性蛋白的星形胶质细胞在分化细胞中所占的比例。结果：①神经干细胞分化过程中的形态学变化及p38信号转导通路抑制剂的影响：加入抑制剂后24h，光镜下可见神经干细胞长出的细胞有两种类型：一类细胞体积较小，边缘整齐，立体感强，周围有光晕并在两极有突起，免疫荧光染色显示这类细胞微管相关蛋白2呈阳性表达，即为神经元；另一类细胞突起较粗大，不规则，多聚集在神经干细胞球的中央，呈放射状排列，免疫荧光染色表明这类细胞为胶质原纤维酸性蛋白阳性的星形胶质细胞。②神经元及星形胶质细胞在分化细胞中所占的比例：p38信号转导通路抑制剂作用于神经干细胞7d时，从神经干细胞分化成神经元的比例明显低于对照组（P〈0．01），分化成星形胶质细胞的比例明显高于对照组（P〈0．05）。结论：骨髓基质细胞条件培养液在促进神经干细胞分化为神经元的同时，能够抑制其分化为星形胶质细胞，提示骨髓基质细胞分泌的可溶性分子可能是通过p38信号转导通路起作用的。     

醒脑启智胶囊药物血清对PC12细胞缺糖损伤的保护作用

目的：探讨缺糖对PC12细胞的影响以及醒脑启智胶囊药物血清对其的保护作用。方法：采用血清药理学方法，体外培养PCI2细胞。用无糖Earle’s液产生缺糖损伤，观察PC12细胞形态学、MTT法细胞活力、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)活性的变化。结果：PC12细胞在缺糖作用下有明显的损伤，镜下可见细胞肿胀圆缩，折光性下降;贴壁功能下降，部分细胞裂解成碎片；给予醒脑启智胶囊药物血清均能明显减轻缺糖对PC12细胞形态学变化的影响，表现为细胞折光性较好，细胞碎片形成减少。缺糖损伤后的PC12细胞活力降低0．20&;#177;0．03，LDH活性升高[(1．85&;#177;0．23)kU／L)，加入醒脑启智胶囊血清后，细胞活力明显增高，LDH活性明显降低。结论：醒脑启智胶囊药物血清能明显减轻PC12细胞的缺糖损伤，并呈现一定的剂量依赖关系。     

以天麻和钩藤为主的中药制剂干预体外模拟脑缺血再灌注损伤大鼠碱性成纤维细胞生长因子及其受体的表达

目的:观察碱性成纤维细胞生长因子及其受体在体外模拟脑缺血再灌注损伤中的表达变化及以天麻和钩藤为主的中药制剂——抗呆Ⅰ号对其的影响。方法:实验于2002-03/2004-04在科学实验中心完成。先分别进行大鼠大脑皮质星形胶质细胞和神经元的分离纯化培养及体外模拟脑缺血再灌注损伤模型的建立,然后分别进行下列实验:①按随机数字表法将传代后培养5d的星形胶质细胞分为正常对照组、缺血再灌注模型组和缺血用药组(应用抗呆Ⅰ号),在体外模拟脑缺血4h和再灌注3h,18h,24h,36h,48h和72h后行碱性成纤维细胞生长因子的免疫细胞化学染色。②用再灌注18h后收集的星形胶质细胞条件培养液、经抗呆Ⅰ号作用的星形胶质细胞条件培养液及星形胶质细胞条件培养液与抗呆Ⅰ号联合应用以1∶5的浓度来培养损伤后的神经元,再对其培养的神经元行碱性成纤维细胞生长因子受体的免疫组化染色。结果:①体外培养大鼠的大脑皮质星形胶质细胞在模拟脑缺血再灌注损伤后各时相点分泌碱性成纤维细胞生长因子的能力均显著高于正常对照组(P<0.05～0.01);除再灌注72h外,其余各时相点缺血用药组碱性成纤维细胞生长因子的表达水平均显著高于缺血再灌注模型组(P<0.05～0.01)。②星形胶质细胞条件培养液组、经抗呆Ⅰ号作用的星形胶质细胞条件培养液组和联合应用组脑缺血再灌注损伤后各时相点的碱性成纤维细胞生长因子受体表达水平大多显著高于缺血再灌注模型组(P<0.05～0.01),均在再灌注18h时达到高峰,其作用强度为经抗呆Ⅰ号作用的星形胶质细胞条件培养液>联合应用>星形胶质细胞条件培养液。结论:体外模拟脑缺血再灌注损伤使星形胶质细胞表达碱性成纤维细胞生长因子的能力增强,星形胶质细胞条件培养液能促进受损神经元碱性成纤维细胞生长因子受体的表达。抗呆Ⅰ号可增强受损神经组织的分泌功能,促进其损伤后的修复。     

