siRNA沉默结缔组织生长因子对鼠肝星状细胞生物学特性的影响

目的研究化学合成的小干扰RNA（483 siRNA）对大鼠原代肝星状细胞（HSCs）结缔组织生长因子（CTGF）蛋白表达及细胞生物学特性的影响。方法以胶原酶原位灌注消化、密度梯度离心分离大鼠原代HSCs,以脂质体Oligofectamine包裹483 siRNA转染培养72h的原代HSCs作为转染组,并设空白对照组。收集孵育96h的HSCs及培养上清液,采用Western blotting、免疫细胞化学染色、MTT和RT—PCR法分别检测细胞CTGF蛋白表达、α-SMA表达、细胞增殖和Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA表达;放射免疫法检测培养上清液中透明质酸及Ⅲ型前胶原含量。结果与对照组比较,转染组HSCs的CTGF蛋白表达下调（92±5）％,α—SMA染色阳性细胞减少（58±6）％,细胞增殖活性下调（18±5）％,Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA表达分别下调（53±6）％和（41±7）％;培养上清中透明质酸和Ⅲ型前胶原含量分别降低（48±5）％和（33±8）％。结论483 siRNA能显著下调原代HSCs CTGF蛋白表达,并由此抑制细胞活化、增殖及细胞外基质的合成和分泌。提示针对CTGF靶位的siRNA可能具有防治肝纤维化的潜力。     

靶向leptin基因的siRNA对大鼠肝星状细胞生物学特性的影响

目的 构建具有特异性瘦素（leptin）基因小于扰RNA（small interfering RNA，siRNA）功能的表达质粒，研究靶向leptin基因的siRNA对大鼠肝星状细胞（hepatic stellate cell，HSC）中leptin表达及HSC生物学特性的影响。方法 以leptin为目的基因，以产生siRNA质粒载体psiRNA-hHlneo为表达模板，细胞内转录合成4对特异的siRNA和1对对照siRNA。构建能在真核细胞中表达的重组质粒leptinsi RNA，用酶切方法和测序法对重组体进行鉴定。应用脂质体介导重组质粒转染HSC。RT-PCR、Western blot和免疫细胞化学法检测HSC的leptin表达情况，用MTT法检测细胞增殖，用流式细胞仪分析细胞凋亡。结果 酶切和序列测定表明，成功构建了leptinsiRNA表达质粒；外源重组质粒siRNA3和siRNA4能够抑制leptinm RNA和蛋白表达（均P〈0．01）；HSC增殖活性显著降低（P〈0．05），凋亡增加（P〈0．01）。与未转染组相比，consiRNA、siRNA1和siRNA2转染组没有显著改变（均P〉0．05）。结论 构建的leptinsi RNA表达载体可减少leptin的表达，抑制HSC增殖并诱导其凋亡。为肝纤维化基因治疗提供了新的靶点。     

siRNA沉默结缔组织生长因子对鼠肝星状细胞生物学

目的研究化学合成的小干扰RNA(483 siRNA)对大鼠原代肝星状细胞(HSCs)结缔组织生长因子(CTGF)蛋白表达及细胞生物学特性的影响。方法以胶原酶原位灌注消化、密度梯度离心分离大鼠原代HSCs,以脂质体Oligofectamine包裹483siRNA转染培养72 h的原代HSCs作为转染组,并设空白对照组。收集孵育96 h的HSCs及培养上清液,采用Western blotting、免疫细胞化学染色、MTT和RT-PCR法分别检测细胞CTGF蛋白表达、α-SMA表达、细胞增殖和Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA表达;放射免疫法检测培养上清液中透明质酸及Ⅲ型前胶原含量。结果与对照组比较,转染组HSCs的CTGF蛋白表达下调(92±5)%,α-SMA染色阳性细胞减少(58±6)%,细胞增殖活性下调(18±5)%,Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA表达分别下调(53±6)%和(41±7)%;培养上清中透明质酸和Ⅲ型前胶原含量分别降低(48±5)%和(33±8)%。结论483 siRNA能显著下调原代HSCsCTGF蛋白表达,并由此抑制细胞活化、增殖及细胞外基质的合成和分泌。提示针对CTGF靶位的siRNA可能具有防治肝纤维化的潜力。     

