重组大鼠肾胆绿素还原酶在大肠杆菌中表达和纯化方法的研究

目的　确定重组大鼠肾胆绿素还原酶在大肠杆菌中的表达条件及纯化方法。方法　将已构建的大鼠肾胆绿素还原酶 (BVR)的重组质粒pMW172a -BVR转入大肠杆菌BL - 2 1,分析不同温度、摇床转速对BVR表达的影响 ,确定可溶性表达最佳条件。使用超速离心、盐析、层析的方法纯化BVR。检测酶活性。结果　确定了BVR可溶性表达最佳条件为 37℃ (12 0± 5 )r/min ;确定了BVR具体纯化路线。所得蛋白纯度为 92 2 %、纯化倍数为 4 3倍、回收率为 19 8%的活性BVR蛋白。结论　获得了纯度高、具有活性的BVR蛋白 ,可作为工具酶用于某些相关酶的研究 ,也为进一步进行BVR结构与功能之间关系的研究提供了可行的纯化路线     

谷慷太林注射液对骨折大鼠脑垂体中GH和TSH表达的实验研究

目的探讨骨组织提取液谷慷太林对大鼠骨折愈合的影响、垂体功能的调节作用及其促进骨折愈合的机制。方法取54只健康成年雌性SD大鼠(200±20)g,6只为空白对照组(B组),其余48只用定点手法折骨术造成大鼠双侧桡骨中段闭合性骨折,随机分为谷慷太林治疗组(G组)和骨折模型对照组(M组),每组24只。分别于第7、14、28、42天后各组随机处死6只大鼠,运用X线观察骨折愈合情况,利用骨密度测量仪检测骨折端骨密度值(BMD),并采用HE染色光镜下观察骨折处骨痂,运用免疫组化技术观察大鼠垂体中促甲状腺激素(TSH)和生长激素(GH)的阳性细胞数。结果 X线平片检查显示第14、28、42天时G组骨痂形成较M组明显;BMD结果显示骨密度值在各时间段G组均比M组高(P<0.05);骨痂组织学检查显示G组相对于M组断端周围的骨小梁数量增多,宽度较大,排列整齐,其形成的骨痂成熟。大鼠垂体中GH与TSH阳性细胞数的峰值在时间上G组均早于M组出现,尤其以第14、28天为明显(P<0.01)。结论骨组织提取液谷慷太林注射液具有促进骨折愈合的作用,其促进骨折愈合的途径之一可能与促进垂体合成与分泌生长激素、促甲状腺激素有关。     

重组人白细胞介素—3在大肠杆菌中表达及纯化研究

将化学合成的人白细胞介素－３（ｈＩＬ－３）基因与表达质粒ＰＫＫ２２３－３重组并转化大肠杆菌ＪＭ１０５，重组菌在摇瓶中发酵并诱导表达，表达产量达菌体蛋白质总量的５３％么上。发酵菌经超声破碎后得到包本，经洗涤处理使包含体纯度达９０％以上。     

大鼠牙齿移动中整合素αvβ3表达的实验研究

目的 研究大鼠牙齿移动中整合素αVβ3表达的不同,为研究靶向封闭整合素αVβ3提供时相支持.方法 建立大鼠正畸牙齿移动模型,分为成幼鼠两组.拉上颌一侧第一磨牙向近中移动,另一侧为空白对照.分别于0 d(未加力时)、加力后3 d、1周、3周、4周、6周、8周后将每组5只大鼠处死,行免疫组化技术和计算机图像分析技术比较分析.结果 整合素αVβ3两个亚单位的表达峰值在幼鼠出现于第1周,成鼠出现于第3周.3 d、1周时幼鼠整合素αVβ3两个亚单位的表达均显著强于成鼠(P<0.05),在3,4,6周和8周时则明显弱于成鼠(P<0.05).结论 成幼鼠整合素αVβ3表达具有不同的时相性变化规律.     

