大肠杆菌丁醇生产菌的构建及检测

用合成生物学和代谢工程技术,筛选并克隆丁醇合成途径中酶活性较高的atoB,hbd,crt,ter,adhE2等5个关键酶基因,先通过重组PCR构建pUC18-ato B-hbd-crt-ter质粒,再将串联基因atoB-hbd-crt-ter和基因adhE2克隆至质粒pET-21b中,构建含丁醇合成途径的表达载体p ET-21b-ato B-hbd-crt-ter-adh E2,将其转入大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中制备工程菌株.对样品进行IPTG诱导表达检测与色谱分析的结果表明,已合成出关键酶蛋白并产生一定量的丁醇.     

高产光学纯(R)-乙偶姻工程菌株的构建与发酵工艺优化

本研究拟在大肠杆菌中构建光学纯(R)-乙偶姻的合成途径和利用辅酶工程调控NADH/NAD+氧化还原平衡,并对工程菌发酵(R)-乙偶姻进行优化。将来源于Enterobacter cloacae的α-乙酰乳酸合成酶基因budB、α-乙酰乳酸脱羧酶基因budA和来源于Lactobacillus brevis的NADH氧化酶基因noxE进行密码子优化后组成基因簇,构建表达质粒并导入大肠杆菌,进一步优化工程菌的培养基成分和发酵条件,提高(R)-乙偶姻的合成能力。结果表明:获得专一性合成高光学纯(R)-乙偶姻的大肠杆菌工程菌株GXASR,对其发酵条件进行系统优化后,摇瓶发酵的(R)-乙偶姻产量为36.82g/L,光学纯度达99.1%,发酵罐补料发酵的(R)-乙偶姻产量达到67.65g/L。在大肠杆菌细胞中过表达外源基因簇budB-budA-noxE能够高效合成光学纯(R)-乙偶姻,经发酵优化后,工程菌的(R)-乙偶姻产量、生产强度和得率均显著提高,为代谢工程改造大肠杆菌生产高光学纯(R)-乙偶姻提供了理论基础。     

产丁醇重组大肠杆菌的构建及初步发酵

将丙酮丁醇梭菌ATCC 824丁醇合成途径中分别编码硫解酶(THL)、3-羟基丁酰-CoA脱氢酶(HBD)、巴豆酸酶(CRT)、丁酰-CoA脱氢酶(BCD)和醛/醇脱氢酶(BDH)的关键基因thil、hbd、crt、bcd-etfB-etfA、adhE在大肠杆菌中进行重组表达,构建出3株产丁醇的重组大肠杆菌JM109-99d、DL1346 99d和AFP111-99d。选取摇瓶发酵产丁醇最高(0.52 g/L)的重组大肠杆菌DL1346-99d进行上罐发酵,丁醇产量可达1.07g/L。     

丙烯酰CoA合成酶在大肠杆菌中的表达及其酶活性表征

以橙色绿屈挠菌（Chloroflexus aurantiacus）dsm636基因组DNA为模板,应用PCR技术扩增并克隆了丙烯酰CoA合成酶（ACS）基因,并连接到表达载体pET-22b(+)质粒上,构建了pET-22b(+)-Acs重组质粒,测序结果100%正确。将重组质粒pET-22b(+) Acs转化到大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)中,通过氨苄霉素抗性平板筛选,构建了大肠杆菌BL21(DE3)-pET-22b(+)-Acs基因工程菌。重组菌株经异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导表达,SDS-PAGE电泳分析,目标条带出现在分子量约160000处,表明丙烯酰CoA合成酶基因在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达;体外酶活实验证明,所表达的丙烯酰CoA合成酶是具有活性的。     

工程菌JM—109—pTrcHis2A—phyA表达植酸酶的研究

目的：将来源于黑曲霉的植酸酶基因重组于大肠杆菌表达载体pTrcHis2A中,导入大肠杆菌JM109中,构建工程菌JM－109－pTrcHis2A-phyA。方法：基因重组,以及克隆和外源基因诱导表达 技术。结果：该工程菌能够有效地表达真核植酸酶基因,并且添加诱导剂IPTG,能使植酸酶的表达量成倍提高。结论：该表达系统被用做研究黑曲霉植酸酶体外改良的工具。     