siRNA沉默结缔组织生长因子对鼠肝星状细胞生物学

目的 研究化学合成的小干扰RNA(483 siRNA)对大鼠原代肝星状细胞(HSCs)结缔组织生长因子(CTGF)蛋白表达及细胞生物学特性的影响.方法 以胶原酶原位灌注消化、密度梯度离心分离大鼠原代HSCs,以脂质体Oligofectamine包裹483siRNA转染培养72 h的原代HSCs作为转染组,并设空白对照组.收集孵育96 h的HSCs及培养上清液,采用Western blotting、免疫细胞化学染色、MTT和RT-PCR法分别检测细胞CTGF蛋白表达、α-SMA表达、细胞增殖和Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA表达;放射免疫法检测培养上清液中透明质酸及Ⅲ型前胶原含量.结果 与对照组比较,转染组HSCs的CTGF蛋白表达下调(92±5)%,α-SMA染色阳性细胞减少(58±6)%,细胞增殖活性下调(18±5)%,Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA表达分别下调(53±6)%和(41±7)%;培养上清中透明质酸和Ⅲ型前胶原含量分别降低(48±5)%和(33±8)%.结论 483 siRNA能显著下调原代HSCsCTGF蛋白表达,并由此抑制细胞活化、增殖及细胞外基质的合成和分泌.提示针对CTGF靶位的siRNA可能具有防治肝纤维化的潜力.     

SHP2过表达抑制人肝星状细胞LX-2凋亡

目的 探讨含SH2结构域的蛋白酪氨酸磷酸酶2(SHP2)过表达对人肝星状细胞LX-2凋亡的影响。方法 将表达绿色荧光蛋白（GFP）的空病毒Ad-GFP、表达野生型SHP2及GFP的腺病毒Ad-SHP2转染LX-2细胞。实验分为3组：(1)Control组,以DMEM代替腺病毒转染LX-2细胞;(2)Ad-GFP组,转染空病毒Ad-GFP;(3)Ad-SHP2组,转染重组腺病毒Ad-SHP2。Western blotting检测3组LX-2细胞的SHP2、Bax、Bcl-2蛋白表达;实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测3组LX-2细胞的SHP2 mRNA表达;TUNEL及膜联蛋白-V/碘化丙啶双标记流式细胞术检测3组LX-2细胞凋亡情况。结果 Ad-SHP2组LX-2细胞的SHP2蛋白及mRNA相对表达量高于Control组及Ad-GFP组（P <0.05）;Ad-GFP组与Control组比较,差异无统计学意义（P>0.05）。TUNEL及膜联蛋白-V/碘化丙啶双标记流式细胞术检测结果显示,与Control组LX-2细胞凋亡率（3.08±0.73）%、（9.44±...     

RNAi干扰HMGB1基因对乳腺癌细胞MCF-7增殖的影响

目的 探讨高迁移率族蛋白1 (high mobility group box 1,HMGB1 )siRNA干扰后对乳腺癌细胞MCF-7增殖的影响.方法 构建靶向HMGB1 mRNA的质粒载体pRI-GFP-1、pRI-GFP-2以及阴性对照载体pRI-GFP-Neg,分别转染乳腺癌细胞MCF-7,48 h、72 h后免疫印迹法(Western blot)检测HMGB1基因蛋白表达,噻唑蓝(MTT)比色法检测体外增殖活性.结果 转染后,与空质粒组pRI-GFP-Neg相比,pRI-GFP-1组、pRI-GFP-2组MCF-7细胞HMGB1蛋白表达下降,MTT显示干扰组细胞增殖速率与质粒对照及空白对照组相比显著降低.结论 应用RNAi技术可以显著干扰HMGB1蛋白的表达,进而有效抑制MCF-7细胞的增殖活性.     

Smad2特异性siRNA转染肝星状细胞的效率检测

[目的]提高siRNA表达载体在肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSCs)中的转染效率。[方法]pEGFP-C1-CR4转染原代HSCs、HSC-T6细胞株,实验根据质粒DNA和阳离子脂质体的不同比例分为4组:1μg/0μL、1μg/1μL、1μg/2μL、1μg/4μL,1μg/0μL为对照组,其余3组为实验组。转染48 h后,使用荧光显微镜观察转染情况,同时流式细胞仪计算转染效率。[结果]质粒DNA和阳离子脂质体的比例为1μg/2μL和1μg/4μL时,原代HSCs转染效率为(56.55±3.12)%和(58.62±2.03)%(P>0.05),HSC-T6细胞株转染效率为(24.52±3.55)%和(25.49±2.33)%(P>0.05)。同样比例条件下,原代HSCs的转染效率显著高于HSC-T6细胞株的转染效率(P<0.05)。在实验组质粒、脂质体比例为1μg/2μL和1μg/4μL时,同种细胞的转染效率均无显著差别(P>0.05)。[结论]采用质粒DNA和阳离子脂质体的比例为1μg/2μL、1μg/4μL的条件,均能够在HSCs和HSC-T6中获得最佳转染效率,但前者更为经济。     