重组小鼠Raf-1蛋白在大肠杆菌中表达的实验研究

目的:表达小鼠重组Raf-1蛋白,为进一步研究其在信号传导中的功能奠定基础。方法:提取小鼠肝脏组织总RNA,逆转录合成cDNA,巢式PCR扩增Raf-1基因编码区。将Raf-1基因克隆入原核表达载体pETDuet-1,IPTG诱导表达,表达产物行Western Blot鉴定。结果:经SDS-PAGE及Western Blot证实,在大肠杆菌中有重组鼠Raf-1的表达,表达产物主要存在于包涵体中。结论:实现了重组小鼠Raf-1的表达。     

重组大鼠α突触核蛋白的制备与鉴定

目的克隆编码大鼠α-突触核蛋白的cDNA,探讨α-突触核蛋白基因在原核细胞中的表达过程并制备基因重组型α-突触核蛋白。方法设计合成含适当酶切位点的DNA片段作为引物,采用RT-PCR法从Wistar大鼠脑总RNA中扩增编码α-突触核蛋白的cDNA并亚克隆至原核表达质粒pGEX-4T-1,重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),使其表达以谷胱甘肽S转移酶(glutathione-S-transferase,GST)为标签的融合蛋白质。用凝血酶定点分解融合蛋白,再用谷胱甘肽-琼脂糖4B和Superdex S200纯化基因重组型α-突触核蛋白。结果核酸序列测定表明克隆的cDNA含420 bp编码140个氨基酸,重组质粒pGEX-raSYN在原核细胞中表达为可溶性组分并受IPTG诱导,纯化的目的蛋白质在SDS-PAGE上表现为单一条带,推测其相对分子质量约为18 000。每升细菌培养液可纯化目的蛋白质3 mg。Western blot分析结果表明纯化的目的蛋白质可以被抗α-突触核蛋白识别。结论大鼠α-突触核蛋白基因在原核细胞高效表达,可制备高纯度基因重组型大鼠α-突触核蛋白。     

链脲佐菌素诱发的大鼠糖尿病对垂体TSH细胞的影响

目的：观察实验性糖尿病对垂体TSH细胞的影响,探讨糖尿病垂体-甲状腺轴异常的发生机制.方法：采用链脲佐菌素（STZ）诱发大鼠糖尿病,应用PAP免疫细胞化学染色显示垂体促甲状腺激素细胞（TSH细胞）后,以形态计量学方法观察大鼠TSH细胞形态结构的变化.结果：糖尿病鼠TSH细胞的数密度、体密度均较对照组明显提高（P〈0.05,P〈0.01）,而平均细胞直径明显降低（P〈0.01）,说明细胞数量增加,细胞直径变小.糖尿病鼠的强阳性TSH细胞百分率较对照组明显升高（P〈0.05）.糖尿病加胰岛素组的上述指标均较糖尿病鼠有明显逆转,趋向正常组.结论：实验性糖尿病导致垂体TSH细胞发生明显的形态学改变,胰岛素治疗能逆转上述变化,提示糖尿病TSH细胞的变化与胰岛素缺乏密切相关.     

三结构域重组纤连蛋白多肽在大肠杆菌中表达及其产物的纯化

在大肠杆菌中表达了一种抗瘤转移多肽－人纤连蛋白（ＦＮ）的Ｃｅｌｌ Ｉ－Ｈｅｐ Ⅱ－Ｃｅｌｌ Ⅱ三结构域重组多肽（ＣＨ８２）,表达效率达２１％。在低温（２２℃）培养表达时,ＣＨ８２大部分为可溶性产物,经ＤＥＡＥ－５２层析及Ｈｅｐａｒｉｎ－ａｇａｒｏｓｅ亲和层析可得到纯品;在高温（３７℃）培养表达时,ＣＨ８２主要以包涵体形式出现,经尿素变性与复性处理后,可通过Ｈｅｐａｒｉｎ－ａｇａｒｏｓｅ亲和层析得到     

