钠通道重叠综合征相关基因SCN5A在H9C2细胞中的表达

目的构建表型重叠家系相关基因SCN5A del QKP1507-1509突变型真核表达载体,研究其在H9C2细胞中的表达。方法一步法定点诱变技术构建SCN5A基因del QKP1507-1509突变型真核表达载体,电穿孔方法将野生型和突变型质粒转染至H9C2细胞,应用实时荧光定量聚合酶链反应(RFQ-PCR)及Western blot技术检测其mRNA及蛋白表达情况。结果琼脂糖凝胶电泳法及DNA直接测序法均表明定点突变成功,RFQ-PCR及Western blot结果显示,野生组、突变组和混合组SCN5A基因mRNA相对表达量分别为1.089±0.459、1.011±0.840和1.069±0.492,3组SCN5A基因mRNA相对表达量比较差异无统计学意义(P>0.05)。野生组、突变组和混合组SCN5A蛋白在H9C2细胞的相对表达量分别为3.781±0.221、3.466±0.176和3.714±0.198,3组SCN5A蛋白相对表达量比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论成功构建钠通道基因del QKP1507-1509突变型真核表达载体并转染至H9C2细胞,该突变未引起钠通道在细胞膜的异常表达,为进一步功能研究提供了研究基础及方向。     

大鼠胚胎期心脏Na+通道基因SCN5A的表达

目的 研究大鼠胚胎发育过程中,编码心肌组织电压门控Na 通道α亚单位SCN5A基因mRNA的表达和蛋白定位.方法 大鼠胚胎期分7个时间点(E12.5-P1),提取心脏总RNA,RT-PCR和免疫组化方法分别检测SCN5A基因mRNA表达和蛋白定位.结果 大鼠胚胎发育期SCN5A基因mRNA表达呈动态模式,E12.5d(0.425±0.012)表达最少,E13.5d(0.532±0.012)和E14.5d(0.665±0.119)相对增加,E15.5d达到高峰(1.08±0.01),E17.5d(0.870±0.035)与E19.5d(0.855±0.057)相比略有降低,无显著性差别,提示胚胎发育后期表达量趋于平衡.出生后一天(P1)表达量(0.751±0.041)较胚胎期表达显著降低.除E17.5d与E19.5d比较无统计学意义外(P＞0.05),其余组间比较均有统计学意义(P＜0.001).免疫组化结果显示,SCN5A蛋白表达高峰及在左、右心室肌及室间隔中表达持续时间各不相同,胚胎早期SCN5A蛋白在不同心腔表达相对均匀,后期在心外膜和心室左、右束支位置表达增强.结论 SCN5A基因与大鼠胚胎心脏传导系统发生及其功能相关,Na 电流是形成胚胎发育中期心肌动作电位的主要成分.     

SCN5A基因A1180V突变致扩张型心肌病(DCM)伴房室传导阻滞(AVB)的家系随访分析

 目的  通过对已发现的心脏钠通道基因SCN5A点突变A1180V相关的扩张型心肌病(dilated cardiomyopathy,DCM)伴房室传导阻滞(atrioventricular block,AVB)的家系进行随访,探究A1180V突变致DCM的临床特征及病情演变特点。方法  参考前期2007年的资料,于2012年对家系中健在的8名A1180V突变携带者及8名非携带者再次予以询问病史及12导联心电图、超声心动图检查,回顾性分析该家系中10名突变携带者(含2名已故的携带者),8名非携带者及1名已故的基因型不详成员的临床资料。结果  随访期间,3名A1180V突变携带者首次诊断为一度AVB或二度Ⅰ型AVB;1名A1180V突变携带者由一度AVB进展为DCM伴三度AVB;1名A1180V突变携带者DCM表现进一步加重,心衰症状明显。该家系中A1180V突变携带者发病首发症状常为一度AVB,平均诊断年龄为(34±3.0)岁,并在约5年内逐渐进展为DCM伴三度AVB。结论  本随访分析进一步证实了A1180V突变对DCM的致病作用及特点。对该家系定期随访观察,有助于发现A1180V突变携带者的早期病变。     