siRNA抑制RASSF1A表达对Hela细胞增殖和凋亡的影响

目的探讨RASSF1A基因的特异性小干扰RNA(siRNA)对宫颈癌Hela细胞系生长增殖及凋亡的影响。方法采用LipofectamineTM2000介导的脂质体法将特异性siRNA瞬时转染进Hela细胞,半定量RT-PCR检测转染前后RASSF1A mR-NA表达变化,免疫细胞化学法检测RASSF1A蛋白表达水平变化,MTT法检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡情况。结果 RT-PCR与免疫细胞化学检测结果显示,转染siRNA后RASSF1A基因的表达下降,细胞增殖加快,而细胞凋亡率则显著降低。结论靶向RASSF1A基因的siRNA可有效降低宫颈癌Hela细胞中该基因的表达,用于RASSF1A基因功能研究;RASSF1A基因表达下调促进细胞增殖,同时导致细胞凋亡减少。     

慢病毒为载体的siRNA抑制肝星状细胞TIMP-1的表达

目的观察以慢病毒为载体,用含有针对大鼠金属蛋白酶组织抑制因子(tissue inhibitor of metalloproteinase-1,TIMP-1)、具有较强抑制作用的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)感染大鼠肝星状细胞系HSC-T6后对TIMP-1表达的抑制作用。方法针对大鼠TIMP-1 mRNA基因序列挑选2个不同短片段(nt161～181和nt445～463),在体外构建为短发夹siRNA1、siRNA2表达载体后,将其包装为重组Lenti/siRNA1-TIMP-1/GFP和Lenti/siRNA2-TIMP-1/GFP,同时包装阴性对照Lenti/GFP(空载体组),并以滴度MOI=10感染大鼠肝星状细胞系HSC-T6,感染后3d,用流式细胞仪及荧光显微镜检测病毒的感染效率。分别在感染后7、9d用Western blotting方法检测TIMP-1蛋白表达情况。结果感染HSC-T6后细胞形态和增生速度未发生明显变化。流式细胞仪及荧光显微镜检查证实感染效率分别为:空载体组68.23%,siRNA1感染组57.93%,siRNA2感染组51.2%,与正常细胞相比,感染后7d和9d,siRNA1、siRNA2感染组TIMP-1蛋白表达均有所下降,但只有siRNA1感染组在感染后9d能显著抑制TIMP-1表达,差异有统计学意义(P<0.05)。结论构建的重组Lenti/siRNA-TIMP-1/GFP可短期有效抑制大鼠肝星状细胞系HSC-T6TIMP-1蛋白表达。     

Reversine对人肝星状细胞系LX-2凋亡的影响

目的探讨Reversine对人肝星状细胞系LX-2凋亡的影响。方法设对照组和Reversine干预组,其中Reversine干预组分为7个浓度,分别为1,5,10,20,40,80,120μg/m L,CCK-8法检测Reversine对LX-2增殖的影响,选取最佳浓度。将细胞重悬在加入5μL FITC-Annexin V和5μL PI,用流式细胞仪进行了凋亡率分析,免疫荧光检测凋亡蛋白bcl-2及caspase 3。结果 Reversine可促进LX-2细胞凋亡,随着Reversine浓度增加,LX-2的凋亡可呈剂量依赖关系,其中10μg/m L为最佳浓度,LX-2细胞的bcl-2蛋白的表达显著下降而cleaved-caspase 3的表达显著上升。结论 Reversine可通过促进caspase-3蛋白活化、抑制bcl-2蛋白表达的方式诱导LX-2凋亡。     

人脂联素真核表达质粒构建及其在LX-2中的表达

目的构建人全长脂联素真核表达质粒,转染人肝星状细胞系(LX-2),观察其表达及分泌情况,为脂联素在肝纤维化作用的基础及临床研究提供实验数据。方法提取人脂肪组织mRNA,用RT-PCR扩增出添加酶切位点的人全长脂联素基因片段,双酶切扩增出的目的基因片段及空载体质粒P7,将酶切后的片段进行连接、转化构建质粒。用FuGENE HD将构建成功的质粒转染LX-2细胞,用免疫荧光观察其转染效率及细胞定位,Western blotting检测脂联素蛋白表达。结果酶切及测序证实成功构建人全长脂联素真核表达质粒,免疫荧光检测转染效率约为40%,Western blotting检测到30000处存在目的蛋白表达,与预期相对分子质量一致。结论成功构建的人全长脂联素真核表达质粒能有效转染LX-2细胞及表达脂联素蛋白。     