大肠杆菌L-组氨酸生物合成途径的改造及其对工程菌L-组氨酸产量的影响

改造大肠杆菌L–组氨酸生物合成途径,以提高L–组氨酸的产量.用NTG诱变大肠杆菌M-17(SGr),依次赋予其2–噻唑丙氨酸(2-TA)和组氨酸氧肟酸盐(HisHx)遗传标记,再以突变株M-18(SGr+2-TAr+HisHxr)基因组为模板,扩增组氨酸操纵子基因,构建出重组质粒pUC118-his-operon,将重组质粒导入突变株M-18(SGr+2-TAr+HisHxr)得到工程菌E.coli M-19(SGr+2-TAr+HisHxr/pUC118-his-operon).根据zwf和prs基因序列分别合成引物进行PCR扩增,PCR产物与载体pSTV28连接,构建重组质粒pSTV28-zwf、pSTV28-prs和pSTV28-zwf-prs,将重组质粒分别转化至工程菌E.coli M-19,摇瓶发酵测定重组工程菌L–组氨酸的产量.摇瓶发酵结果显示,L–组氨酸产量与对照株相比,工程菌E.coli M-19提高了4.5倍,双质粒系统重组工程菌E.coli MZH-19、E.coli MPH-19和E.coli MZPH-19分别提高了5.14、5.78、8.43倍.     

产碱假单胞菌碱性脂肪酶的克隆表达及酶学性质

【目的】为获得可应用于酯类水解及合成的脂肪酶资源,本研究通过筛选分离得到能够水解长链脂肪酸酯的脂肪酶产生菌,克隆表达其脂肪酶基因并研究脂肪酶的酶学性质。【方法】从环境中筛选分离出可水解三硬脂酸甘油酯的菌株,利用16SrDNA对其进行分子鉴定,并扩增其脂肪酶基因和脂肪酶分子伴侣基因。以pET-22b(+)为表达载体,构建共表达重组质粒,转化Escherichia coli BL21(DE3)进行异源表达,并对重组酶进行酶学性质研究。【结果】经16SrDNA鉴定该菌株为产碱假单胞菌Pseudomonas alcaligenes。通过PCR成功克隆到该菌的脂肪酶基因(lipPA-9A)和脂肪酶分子伴侣基因(lipPA-9B),并构建共表达重组质粒pET22b-lipPA-9A-9B,实现脂肪酶LIP-9A的活性表达。酶学性质研究表明LIP-9A的最适反应温度为35℃,最适反应pH值为10.5,最适反应底物为对硝基苯酚辛酸酯(pNPO);同时,LIP-9A还可以催化醇和羧酸发生酯化反应产生酯类物质。【结论】LIP-9A在碱性条件下具有较高活力,且可以催化酯化反应,在洗涤行业和酯合成领域具有一定的应用价值。     

纤维微菌海藻糖合成酶基因克隆表达及酶学特性鉴定

【目的】开发适用于海藻糖生产的新型海藻糖合成酶。【方法】通过反向PCR技术,从一株纤维微菌的基因组DNA中获知海藻糖合成酶基因完整ORF序列,进而克隆得到纤维微菌海藻糖合成酶基因(CCTreS),将其与表达载体pSE380构建重组质粒后转入大肠杆菌BL-21(DE3)中诱导表达,通过镍柱亲和层析纯化得到纯酶并进行酶学性质测定。【结果】从纤维微菌中克隆并在大肠杆菌中成功表达海藻糖合成酶基因(CCTreS)。经纯化获得的重组酶(CCTreS)在以麦芽糖为底物生成海藻糖时,最适反应pH值为7.0,最适反应温度为45℃,40℃保温1h仍具有80%以上的相对酶活力,在pH值5.5~8.5保存24h,相对酶活力仍保留80%以上。Cu~(2+)对其有明显抑制作用。【结论】该重组酶具有很好的热稳定性和pH稳定性,具有一定的研究价值和潜在的工业应用价值。     

噬夏孢欧文氏菌类crtB基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

噬夏孢欧文氏菌类胡萝卜素合成相关基因crtB,编码八氢番茄红素合成酶。利用PCR技术扩增出crtB基因,克隆进表达载体,构建表达质粒pET-15bcrtB。重组质粒转化大肠杆菌,构建工程菌株。经IPTG诱导,工程菌高效表达了重组八氢番茄红素合成酶,表达量占菌体总蛋白的40%。重组蛋白以包含体形式存在,包含体经洗涤、尿素溶解、复性并经镍离子树脂亲和层析、Superdex 75凝胶层析柱纯化,得到了电泳纯的重组八氢番茄红素合成酶,带有His-tag的该蛋白分子量为35 kDa,pI值为7.3。     