Brugada综合征SCN5A基因G1712C突变的功能分析

目的 探讨Brugada综合征SCN5A基因G1712C新突变的电生理机制.方法 采用体外定点诱变法构建携带有基因突变G1712C的pRc/CMV-hH1的表达载体,lipo3000脂质转染法建立稳定表达pGFP-IRES-hβ1质粒的HEK293细胞系,并用G418进行筛选鉴定.分别做野生型的pRe/CMV-hHl (hHl)和携带有基因突变G1712C的pRc/CMV-hHl (mhHl)瞬时转染表达.进行全细胞膜片钳实验记录钠通道电流.实验结果由PatchMaster以及IGOR Pro 6.0软件分析.结果 G1712C位于Na+通道蛋白α亚单位的DⅣ区S5与S6之间的P-loop上.在瞬时转染野生型的hH1的细胞系中,指令电位从-60 mV逐渐上升时,钠电流也渐变大,在-20 mV时完全激活;激活电压在-60 mV到-50 mV,反转电位在50 mV左右.在瞬时转染突变型G1712C的细胞系中,没有发现钠电流.结论 野生型hH1所表达的钠通道蛋白与正常心肌细胞钠通道电生理特性相似.SCN5A基因G1712C突变导致Nav1.5通道失去功能,可能是该家系Brugada综合征的病因.     

罗红霉素对转染HERG基因人胚肾上皮细胞HERG钾通道的抑制作用

目的:研究罗红霉素对转染HERG基因人胚肾上皮细胞(HEK-293)HERG钾通道的抑制作用.方法:采用磷酸钙瞬时转染法分别将野生型、Y652A和F656C突变型HERG基因转染HEK-293细胞.观察不同浓度的罗红霉素对野生型HERG钾通道电流量效曲线、激活和失活曲线的影响,以及对突变型HERG钾通道电流的作用;HERG钾通道电流的记录采用全细胞膜片钳技术.结果:罗红霉素(0.1、1、3、10、30、100和300 μmol/L)浓度依赖性地抑制野生型HERG钾通道电流,其,IC50为(55.8±9.1)μmol/L,对野生型HERG钾通道电流的激活曲线和失活曲线无影响(激活曲线:tv1/2=1.011,tk=1.824;失活曲线:tv1/2=0.749,tk=0.859,P均>0.05);与野生型HERG比较,Y652A和F656C突变型HERG可显著减弱100、300和1000 μmol/L罗红霉素对HERG钾通道电流的阻断作用(tY652A=18.908、18.184和26.738,tF656C=2.926、4.260和4.143,P均<0.05).结论:罗红霉素能阻断HEK-293细胞HERG钾通道,Y652A和F656C是罗红霉素与HERG钾通道结合的关键位点.     

载有人心肌细胞钠离子通道及PRKAG2基因的HEK-293T细胞模型的建立

目的尝试建立类似PRKAG2心脏综合征钠离子通道功能的HEK-293T细胞模型,为探讨PRKAG2心脏综合征心律失常机制奠定基础。方法分别构建人PRKAG2基因质粒载体和SCN5A基因质粒载体,共转人胚肾细胞(HEK-293T);应用免疫荧光法、Real-time PCR、蛋白质印迹法检测HEK-293T细胞转染结果及基因表达情况。结果转染48h后,HEK-293T细胞在细胞免疫荧光显微镜下可见红色荧光和绿色荧光。Real-time PCR及蛋白印迹结果证实:单独转染SCN5A组、SCN5A+PRKAG2组、SCN5A+G100S组、SCN5A+R302Q组SCN5A基因及蛋白均有表达,而在空白对照组无表达,差异有统计学意义(P<0.05);SCN5A+PRKAG2组PRKAG2基因及蛋白高表达,而空白对照组、SCN5A组、SCN5A+R302Q组、SCN5A+G100S组表达量较低,差异有统计学意义(P<0.05)。结论成功建立类似PRKAG2心脏综合征钠离子通道的HEK-293T细胞模型,为后续研究奠定了基础。     

心源性猝死相关基因SCN5A的研究进展

SCN5A是钠通道α-亚基的编码基因，近年来的研究表明，SCN5A与长QT间期综合征(long QT syndrome，LQTs)、Brugada综合征(brugada syndrome，BS)以及进行性家族性心脏传导阻滞Ⅰ型(progressive familial heart block，typeⅠ，PFHB Ⅰ)有关。现仅就近年来有关研究进展综述如下。     