IL-10-HGF融合基因对肝星状细胞LX-2增殖的抑制作用

目的探讨人白介素-10（IL-10）与人肝细胞生长因子（HGF）融合基因对肝星状细胞LX-2增殖的抑制作用。方法采用PCR方法,分别构建pcDNA3.1-flag-IL-10、pcDNA3.1-flag-HGF与pcDNA3.1-flag-IL-10-HGF真核表达载体,瞬时转染肝星状细胞LX-2;利用RT-PCR和Western blot检测LX-2细胞中IL-10、HGF的表达;选用MTT法检测转染24、48和72 h 后LX-2细胞的增殖情况。结果成功构建了IL-10-HGF融合基因真核表达载体pcDNA3.1-flag-IL-10-HGF。与pcDNA3.1-flag-IL-10和pcDNA3.1-flag-HGF组比较,pcDNA3.1-flag-IL-10-HGF融合组48 h和72 h LX-2细胞数减少（n=3,P＜0.05）。 结论IL-10-HGF融合基因可有效抑制肝星状细胞LX-2的增殖。     

黄芪多糖和黄芪总甙调控LX-2细胞因子分泌

目的:用黄芪多糖和黄芪总甙对LX-2细胞分泌的与纤维化相关的主要细胞因子进行研究,以探讨黄芪抗纤维化的确切分子机制。方法:不同浓度的黄芪多糖和黄芪甙作用于LX-2细胞,以Real Time Cell Electronics Sensing技术实时检测细胞增殖状态;分别再以25μg/ml和300μg/ml的黄芪多糖和黄芪总甙作用LX-2细胞24 h,提取细胞mRNA,以荧光定量PCR测定转化生长因子1(TGF-β1)、肝细胞生长因子(HGF)、基质金属蛋白酶2(MMP2)及基质金属蛋白酶9(MMP9)mRNA的变化。结果:300μg/ml的黄芪多糖可抑制LX-2的增殖(P<0.05,94.7 h),但不同浓度的黄芪总甙对LX-2细胞均有促进增殖的作用(P<0.05);25μg/ml的黄芪多糖和黄芪总甙在TGF-β1促进分泌的同时,也上调其它抗纤维化因子,其中黄芪多糖对MMP2的上调(104.9倍)、黄芪总甙对IL-10的上调(550.65倍)最为显著;300μg/ml的黄芪多糖可抑制TGF-β1及HGF、MMP9、IL-10的表达,但仍然上调MMP2的表达,300μg/ml的黄芪总甙也可抑制TGF-β1的表达,但对抗纤维化因子MMP2、MMP9及IL-10仍有明显的上调作用。结论:低浓度(25μg/ml)和高浓度(300μg/ml)的黄芪多糖和黄芪总甙可通过不同的分子机制调控肝星状细胞因子的分泌而发挥抗纤维化作用;黄芪多糖主要以促进MMP2分泌为主,而黄芪总甙则主要通过上调MMP2、MMP9及IL-10的分泌而发挥作用。高剂量的黄芪多糖和总甙抗纤维化效果优于低剂量组。     

LX-2与HK-2细胞共培养模型的建立及对其细胞转分化的影响

[目的]建立人肝星状细胞(LX-2)与人肾小管上皮细胞(HK-2)共培养体系的理论模型,研究LX-2对HK-2转分化的影响。[方法]以Transwell小室建立体外LX-2细胞和HK-2细胞间接共培养体系。应用细胞免疫组织化学法检测HK-2细胞平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达;用酶联免疫吸附法(ELISA法)检测各组细胞培养液中转化生长因子-β1(TGF-β1)的含量;逆转录-聚合酶链反应法(RT-PCR法)检测HK-2细胞TβRⅠm RNA、TβRⅡm RNA、Smad2 m RNA、Smad3 m RNA、Smad7 m RNA的表达。[结果]除了空白组,形态学上其他两组均可看到HK-2细胞胞浆染棕黄色,不同数量细胞由立方铺路石样转变为梭形长条状,细胞肥大;HK-2细胞高表达α-SMA(P0.01);HK-2细胞上清液中TGF-β1含量明显高于空白组(P0.01);HK-2细胞TβRⅠ、Smad2、Smad3基因表达明显上调,而TβRⅡ、Smad7基因表达明显下调。[结论]Transwell共培养法可诱导HK-2细胞转分化,其机制可能与TGF-β1/Smad信号通路有关。     