以天麻和钩藤为主的中药制剂干预体外模拟脑缺血再灌注损伤大鼠碱性成纤维细胞生长因子及其受体的表达

目的：观察碱性成纤维细胞生长因子及其受体在体外模拟脑缺血再灌注损伤中的表达变化及以天麻和钩藤为主的中药制剂——抗呆Ⅰ号对其的影响。 方法：实验于2002-03／2004-04在科学实验中心完成。先分别进行大鼠大脑皮质星形胶质细胞和神经元的分离纯化培养及体外模拟脑缺血再灌注损伤模型的建立，然后分别进行下列实验：①按随机数字表法将传代后培养5d的星形胶质细胞分为正常对照组、缺血再灌注模型组和缺血用药组（应用抗呆Ⅰ号），在体外模拟脑缺血4h和再灌注3h，18h，24h，36h，48h和72h后行碱性成纤维细胞生长因子的免疫细胞化学染色。②用再灌注18h后收集的星形胶质细胞条件培养液、经抗呆Ⅰ号作用的星形胶质细胞条件培养液及星形胶质细胞条件培养液与抗呆Ⅰ号联合应用以1：5的浓度来培养损伤后的神经元。再对其培养的神经元行碱性成纤维细胞生长因子受体的免疫组化染色。 结果：①体外培养大鼠的大脑皮质星形胶质细胞在模拟脑缺血再灌注损伤后各时相点分泌碱性成纤维细胞生长因子的能力均显高于正常对照组（P〈0．05—0．01）；除再灌注72h外，其余各时相点缺血用药组碱性成纤维细胞生长因子的表达水平均显高于缺血再灌注模型组（P〈0．05—0．01）。②星形胶质细胞条件培养液组、经抗呆Ⅰ号作用的星形胶质细胞条件培养液组和联合应用组脑缺血再灌注损伤后各时相点的碱性成纤维细胞生长因子受体表达水平大多显高于缺血再灌注模型组（P〈0．05-0．01），均在再灌注18h时达到高峰，其作用强度为经抗呆Ⅰ号作用的星形胶质细胞条件培养液〉联合应用〉星形胶质细胞条件培养液。 结论：体外模拟脑缺血再灌注损伤使星形胶质细胞表达碱性成纤维细胞生长因子的能力增强，星形胶质细胞条件培养液能促进受损神经元碱性成纤维细胞生长因子受体的表达。抗呆Ⅰ号可增强受损神经组织的分泌功能，促进其损伤后的修复。     

白质星形胶质细胞内S100A4蛋白对小鼠背根神经节细胞突起生长的影响

目的 研究离体条件下白质星形胶质细胞及其表达的S100A4蛋白对小鼠背根神经节（DRG）细胞突起生长的影响。方法 用对照siRNA或S100A4siRNA转染纯的白质星形胶质细胞，3d后与成年小鼠DRG细胞共同培养6，12，18，24h，采用免疫荧光化学方法观察DRG细胞突起的生长情况。结果 在多聚-L-赖氨酸包被的盖玻片上，成熟的DRG细胞能较好地存活，但在培养24h内未见有突起长出。与白质星形胶质细胞共培养6h，各组DGR细胞均未长出突起；共同培养12，18，24h，各组DGR细胞长出突起，且突起长度随共同培养时间的延长而增加；S100A4siRNA转染组DRG细胞突起明显长于培养相同时间的对照siRNA转染组。结论 白质星形胶质细胞促进小鼠DRG细胞突起生长，而星形胶质细胞内的S100A4蛋白抑制该作用。     