HCV NS3/4A丝氨酸蛋白酶在大肠杆菌中表达、纯化

在大肠杆菌中HCV NS3/4A丝氨酸蛋白酶获得表达并进行纯化.根据NS3与NS4A两者形成异源二聚体的结构要求,并参照文献,通过基因拼接的方法设计了单链NS3/4A丝氨酸蛋白酶的基因.合成相应引物,利用反转录PCR从HCV患者血液中扩增出该蛋白酶的编码基因,克隆入原核表达载体pRSET-A,将重组表达质粒pRSET-A-ns3/4a转化BL211(DE3)大肠杆菌,并诱导表达与纯化.成功地构建了重组表达质粒pRSET-A-ns3/4a;重组质粒转化的BL21工程菌经IPTG诱导表达后,表达产物经SDS-PAGE和western-h1ot证实为NS3/4A丝氨酸蛋白酶,并用镍离子亲和层析方法获得纯化蛋白酶.获得的纯化NS3/4A丝氨酸蛋白酶为建立其酶活性测定系统奠定了基础.     

基于转座子策略提高链霉菌中landomycin E产量的研究

【目的】对影响放线菌链霉菌Streptomyces globisporus产landomycin E(laE)的代谢网络进行研究,以提高次生代谢物的产量。【方法】通过构建含强启动子和抗性标记的转座子Tn7为基础的转座子,整合至S.globisporus的染色体产生突变库,筛选高产量的突变株并对其代谢网络进行研究分析。【结果】利用构建好的Tn7-转座子连续转化链霉菌S.globisporus,经过数轮的突变和筛选,得到6株产量有较大改变的突变株,对整合位点的亚克隆和测序结果表明,该位点整合导致编码类似细菌的某些调节因子如TetR和GntR家族的蛋白的基因失活。【结论】所构建的经过修饰的微型Tn7-转座子不仅带有抗性标记且有启动子,可插入链霉菌染色体产生突变,进而提高次生代谢物laE的产量,同时也证明,转座子基载体可应用于非模式菌链霉菌。     

Construction and characterization of partiallyntrC-deleted mutants inAlcaligenes faecalis

To study the effect of ntrC gene product on the expression and regulation of other important nitrogen-fixing genes in Alcaligenes faecalis, partially ntrC-deleted mutants of A. faecalis have been generated. To start with, the ntrC gene of A. faecalis was cloned into a suicide plasmid pSUP202 to create a recombinant plasmid pSUM1. The ntrC gene in pSUM1 was then replaced by a lacZ-Km^r fragment resulted in the generation of a plasmid pSUM2. The lacZ fragment in pSUM2 was further removed and a plasmid pSUM3 produced. As a second step, the plasmid pSUM2 or pSUM3 was introduced into the wild type of A. faecalis A1501 by conjugation and two partially ntrC-deleted mutants A15CM1 (ntrC∷lacZ) and A15CM2 (ntrC ^- ) were obtained. To understand the regulatory effect of the NtrC on the expression of nifH and nifA, a nifH-lacZ gene or a nifH-lacZ gene was introduced into the ntrC^- mutant by conjugation. The results indicated that: (ⅰ) although the ntrC^-mutant was nif ⁺ , its nitrogen fixation activity was only 20% that of the wild type; (ⅱ) the ntrC^- mutant failed to grow on the medium containing nitrate as a sole nitrogen source; (ⅲ) the regulation of ntrC gene expression did not require its own product; (ⅳ) the expression of nifH in A . faecalis was positively regulated by the ntrC. Deletion of the ntrC resulted in the reduction of nifH expression or even totally inactivated nitrogen fixation; (ⅴ) there was no obvious influence on the expression of nifA in A. faecalis if the ntrC gene was deleted.     