虎杖苷抑制肝星状细胞增殖活化的作用和机制研究

目的:研究虎杖苷 (Polydatin) 在体外对HSC-T6细胞的影响,探讨虎杖苷抑制肝纤维化发生的作用及相关机制。方法:体外培养大鼠肝星状细胞HSC-T6,分为对照组和虎杖苷低、中、高浓度（125、250、500 μmol/L）给药组。MTT法检测细胞增殖情况;比色法检测细胞培养上清液中乳酸脱氢酶（LDH）的活性;酶消化法检测细胞培养上清液中羟脯氨酸（Hyp）的含量;蛋白印迹法检测α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、Ⅰ型胶原（CollagenⅠ）、核因子NF-E2相关因子2（Nrf2）和血红素加氧酶-1（HO-1）蛋白表达水平。多组间比较采用单因素方差分析,若方差齐则采用LSD检验,若方差不齐采用Dunnett T3检验,以P<0.05认为差异有统计学意义。结果:与对照组比较,虎杖苷125、250、500 μmol/L给药组细胞活力显著降低（F=252.01, P<0.001）,Hyp含量明显减少（F=16.50,P<0.05）,α-SMA和CollagenⅠ蛋白表达显著减少（F=19.89、182.91, 均P<0.05）,且随着浓度的增加,抑制作用越强,呈一定的剂量依赖性;与对照组比较,虎杖苷125、250、500 μmol/L给药组Nrf2蛋白表达显著增加（F=23.70,P<0.05）,虎杖苷250、500 μmol/L给药组HO-1蛋白表达显著增加（F=12.40,P<0.01）,且随着浓度增加,上调作用越明显,呈一定的剂量依赖性。结论:虎杖苷通过抑制肝星状细胞增殖活化及胶原合成发挥抑制肝纤维化发生的作用,该作用可能与其上调Nrf2/HO-1通路有关。     

神经酰胺诱导LX-2细胞凋亡抑制肝纤维发生的作用

目的:探讨神经酰胺对人源肝星状细胞株（HSCs）LX-2的影响以及在肝纤维化治疗中的作用,为寻求肝纤维化治疗的新方法提供理论依据。方法:体外培养人源肝星状细胞LX-2,分为正常细胞对照组及给药组（C2终浓度为30、45、60 μmol/L）,应用神经酰胺从头合成途径的限速酶即丝氨酸棕榈酰转移酶的特异性抑制剂多球壳菌素（myriocin）进一步分析神经酰胺的作用。四甲基偶氮唑盐（MTT）法检测LX-2的细胞增殖情况,酶消化法测定上清中羟脯氨酸（Hyp）的含量,比色法检测乳酸脱氢酶（LDH）的活性,Western blot法检测bax、bcl-2及caspase-3的蛋白表达量。结果:C2各浓度组对LX-2的增殖均有明显的抑制作用,且具有剂量依赖性（P<0.05）;LX-2经C2处理后细胞内羟脯氨酸含量显著下降（P<0.05）;LDH活性与对照组比较均无显著性差异;C2下调LX-2中抗凋亡蛋白bcl-2的表达,上调促凋亡蛋白bax与凋亡执行效应分子caspase-3的表达（P<0.05）,bax/bcl-2比值增大。但是,以myriocin 15 μmol/L作用LX-2细胞24 h后,细胞增殖较对照组增多,羟脯氨酸的含量明显升高（P<0.05）;LDH活性与对照组比较无显著性差异;bcl-2蛋白表达上调,bax、caspase-3蛋白表达下调（P<0.05）,bax/bcl-2比值减小。结论:神经酰胺可通过上调bax和caspase-3的表达,下调bcl-2的表达而诱导LX-2细胞凋亡,同时抑制其增殖,从而减少羟脯氨酸的生成,产生抑制肝纤维发生的作用。     

黄芩甙对肝星状细胞凋亡的影响

目的 研究黄芩甙对大鼠肝星状细胞(HSC)凋亡的影响,探讨黄芩甙抗肝纤维化的机制.方法 采用胶原酶循环灌流法分离肝星状细胞.以不同浓度黄芩甙作用后,通过相差显微镜观察细胞形态变化,用MTT法、溴乙锭/吖啶橙荧光染色法、流式细胞术检测黄芩甙对活化的HSC凋亡的影响.结果 黄芩甙显著促进活化的HSC凋亡,此作用随黄芩甙浓度增加而增强,呈药物浓度依赖关系.结论 黄芩甙可以促进HSC凋亡,减少活化HSC的总量,发挥其抗肝纤维化作用.