缺血预处理星形胶质细胞GDNF抑制p38MAPK信号通路减轻神经元凋亡

目的研究缺血预处理星形胶质细胞分泌GDNF抑制p38MAPK信号通路发挥脑保护作用。方法原代培养神经元及星形胶质细胞,给予缺血预处理,将星形胶质细胞培养基制备成条件培养基,沉默GDNF基因的培养基作为另一种条件培养基,将神经元分为对照组、预处理组、预处理+缺血组、缺血组,应用不同条件培养基孵育神经元,流式细胞术检测神经元凋亡,Western Blot法检测神经元p38MAPK及p-p38MAPK的表达。结果预处理+缺血组和缺血组神经元凋亡率明显增高(P<0.05),加入ACM2后凋亡率较ACM1和ACM3两组均减低(P<0.05)。每组神经元的p38MAPK蛋白表达均无明显变化(P>0.05);预处理+缺血组及缺血组p-p38MAPK的蛋白表达均明显高于对照组和预处理组(P<0.05),预处理+缺血组p-p38MAPK的蛋白表达均较缺血组低(P<0.05),加入ACM2组的p-p38MAPK蛋白表达低于ACM1和ACM3两组(P<0.05)。结论缺血预处理后星形胶质细胞分泌GDNF抑制p38MAPK信号通路的激活从而减少神经元凋亡,起到脑保护作用。     

高渗条件下大鼠下丘脑神经元和星形胶质细胞内钙的动态变化

背景既往有很多关于培养神经元或胶质细胞内钙的研究.然而关于高渗条件下共同观察神经元和胶质细胞内钙变化的研究目前较少.目的探讨高渗刺激后大鼠下丘脑神经元和星形胶质细胞(AST)内钙的变化.设计随机对照实验研究.单位一所大学医院的神经外科和一所大学神经科学研究所的实验室.材料实验在南方医科大学医院神经外科和解放军第四军医大学全军神经科学研究所完成.新生两三天的SD大鼠2只和孕18 d大鼠胚胎6只,清洁级,由解放军第四军医大学实验动物中心提供.方法体外联合培养的神经元和AST经钙荧光指示剂Fluo-3负载后,用激光扫描共聚焦显微镜测定高渗NaCl溶液影响前后的细胞内钙水平随时间变化情况.主要观察指标联合培养的神经元和AST的形态观察及等渗和高渗状态下神经元和AST内Ca2+含量测定.结果高渗刺激使培养神经元和AST内钙水平先升高后降低,最后维持在比高渗刺激前稍高的静息钙水平上.AST钙水平达到峰值的速度略快于神经元.结论神经元和AST内Ca2+在渗透压信息传递过程起作用.     

帕金森病黑质多巴胺神经元的凋亡与其发病机制

目的研究帕金森病黑质多巴胺神经元的死亡机制.方法用四唑盐法及流式细胞仪观察囊泡单胺类转运体(Vesicular Monoamine Transporter,VMAT)功能抑制对大鼠嗜铬细胞瘤(pheochromocytoma cell,PC12)细胞凋亡的影响.结果多巴胺浓度为0.15,0.30,0.45,0.60 mmol/L时,PC12细胞生存率为(89.3±7.7)%,(62.9±4.3)%,(42.5±2.7)%,(37.6±3.7)%,与对照组100%比较0.30组差异有显著性意义(t=2.373～5.323,P＜0.05),0.45组与0.60组比较差异有显著性意义(t=4.673～5.323,P＜0.01),利血平协同多巴胺作用时,其生存率为(73.7±3.9)%,(49.8±2.1)%,(31.6±1.9)%,(20.1±1.7)%,与对照组100%比较,差异有显著性意义(t=3.043～5.673,P＜0.05).结论VMAT功能抑制引发了多巴胺的内源性毒性,进而诱发多巴胺神经元的凋亡,可较好解释帕金森病的发病机制.     