重组胸腺素α1的分离纯化和活性测定

目的：利用融合表达载体pThioHisA的重组质粒pThioHisA-Tα1④,转化大肠杆菌TOP10得到的工程菌,来分离纯化表达的胸腺素α1（thymosin alpha1,Tα1),方法将高效表达融合蛋白的工程菌用菌胞破碎器裂解,经80℃热处理,离心上清采用Q－SepharoseFF阴离子交换色色谱纯化Tα1单体,应用SDS－PAGE,2L－Tricine-SDS-PAGE和HPLC进行鉴定。结果SDS－PAGE分析表明菌体表达的融合蛋白牛菌体总蛋白的400g.kg^-1,经2L－Tricine-SDS-PAGE分析证实,融合蛋白可裂解出Tα1单体,裂解物经简单的离子色谱可以纯化出Tα1单体,HPLC鉴定纯化的Tα1纯度可达950g.kg^-1以上,利用^3H-TdR进行的生物活性测定表明,在致有丝分裂原ConA存在的条件下,融合蛋白和Tα1单体均具有刺激小鼠脾淋巴细胞分裂增殖的能力,与化学合成的Tα1相比具有相似的生活性。结论该方法是分离纯化Tα1简便易行,经济有效的方法,同时也为Tα1的分离纯化和大规模的开发生产奠定了基础。     

AOM所致大鼠结肠癌形成过程中脑垂体远侧部TSH阳性细胞免疫组织化学观察

目的:观察氧化偶氮甲烷(azoxymethane,AOM)所致大鼠结肠癌形成过程中,大鼠脑垂体远侧部促甲状腺激素(thyroid stimulating hormone,TSH)细胞的免疫组织化学变化并初探其意义。方法:用断乳SD(Sprague Dawley)雄性大鼠30只,分为AOM实验组和对照组。实验组用AOM(15 mg/kg)每周腹腔注射,连续2周,诱导大鼠结肠癌的形成。分别于实验第10,30,34周取材,用免疫组织化学、图像分析法观察大鼠实验性结肠癌形成过程中,脑垂体远侧部TSH阳性细胞的变化。结果:亚甲基蓝染色光镜下观察,可见AOM腹腔注射的大鼠结肠黏膜出现异常隐窝(aberrantcrypt,AC)和异常隐窝灶(aberrant crypt foci,ACF)。免疫组织化学显示,与同期正常对照组相比,实验组大鼠垂体远侧部TSH阳性细胞阳性反应显著性减弱(P<0.05)。结论:在大鼠实验性结肠癌形成过程中,脑垂体远侧部TSH细胞变化可能与机体肿瘤的发生有关。     

重组人IL-8在大肠杆菌中的表达及纯化工艺的优化

目的优化重组人IL-8（rhIL-8）大肠杆菌表达及纯化工艺，以便获得高纯度的重组蛋白。方法将已构建好的表达载体转化大肠杆菌HB101，经3-吲哚丙烯酸诱导，在发酵罐中进行表达，比较不同诱导剂浓度、温度、pH值及时间，以获得最佳表达工艺参数。离心收集菌体，超声破壁，收集包涵体和胞浆，其中包涵体经变性、复性处理，与包浆部分合并，经肝素亲和层析柱、阳离子交换柱和凝胶层析柱分离纯化，比较不同的洗脱条件，得到纯品，并对重组蛋白的纯度和生物学活性进行鉴定。结果用大肠杆菌HB101在发酵罐中表达rhIL-8，在30℃、pH为7．0的条件下加入50mmol／L 3-吲哚丙烯酸，诱导28h，得到约为100mg／ml的高表达，其分泌的重组蛋白以包涵体和胞浆的形式存在，经三步层析纯化后，得到高纯度的rhIL-8（纯度〉95％），经中性粒细胞趋化实验证实，所获IL-8具有良好的趋化白细胞迁移的作用。结论建立高效表达rhIL-8的原核表达和纯化工艺，所获的纯化IL-8具有良好的生物学活性。     

重组α2-HS糖蛋白的原核表达、纯化及免疫学活性分析

目的:原核表达并纯化具有生物学活性的重组α2-HS糖蛋白(AHSG)。方法:提取人肝癌细胞株HepG2细胞总RNA,逆转录得cDNA,PCR扩增出目的基因,与pMD18-T载体连接后,转化至大肠杆菌DH5α中,大量扩增后提取克隆质粒,连接至原核表达载体pEP-30a(+)中,转化BL21(DE3),经IPTG诱导蛋白表达,通过镍离子亲和层析的方法纯化重组蛋白,采用SDS-PAGE电泳、免疫印迹杂交法对纯化产物进行分析鉴定。结果:成功构建了AHSG原核表达系统BL21(pET30a-AHSG),最佳诱导条件为80μmol/LIPTG诱导3h;诱导表达的蛋白相对分子质量约54600,主要以不溶性的包涵体形式存在,纯化后的重组蛋白质量浓度最高达2.3g/L,经免疫印迹杂交鉴定有抗原性。结论:成功构建了AHSG原核表达系统,该系统可高效表达重组AHSG蛋白,该蛋白具有良好的抗原性。     