克山病患者SCN5A基因突变的研究

目的通过观察正常人和克山病患者心脏Na 通道基因SCN5A第28外显子的结构,探讨SCN5A基因突变与克山病发病的分子生物学机制。方法提取正常人和克山病患者的DNA,通过聚合酶链反应(PCR)对正常人和克山病患者的DNA进行扩增,并采用PCR-SSCP法检测克山病患者SCN5A基因28外显子的碱基序列。结果通过PCR-SSCP方法在克山病患者的SCN5A基因28号外显子处发现与正常人不同的单链条带,即克山病患者的28号外显子存在突变。结论克山病患者心肌Na 通道基因SCN5A的结构与正常人存在差异,SCN5A基因突变可能是导致克山病患者对环境因素易感性增加的因素之一。     

中国人Brugada综合征SCN5A基因突变K317N的定点诱变及其载体构建

目的 对我们发现的中国人Brugada综合征新的SCN5A基因突变K317N进行体外定点诱变研究，并构建携带有基因突变K317N的pRc／CMV-hH1的表达载体。方法 采用PCR定点突变技术，根据突变位置附近的两个单一限制性内切酶位点AgeI／Sse83871设计一对定点诱变引物，将突变位点设计在引物上，通过PCR扩增，使扩增片段上含有所需要的突变位点，最后将扩增片段克隆人pRc／CMV-hH1载体中。结果 DNA测序表明，在预期位点巳经发生突变，SCN5A基因在第317密码子由赖氨酸(K)突变为天冬氨酸(N)，成功实现定点诱变。结论 PCR技术诱导定点突变，准确、高效。pRc／CMV-hH1(K31714)的成功构建，为进一步进行该突变的结构与功能研究奠定了基础。     

镉诱导人胚肾细胞损伤分子机理的初步研究

目的：初步探讨镉诱导人胚肾细胞损伤的细胞分子机理。方法：采用MTT法，观察镉对人胚肾细胞损伤的影响；用流式细胞仪检测镉诱导人胚肾细胞凋亡；用分光光度计检测镉对肾细胞SOD活性的影响。结果：几种不同剂量的镉加入细胞作用24h，48h,72h后均能损伤肾细胞，抑制细胞生长；镉能诱导人胚肾细胞凋亡。并且能降低肾细胞SOD活性。结论：镉对人胚肾细胞生长有一定的抑制作用，能诱导人胚肾细胞凋亡及抑制肾细胞SOD活性。     

电压门控性钠通道Nav1.7 及其特异性阻断剂在神经病理性痛中的研究进展

电压门控性钠通道（voltage gated sodium channel,Nav）在痛觉的产生和传导中具有重要作用。在痛觉传导通路中,Nav1.7选择性表达于小直径外周感觉神经元和交感神经节神经元,可通过强化阈下刺激并设定Nav1.8和Nav1.9激活开放的阈值,从而影响神经元兴奋性。该本综述将重点阐述由Nav1.7通道基因突变所致的神经病理性痛的研究进展。Nav1.7可作为治疗疼痛的有效靶点,高选择性的Nav1.7阻断剂将对治疗疼痛具有重要的临床应用价值。     

玻璃化冷冻法保存人类胚胎干细胞

[目的]探讨玻璃化冷冻方法保存人类胚胎干细胞的效率.[方法]冷冻保存人类胚胎干细胞,按冷冻方法的不同分为玻璃化冷冻组和慢速冷冻组,比较两组解冻后人类胚胎干细胞的细胞复苏率、克隆生长与分化情况,并比较分析解冻后的与未经冷冻的胚胎干细胞的生长、分化情况,鉴定解冻后人类胚胎干细胞的全能性.[结果]玻璃化冷冻组与慢速冷冻组解冻后的细胞复苏率分别为81.9%和22.8%(P＜0.001).慢速冷冻组解冻后克隆生长较玻璃化冷冻组缓慢且更易分化.两组未分化的胚胎干细胞继续培养的生长与分化情况一致.玻璃化冷冻组解冻后第6代人类胚胎干细胞染色体核型正常,SSEA-4、SSEA-3阳性,表达OCT-4基因.人类胚胎干细胞来源的畸胎瘤包含了来源于3个胚层的组织细胞.[结论]玻璃化冷冻是保存人类胚胎干细胞的有效方法,解冻后的干细胞在继续培养过程中仍可保持其正常核型和全能性.     