双孔钾通道TREK-1在神经细胞正常及缺氧条件下的表达研究

目的:研究双孔钾通道TREK-1在神经元及星形胶质细胞的表达,及在缺氧时星形胶质细胞中的表达变化。方法:离体培养大鼠皮质神经元和星形胶质细胞,利用免疫荧光染色法观察TREK-1蛋白在神经元和星形胶质细胞的表达分布,对星形胶质细胞进行缺氧干预,实时PCR观察缺氧不同时间TREK-1的表达变化。结果:TREK-1通道在神经元和星形胶质细胞均有表达,缺氧时TREK-1在星形胶质细胞中呈先上升,后逐渐下降的趋势。结论:TREK-1在神经元和星形胶质细胞中均有表达,星形胶质细胞中TREK-1的表达在缺氧损伤中发生动态变化。     

电磁脉冲对海马神经元的损伤及其对[Ca2+]i的影响

背景:电磁脉冲照射可影响实验大鼠的学习记忆功能,并造成大鼠海马组织损伤和超微结构改变。目的:观察电磁脉冲对离体培养的海马神经元的损伤效应及其对[Ca2 ]i的影响,以深入分析电磁脉冲致脑损伤的可能机制。设计:随机对照动物实验。单位:承德医学院病理教研室。材料:Wistar乳鼠若干只,雌雄各半。电磁脉冲辐射源:高场强电磁脉冲模拟源。方法:实验于2004-03/12分别在军事医学科学院和承德医学院完成。Wistar乳鼠若干只,麻醉下断头取脑,分离海马组织,调整细胞悬液浓度至5×108L-1接种。分组:①培养细胞分为对照组和照射组,于照射后即刻(0h)收集细胞进行形态学观察和胞内游离钙离子浓度测定;②另培养细胞分为对照组和照射后0h组和12h组,进行细胞凋亡和坏死率的测定。(培养细胞用量:每项检查每组1个培养瓶,重复3次。)电磁脉冲辐射条件为6×104V/m,脉冲上升时间为20ns,脉宽为30μs,频率为2.5脉冲/min,作用2min。原代培养的海马神经元经电磁脉冲辐射后,倒置相差显微镜下观察照射前后神经元形态学变化;FACS法检测细胞凋亡和坏死;Fluo-3-AM荧光探针负载、激光共聚焦显微镜扫描测定神经元胞内游离钙离子浓度[Ca2 ]i。主要观察指标:神经元形态学变化;细胞凋亡率和坏死率;胞内游离钙离子浓度[Ca2 ]i。结果:①电磁脉冲辐射后即刻,神经细胞逐渐发生液化,神经元突起回缩、变性。②电磁脉冲辐射后12h凋亡率较辐射后即刻有所恢复,但与对照组相比均显著增加[(59.27±1.27)%,(72.17±6.21)%,(17.45±5.63)%,P<0.05]。③在辐射后即刻和12h坏死率比对照组升高,但差异无统计学意义[(13.71±2.31)%,(11.96±1.04)%,(8.45±0.67)%,P>0.05]。④电磁脉冲辐射后即刻[Ca2 ]i荧光强度显著高于对照组(107.34±26.14,54.93±16.08,P<0.05)。结论:电磁脉冲致海马神经元形态学损伤、坏死与凋亡率增加,神经元内的Ca2 荧光强度明显增加。     

Methylprednisolone Inhibits the Expression of Glial Fibrillary Acidic Protein and Chondroitin Sulfate Proteoglycans in Reactivated Astrocytes

创伤后的神经胶质增生导致硫酸软骨素蛋白聚糖(CSPG)的显著表达,从而抑制轴突生长和再生。甲基强地松龙(MP),一种合成的糖皮质激素,在急性脊髓损伤(SCI)的治疗中有神经保护作用和抗炎效应。但是,MP对于CSPG在活性胶质细胞中的表达的作用尚不清楚。本文用a-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸酯(AM-PA)诱导星形胶质细胞再活化,用环噻嗪模拟SCI的兴奋性中毒刺激。AMPA治疗后,星形胶质细胞再活化的标志物-胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、CSPG神经聚糖和磷酸盐的表达都显著上调。AMPA治疗星形胶质细胞的条件培养液强烈抑制大鼠背根神经节中神经元的轴突生长,但这种作用能被MP的预处理所逆转。此外,MP下调成年SCI大鼠中GFAP和CSPG的表达,对抗RU486的糖皮质激素受体(GR)和GR si RNA能逆转MP对GFAP和神经聚糖表达的抑制作用。这些结果提示,MP能在兴奋性中毒损伤后通过GR介导的星形胶质细胞再活化下调和GSPG表达抑制来改善神经修复,促进轴突生长。     