重组人白细胞介素－3在大肠杆菌中表达及纯化研究

将化学合成的人白细胞介素－３（ｈＩＬ－３）基因与表达质粒ｐＫＫ２２３－３重组并转化大肠杆菌ＪＭ１０５，重组菌在摇瓶中发酵并诱导表达，表达产量达菌体蛋白质总量的５３％以上。发酵菌经超声破碎后得到包含体，经洗涤处理使包含体纯度达９０％以上。用８ｍｏｌ／Ｌ盐酸胍溶解包含体后直接透析复性，复性液经Ｓｅｐｈｏｒｏｓｅ－ＳＰ离子交换层析，得到纯化的重组ｈＩＬ－３，纯度达９８％。用ＴＦ－１细胞进行体外检测活性，比活达到１０８单位／ｍｇ蛋白质。本研究为重组人白细胞介素－３的大规模生产提供了条件。     

大鼠酒精性脑损伤组织中TNF-α的表达

目的探讨酒精致大鼠脑损伤合并内毒素血症过程中,脑组织TNF-α的水平变化及相互关系。方法采用SD大鼠进行酒精灌胃,建立酒精性脑损害的动物模型,用光镜观察各组大鼠脑组织的病理改变,采用偶氮显色法定量检测模型组与对照组血浆中内毒素(ET)的水平;用ELISA法检测各组脑组织匀浆中的TNF-α的水平。结果脑组织病理切片显示,模型组脑组织有严重损伤;模型组血浆中的ET以及脑组织匀浆中的TNF-α水平明显高于对照组(P<0.05)。结论TNF-α在脑组织中的含量增高可能与酒精所致的大鼠脑组织损伤有密切联系。     

AChR-α3亚基mRNA在人淋巴组织中的表达

①目的 探讨人淋巴组织中乙酰胆碱受体α3(AChR—α3)亚基mRNA的表达及副交感神经系统对免疫系统作用的物质基础。②方法 应用地高辛尾段标记寡核苷酸探针原位杂交技术(ISH)，对32例人淋巴组织冷冻切片中AChR—α3亚基mRNA进行定性检测。③结果 32例人淋巴组织中有19例AChR—α3亚基mRNA表达阳性，阳性率为59．38％；淋巴结和脾脏AChR-α3亚基mRNA阳性表达差异无统计学意义(P=0．268)。④结论 人的免疫细胞可自身合成并表达AChR—α3亚基；ACh通过与免疫活性细胞上的相应的AChR结合而参与免疫系统功能的调节。     

重组人白血病抑制因子在大肠杆菌中的表达及纯化

目的:利用大肠杆菌表达并制备重组人源白血病抑制因子(Leukemia inhibitory factor,LIF)。方法:构建p ET-30a-rh LIF表达载体并转入大肠杆菌菌株BL21(DE3)之中,IPTG诱导使无标签的目的蛋白呈可溶性表达,继而利用三步柱层析纯化目的蛋白。最后对所获目的蛋白活性进行测定,并对其N端和C端的完整性分别应用Edman测序法以及质谱法进行鉴定。结果:通过三步柱层析以及中间的内毒素去除步骤可使无标签rh LIF获得纯化,检测结果提示所获目的蛋白内毒素水平<1 EU/μg,其活性同市售商品化LIF产品一致,Edman测序结果提示少部分目的蛋白N端存在甲硫氨酸修饰,质谱检测结果表明所获目的蛋白C端完整性较好。结论:建立了一种新的重组人源白血病抑制因子表达和纯化的方法,本方法不需利用标签蛋白,并可有效降低所获蛋白中内毒素水平,所获rh LIF蛋白可用于干细胞培养以及相关生物学研究。     