胚胎干细胞移植在心肌修复中的应用

心脏疾病以高发病率和高病死率著称,严重威胁人类生存及生活质量。最近的研究显示ESC来源的心肌细胞可以在多种动物模型中修复陈旧心肌梗死。这些研究为治疗心脏疾病提供了新颖的组织工程模式。本文主要对近期在心肌损伤动物中胚胎干细胞移植的实验结果进行综述。     

人胚胎干细胞神经分化的方法探讨

【目的】 利用新建系的人胚胎干细胞株SYSU-7,运用胚体形成的方法,探讨不同的分化条件对胚胎干细胞神经分化的影响。【方法】 首先检测人胚胎干细胞株SYSU-7的Oct4、SSEA4(stage-specific embryonic antigen-4)、TRA-1-60和AKP(Alkaline phosphatase)等胚胎干细胞特异性标志物的表达及体内外三胚层分化的能力;之后,应用含20% Knockout Serum Replacement (KSR)的培养液和神经干细胞培养液(neural progenitor medium, NPM)分别诱导细胞形成悬浮的拟胚体(悬浮时间为4 d或7 d),然后将拟胚体贴壁于多聚鸟氨酸(Polyornithine, PO)和纤维粘连蛋白(Fibronectin, FN)包被的培养皿中继续培养4 ~ 10 d。在分化的不同时间点利用免疫荧光染色的方法检测胚胎干细胞和神经细胞相关的标志性抗原。【结果】 SYSU-7胚胎干细胞表达未分化细胞特异性标志Oct4、SSEA4,TRA-1-60,AKP染色呈强阳性,在体内外具有向三胚层分化的潜能;在体外诱导其向神经分化,结果发现KSR培养液比神经干细胞培养液更有利于胚胎干细胞的神经分化,悬浮生长7 d的拟胚体贴壁后出现特征性的玫瑰花环样结构(rosette structure)的时间更早。数量更多。【结论】 SYSU-7细胞系具有自我更新及多向分化潜能等胚胎干细胞特性。本实验为研究人胚胎干细胞的神经分化提供了新的细胞模型和研究思路。     

人类胚胎干细胞研究中的伦理学问题

目的 探讨人类胚胎干细胞研究中的伦理学问题。方法 由人类胚胎干细胞研究所引发的伦理学争论及带来的伦理忧患，导出应注意的医学伦理方面的问题。结果 人类胚胎干细胞研究应遵循一定的伦理原则。结论 医学伦理学应规范和引导人类胚胎干细胞研究。     

HEK293细胞内源性电压门控钾离子通道电生理学特性研究

目的探讨人胚胎肾细胞(HEK293细胞)内源性电压门控钾通道的电生理特性,避免HEK293细胞上内源性离子通道对外源性离子通道表达时的干扰。方法利用全细胞膜片钳技术分析了HEK293细胞内源性电压门控钾通道的电生理特性。结果在HEK293细胞上去极化电压从-80 mV开始可触发1个外向电流。在+100 mV时电流为(422.78±68.87)pA,电流密度为(21.91±3.20)pA/pF。钾通道阻断剂四乙胺(tetraethylammonium,TEA)、4-氨基吡啶(4-aminopyri-dine,4-AP),在将细胞外液钾浓度由4 mmol/L提高到40 mmol/L时,对外向电流有影响。结论正常培养的HEK293细胞本身有内源性的钾通道。该外向电流可能包括了IK、IK1、IKur和Ito。     

小鼠胚胎干细胞无饲养层培养及其生物学特性

目的建立小鼠胚胎干（ES）细胞株S8在无饲养层的条件下短期内连续传代体系,获得大量纯的ES细胞。方法ES-S8细胞无饲养层连续传代后,检测其未分化指标以及多分化潜能。结果ES-S8细胞在无饲养层条件下培养5代,AKP染色、SSEA-1免疫荧光、OCT-4均显阳性,以及经拟胚体（EB）途径自发分化后,能形成多种类型的细胞。结论ES-S8细胞能够在无饲养层条件下培养,至少传5代仍能保持未分化特异性指标和多分化潜能。     