尾巨桉化感作用对广金钱草化学成分的影响

【目的】研究尾巨桉Eucalyptus urophylla×Eucalyptus grandis对广金钱草Desmodium styracifolium(Osb.)Merr.药材化学成分的影响,探索尾巨桉-广金钱草复合经营模式的可行性。【方法】在试验田中,以不同类型和重量的尾巨桉落叶铺盖在土壤上并种植广金钱草,同时另在尾巨桉人工林中直接套种广金钱草,待药材成熟后统计其产量,并利用HPLC指纹图谱法及含量测定法检测其化学成分变化。【结果】广金钱草在尾巨桉林下种植时,产量稍有下降,但药材指纹图谱与正常种植无显著差异。【结论】广金钱草可以套种在尾巨桉人工林下。     

丙酮/(NH4)2SO4双水相体系提取芦丁影响因素研究

【目的】研究丙酮/(NH4)2SO4双水相萃取体系对分离槐米中芦丁的影响因素。【方法】利用正交设计法进行优化,并把28.57%的硫酸铵溶液与等体积的70%的丙酮混合溶液,调至pH=9形成的双水相,两相的体积比(V上/V下)是1.62。【结果】萃取体系的上相中芦丁含量达到95.92%。【结论】丙酮/(NH4)2SO4双水相萃取体系分离芦丁具有良好的选择性。     

三角梅属园林品种筛选及应用

【目的】筛选出适合柳州市城市绿化栽培应用的优良三角梅(Bougainvillea)品种。【方法】根据相关资料及柳州市气候条件进行初步筛选,将初筛品种在柳州园林苗圃中开展繁殖、栽培、生长特性、抗逆性和园林应用试验,以三角梅的观赏价值、抗逆性和繁殖难易程度等因子建立柳州市三角梅属筛选综合评分体系,定性和定量评价三角梅属品种的综合利用价值。【结果】经初步筛选,于2011-2015年从华南地区收集引入20种三角梅品种,综合评分结果显示,有10种品种得分大于20分,决选为柳州市园林绿化应用的三角梅品种,并对决选品种提出了园林配置应用方法。【结论】筛选出的优良品种具有较高的观赏价值,繁殖容易,抗逆性强,适宜在城市园林绿化中推广应用。     

鼠尾藻群体的有性生殖力影响因素研究

【目的】研究鼠尾藻(Sargassum thun bergii)有性生殖相关因子间的关系,分析鼠尾藻群体的有性生殖能力。【方法】通过统计分析方法,研究藻体长度与侧枝数、侧枝长度与生殖托数、生殖托长度与生殖托挂卵数间的关系。【结果】藻体长度与侧枝数、侧枝长度与生殖托数、生殖托长度与生殖托挂卵数间都为线性正相关,利用回归方程推算,1株成熟的鼠尾藻藻体能产生2×105~3.3×106个受精卵。【结论】1株成熟鼠尾藻的产卵量基本可满足1m2的采苗生产需要。     

A tumor suppressor genefhit prokaryotic expression and identification

The recombinant expression vector pGEMD-fhit which contains full encoding region offhit gene was constructed. The recombinant was introduced into the BL21 (DE3) strain ofE. coli and induced by 1 mmol/L IPTG to express a 29×10³ polypeptide offhit fusion protein. And the 29×10³ protein was sensitive and specific in reaction with anti-fhit antibody in Western blot. Foundation item: Supported by the National Natural Science Foundation of China (39770373) Biography: SUN Yan (1975−), female, Master of science, Research direction: gene engineering     

灰毛豆Tephrosia purpurea中查尔酮类化合物的分离鉴定

【目的】为探讨灰毛豆属植物Tephrosia purpurea化学成分中的查尔酮类化合物,对其枝、叶部位进行化学成分分离及结构解析。【方法】采用乙醇提取、溶剂萃取、柱层析分离方法得到多种灰毛豆属T.purpurea化学成分,并用波谱分析手段对其进行结构表征。【结果】从灰毛豆属T.purpurea中共分离鉴定出11个查尔酮类化合物,分别为elatadihydrochalcone(1),spinochalcone A(2),3′,5′-diisopentenyl-2′,4′-dihydroxychalcone(3),candidachalcone(4),O-methylpongamol(5),(+)-tephrosone(6),spinochalcone C(7),epoxyobovatachalcone(8),tunicatachalcone(9),crassichalone(10),(S)-elatadihydrochalcone(11)。【结论】以上化合物均为查尔酮,且均属首次从该植物中分离得到。