人钠泵α2亚基M4～M5区片段的克隆、原核表达与纯化

目的 构建钠泵α2亚基第4跨膜区与第5跨膜区之间的蛋白结构域M4～M5的原核表达载体,并在大肠杆菌中进行表达和纯化.方法 通过PCR反应和酶切技术,构建表达载体pET28b( + )-M4-5,并于大肠杆菌E.coli Rosetta 2进行表达,用6 mol/L盐酸胍对表达形成的不溶包涵体进行变性,梯度稀释复性后,用Ni-NTA亲和柱进行纯化,得到目的 蛋白,用Western blot分析表达产物,并采用无机磷法测定其ATP酶活性.结果 重组表达载体pET28b( + )-M4-5经酶切与测序鉴定证实构建成功;导入大肠杆菌Rosetta 2进行表达,表达产物相对分子质量为52×103左右,与预期值相符,表达量占细胞全蛋白的30%左右;SDS-PAGE分析表明,表达产物主要以包涵体形式存在,亲和柱纯化后,目的 蛋白的纯度在95%以上;Western blot分析表明表达产物与抗His抗体特异性结合;重组蛋白的ATP酶活性为(15.3±1.8)mmol·(g·h)-1.结论 构建了原核表达载体pET28b( + )-M4-5,并在大肠杆菌Rosetta 2中成功表达,亲和纯化获得较高纯度的M4～M5融合蛋白.     

大鼠海马HIF-1α和EPO在衰老过程中的表达

目的:探讨大鼠海马组织中低氧诱导因子-1α(HIF-1α)和促红细胞生长素(EPO)在衰老过程中的表达规律及二者在神经系统衰老过程中的作用.方法:应用尼氏染色和免疫组织化学技术观察不同月龄组(3,18,24,30月)大鼠海马CA1区神经细胞尼氏体及HIF-1α和EPO的表达情况.结果:随大鼠月龄的增大,海马CA1区神经细胞体积变大,排列稀疏,胞浆内尼氏体减少.随月龄增加海马CA1区HIF-1α阳性细胞数增加,差异有统计学意义(P＜0.05);大鼠海马CA1区EPO表达随月龄增加呈抛物线变化,由3月龄到18月龄,阳性细胞个数的增加有统计学意义(P＜0.05),由18月龄到30月龄,阳性细胞个数减少有统计学意义(P＜0.05).结论: HIF-1α与EPO在大鼠海马的表达在中年期之前,呈平行递增变化,在中年期之后,二者呈分离变化,提示HIF-1α活性下降和蛋白质合成功能的减退是衰老过程中EPO表达减少的主要原因,通过加强内源性HIF-1α的活性和补充外源性EPO有可能减缓神经系统的衰老.     

重组人胰岛素类似物蛋白在大肠杆菌中克隆、表达与纯化

目的:设计合成编码Des30、B26 H、B28D和B26 H-B28D基因,用大肠杆菌BL21(DE3)表达上述4种速效人胰岛素原蛋白,为探知B26 H-B28D功能和用植物系统表达速效胰岛素原类似物研究做必要的准备。方法:基于人胰岛素氨基酸和小C肽(TYPGDVPK)序列,按植物(油菜)偏爱密码子设计合成了198 bp编码人速效胰岛素原基因Des30。随后以Des30为模板,用PCR突变技术扩增并创造了基因B26 H、B28D和B26 H-B28D,并构建了4个原核表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3)后,经IPTG诱导、用Ni-NTA亲和柱纯化、复性、胰岛素体外成熟(酶解)获得重组人胰岛素突变体蛋白。结果:4种人速效胰岛素原类似物在宿主菌中均以包涵体形式存在,IPTG诱导时间以8 h为佳。Western blot结果表明,带his-tag的速效人胰岛素原蛋白已成功在宿主菌中表达,用Ni-NTA亲和柱纯化获得了较纯的速效人胰岛素原蛋白。纯化的包涵体蛋白通过低温透析复性,然后用胰蛋白酶和羧肽酶B酶切,Western blot结果显示,释放出的单体胰岛素与阳性对照一样具有免疫活性,RP-HPLC和MALDI-TOF质谱检测表明,酶切产物分子量峰值分别与预测的人胰岛素类似物分子量一致。结论:该研究为B26 H-B28D功能研究和用植物系统表达人类胰岛素的研究奠定基础。