人源饲养层对人胚胎干细胞生长的影响

【目的】 选择最佳人源饲养层,并检测不同组织来源的人源饲养层细胞碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的分泌情况,探讨其水平与人胚胎干细胞(hESCs)生长是否相关&#65377; 【方法】 原代培养包皮真皮&#65380;子宫内膜基质&#65380;绒毛&#65380;输卵管&#65380;胎儿真皮&#65380;胎儿肌肉及胎鼠成纤维细胞(MEFs);按组织来源分为7组(MEFs为对照),同期接种同一株hESCs,从饲养层细胞密度&#65380;丝裂霉素作用时间等,寻找不同饲养层适合hESCs生长的最佳条件;按人体组织分6组,ELISA方法检测各种人源饲养层细胞分泌的bFGF&#65377; 【结果】 根据饲养层细胞生长特性,饲养层从优到劣依次为:包皮&#65380;子宫内膜&#65380;绒毛&#65380;输卵管&#65380;胎皮&#65380;胎肌;根据hESCs生长状况,饲养层排序为:包皮&#65380;输卵管&#65380;子宫内膜&#65380;绒毛&#65380;胎肌&#65380;胎皮&#65377;输卵管&#65380;包皮&#65380;绒毛&#65380;胎肌&#65380;子宫内膜&#65380;胎皮分泌的bFGF(pg&#8226;10-5&#8226;mL-1)分别为13.23 ± 3.39,1.99 ± 0.17,1.40 ± 0.17,2.02 ± 1.59,0.38 ± 0.28,0.29 ± 0.29&#65377;输卵管与其它组织细胞分泌的bFGF差异均有统计学意义(P < 0.01);包皮&#65380;绒毛&#65380;胎肌之间差异无统计学意义(P > 0.05),与子宫内膜&#65380;胎皮差异有统计学意义(P < 0.05);子宫内膜与胎皮之间差异无统计学意义(P > 0.05)&#65377; 【结论】 包皮来源的饲养层最佳,输卵管细胞分泌的bFGF量最高,饲养层细胞自身分泌的bFGF和hESCs生长无必然相关性&#65377;     

人成纤维细胞对人胚胎干细胞生长的支持作用

目的观察人成纤维细胞对人胚胎干细胞（hESC）生长的支持作用，建立完全非动物源性培养系统。方法采用人包皮成纤维细胞为饲养层，以血清替代品取代动物血清，支持人胚胎干细胞生长，观察其增殖和分化情况。结果包皮成纤维细胞能很好地支持人胚胎干细胞生长增殖，并保持87％左右未分化表型：碱性磷酸酶（AKP）染色强阳性，阶段特异性胚胎抗原3（SSEA-3），肿瘤排斥抗原160（TRA-1-60）表达强阳性，可见转录因子OCT-4mRNA表达。核型正常，体外能形成拟胚体。结论人成纤维细胞完全可以支持人胚胎干细胞增殖，可望为胚胎干细胞定向诱导分化应用于临床打下基础。     

不同滋养层对维持人胚胎干细胞的生长作用

目的 比较不同滋养层对保持连续传代培养的人胚胎干细胞(hESC)不分化和高增殖能力作用的差异.方法 分别用小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)、人包皮成纤维细胞(hFF)、人骨髓间充质细胞(hMSC)作为滋养层培养hESC系H9细胞,采用碱性磷酸酶染色和台盼蓝染色观察不同滋养层支持的hESC的碱性磷酸酶阳性克隆数、细胞产量和细胞存活率,并采用免疫荧光染色对传代5代以后的hESC进行生物学鉴定.结果 3种滋养层细胞均可维持hESC呈克隆样生长,但是不同滋养层支持的克隆的形态差异大.3种滋养层细胞支持的hESC的大鼠抗阶段特异性胚胎抗原-3及碱性磷酸酶染色均呈阳性.MEF支持的hESC的碱性磷酸酶阳性克隆数、细胞产量和细胞存活率均显著高于人来源滋养层(均P<0.01).hMSC支持的hESC的碱性磷酸酶阳性克隆数、细胞产量均显著高于hFF的hESC(均P<0.01).结论 3种滋养层细胞均可支持hESC的正常生长.MEF最有利于hESC的增殖,但是两种人来源滋养层细胞为去除动物源性的hESC培养体系奠定了基础.在维持hESC增殖方面,hMSC优于hFF.