Transwell培养体系中受损PC12细胞促进骨髓间质干细胞向神经元样细胞的转分化

背景：药物治疗阿尔茨海默病难以达到满意效果，而多项研究表明，骨髓间质干细胞移植治疗帕金森病、脑缺血等有效，但其治疗机制尚不十分清楚。目的：采用淀粉样β1-40蛋白损伤的PC12细胞与骨髓间质干细胞共育，模拟移植环境，观察共育微环境中细胞间双向信息反馈对骨髓间质干细胞向神经细胞转分化的作用及对抗损伤的PC12凋亡的保护作用。设计：对比观察实验。单位：中国医科大学神经内科。材料：选用出生两三周的SD大鼠，雌雄不拘。PCI2细胞株购自中国科学院细胞生物研究所。神经元特异性烯醇化酶（1：50，博士德，武汉）；MTT15μL（终浓度0．5g／L）。方法：实验于2004—06／07在中国医科大学实验中心完成。取1只SD大鼠双侧股骨骨髓，并培养骨髓间质干细胞，以CD44抗体用免疫荧光鉴定骨髓间质干细胞。PCI2在实验中作为神经细胞的替代细胞。淀粉样β1-40蛋白刺激PC12后，用转移筛网转移PC12。实验分5组，A组：正常培养的PC12＋骨髓间质干细胞共育；B组：淀粉样β1-40蛋白刺激的PC12＋MSCs共育；C组：正常PC12的培养上清＋骨髓间质干细胞；D组：受损PCI2上清＋骨髓间质干细胞；E组：普通1640培养的骨髓间质干细胞。主要观察指标：按常规进行细胞的免疫化学染色，采用荧光倒置显微镜观察神经元特异性烯醇化酶阳性细胞，随机选取10个200倍的视野，计数阳性细胞数。用四甲基偶氮唑盐代谢率（四唑盐比色试验）检测各组骨髓间质干细胞增殖情况。结果：①骨髓间质干细胞的生长：以荧光和明视野在同一视野下观察，骨髓间质干细胞生长良好，CD44免疫荧光鉴定，见95％以上细胞呈阳性表达。②神经元特异性烯醇化酶阳性细胞：以荧光和明视野在同一视野下观察，神经元特异性烯醇化酶阳性的骨髓间质干细胞呈现红色荧光，骨髓间质干细胞形态为双极形、多极形和锥形，出现类似神经元样细胞的形态，似树突样突起结构，个别神经元样细胞之间有广泛的联系。B组神经元特异性烯醇化酶细胞阳性率明显高于其他组（F=34．82．P〈0．01）。③骨髓间质干细胞增殖情况：四甲基偶氮唑盐代谢率以B组最低，与其他比较，差异有显著性意义（F=9．713，P〈0．01）。结论：淀粉样β1-40蛋白损伤PC12与骨髓间质干细胞非接触共培养的微环境细胞最有利于骨髓间质干细胞向神经元样分化，而非增殖方向发展。     

Nerve growth factor-induced neurite sprouting in PC12 cells involves sigma-1 receptors: implications for antidepressants

One theory concerning the action of antidepressants relates to the drugs' ability to induce an adaptive plasticity in neurons such as neurite sprouting. Certain antidepressants are known to bind to sigma-1 receptors (Sig-1R) with high affinity. Sig-1R are dynamic endoplasmic reticulum proteins that are highly concentrated at the tip of growth cones in cultured cells. We therefore tested the hypotheses that Sig-1R might participate in the neurite sprouting and that antidepressants with Sig-1R affinity may promote the neuronal sprouting via Sig-1R. The prototypic Sig-1R agonist (+)-pentazocine [(+)PTZ], as well as the Sig-1R-active antidepressants imipramine and fluvoxamine, although ineffective by themselves, were found to enhance the nerve growth factor (NGF)-induced neurite sprouting in PC12 cells in a dose-dependent manner. A Sig-1R antagonist N,N-dipropyl-2-[4-methoxy-3-(2-phenylethoxy)phenyl]-ethylamine monohydrochloride (NE100) blocked the enhancements caused by these Sig-1R agonists. In separate experiments, we found that NGF dose and time dependently increased Sig-1R in PC12 cells. Chronic treatment of cells with (+)PTZ, imipramine, or fluvoxamine also increased Sig-1R. These latter results suggested that NGF induces the neurite sprouting by increasing Sig-1R. Indeed, the overexpression of Sig-1R per se in PC12 cells enhanced the NGF-induced neurite sprouting. Furthermore, antisense deoxyoligonucleotides directed against Sig-1R attenuated the NGF-induced neurite sprouting. Thus, when taken together, our results indicate that Sig-1R play an important role in the NGF-induced neurite sprouting and that certain antidepressants may facilitate neuronal sprouting in the brain via Sig-1R.     

胶质细胞系源性神经营养因子修饰脂肪间质干细胞与共培养多巴胺能神经元的存活

背景:目前尚未见脂肪间质干细胞体外诱导分化成多巴胺能神经元的报道,且有关脂肪间质干细胞维持多巴胺能神经元存活的机制也缺乏实验证据.目的:观察腺病毒介导胶质细胞系源性神经营养因子基因修饰的脂肪间质干细胞对共培养条件下多巴胺能神经元存活的影响.设计、时间及地点:细胞学体外对比观察,于2007-03/12在吉林省耳鼻咽喉研究所和教育部吉林大学人兽共患病重点实验室完成.材料:3周龄Wistar大鼠、孕14dWistar大鼠由吉林大学白求恩医学院实验动物中心提供.方法:采用pAdTrackCV和pAdEasy-1系统构建重组胶质细胞系源性神经营养因子腺病毒.取孕14 d大鼠,采用酶消化法培养中脑多巴胺能神经元.取Wistar大鼠腹股沟处脂肪,酶消化法分离培养脂肪间质干细胞,体外培养至第3代当细胞生长至60%融合时,以病毒滴度为1 ×109vp/mL的胶质细胞系源性神经营养因子重组腺病毒作用细胞1 h后,转移到生长培养基继续培养,通过ELISA法检测培养上清胶质细胞系源性神经营养因子水平.设立3组:Ad-GDNF转染共培养组、Ad-GFP转染共培养组分别在脂肪间质干细胞经相应病毒转染24 h后加入分离的多巴胺能神经元,继续培养7 d;单纯多巴胺能神经元培养组不加入脂肪间质干细胞.主要观察指标:采用免疫荧光技术检测共培养环境对多巴胺能神经元存活的影响,共培养环境对胶质细胞系源性神经营养因子修饰脂肪间质干细胞分化的影响.结果:脂肪间质干细胞在pAd.GDNF转染24 h后细胞上清中出现胶质细胞系源性神经营养因子蛋白,72 h达高峰,pAd-GDNF对脂肪间质干细胞的转染效率约为80%.酪氨酸羟化酶免疫荧光染色结果发现,Ad-GDNF转染共培养组多巴胺能神经元存活率明显高于单纯多巴胺能神经元培养组、Ad-GFP转染共培养组(55%,15%,25%,P<0.01).对共培养7 d的细胞进行酪氨酸羟化酶免疫荧光染色,分别以波长为488 nm和563 nm进行单通道扫描,未发现同时表达绿色荧光蛋白和酪氨酸羟化酶的细胞,表明此共培养环境可能不具备诱导脂肪间质干细胞分化为多巴胺能神经元的条件.结论:胶质细胞系源性神经营养因子基因修饰的脂肪间质干细胞与胚胎中脑分离出的多巴胺能神经元共培养,能够维持和促进多巴胺能神经元的存活,但可能不具备诱导脂肪间质干细胞分化为多巴胺能神经元的作用.