RNAi沉默结肠癌细胞LOVO中livin基因的表达

目的:运用RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术阻断结肠癌细胞系LOVO中livin基因的表达,并研究livin基因沉默后对LOVO细胞增殖和克隆形成产生的影响。方法:用真核转录载体pSilencerTM4.1-CMV neo构建针对livin基因的重组RNAi真核转录载体pSilencer4.1-L1和pSilencer4.1-L2,脂质体法转染结肠癌细胞系LOVO,通过RT-PCR、免疫印迹实验检测livin的表达变化,并用克隆形成实验、MTT法检测转染后LOVO细胞在细胞增殖、克隆形成等方面的变化。结果:重组载体pSilencer4.1-L1有效地阻断了LOVO细胞中livin基因在mRNA和蛋白水平上的表达(P<0.01)。pSilencer4.1-L1转染LOVO细胞后,与对照组相比细胞生长速度明显变慢,其细胞数在72h时与对照组相比减少约30%;克隆形成率仅为15%,与对照组相比下降了约70%。结论:成功构建了可有效沉默livin基因的RNAi干涉载体,初步证明livin基因在结肠癌细胞的分化增殖等方面所起的重要作用,为进一步阐明livin基因与结肠癌的关系以及以livin基因为靶点的结肠癌基因治疗研究奠定了基础。     

RNAi沉默结肠癌细胞LOVO中livin基因的表达

目的：运用RNA干扰（RNA interference,RNAi）技术阻断结肠癌细胞系LOVO中livin基因的表达,并研究livin基因沉默后对LOVO细胞增殖和克隆形成产生的影响。方法：用真核转录载体pSilencerTM4.1-CMV neo构建针对livin基因的重组RNAi真核转录载体pSilencer4.1-L1和pSilencer4.1-L2,脂质体法转染结肠癌细胞系LOVO,通过RT-PCR、免疫印迹实验检测livin的表达变化,并用克隆形成实验、MTT法检测转染后LOVO细胞在细胞增殖、克隆形成等方面的变化。结果：重组载体pSilencer4.1-L1有效地阻断了LOVO细胞中livin基因在mRNA和蛋白水平上的表达（P〈0.01）。pSilencer4.1-L1转染LOVO细胞后,与对照组相比细胞生长速度明显变慢,其细胞数在72h时与对照组相比减少约30%;克隆形成率仅为15%,与对照组相比下降了约70%。结论：成功构建了可有效沉默livin基因的RNAi干涉载体,初步证明livin基因在结肠癌细胞的分化增殖等方面所起的重要作用,为进一步阐明livin基因与结肠癌的关系以及以livin基因为靶点的结肠癌基因治疗研究奠定了基础。     

生存素siRNA对结肠癌细胞凋亡增殖和侵袭性的影响

目的:研究siRNA表达质粒沉默Survivin基因的效率及其对大肠癌细胞株SW480凋亡、增殖和侵袭性的影响。方法:构建Survivin基因的siRNA表达质粒(pRNAT/sur-siRNA),用Westeron-blot和半定量RT-PCR研究该表达质粒转染SW480后Survivin蛋白和mRNA表达的变化,流式细胞仪检测Survivin基因沉默后SW480细胞凋亡的变化,MTT法检测SW480细胞体外增值的变化;细胞侵袭性实验研究SW480细胞的侵袭性变化。结果:针对Survivin的siRNA的表达质粒下调大肠癌SW480细胞株Survivin蛋白和mRNA的表达水平,分别为85.0%,80.0%;pRNAT/sur-siRNA转染SW480后,SW480细胞凋亡率为16.9%;细胞增殖抑制率为37.4%,与对照组相比有显著差异(P<0.01);细胞侵袭实验示pRNAT/sur-siRNA/SW480细胞、pRNAT/SW480、SW480细胞的细胞穿透数分别为153±66、505±65、578±98个,(P<0.01)。结论:针对Survivin的siRNA可以显著降低Survivin的表达,从而抑制肿瘤细胞的增殖和侵袭,促进肿瘤细胞的凋亡。     

沉默 AQP-5 对人结肠癌HT-29细胞的增殖、凋亡及其化疗敏感性的影响

目的： 探讨小干扰RNA（small interference RNA,siRNA）沉默水通道蛋白-5（aquaporin-5, AQP-5 ）的表达对人结肠癌HT-29细胞增殖、凋亡及化疗药敏感性的影响。 方法： 以合成的AQP-5-siRNA序列转染HT-29细胞,采用Western blotting检测AQP-5-siRNA的转染效率,磺酰罗丹明（sulphorhodamine B, SRB）染色法检测各组细胞的增殖抑制率,流式细胞术检测HT-29细胞的凋亡。分光光度法检测HT-29细胞caspase-3活性,real-time PCR和Western blotting检测AQP-5-siRNA转染后HT-29细胞中 PCNA和P53 在mRNA和蛋白水平的表达。选用5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil,5-FU）和顺铂（cisplatin,DDP）刺激AQP-5-siRNA转染细胞,SRB染色法检测细胞的增殖抑制率,以金正均法计算两药联合作用的Q值。 结果： 与NC-HT-29细胞相比,AQP-5-siRNA-HT-29细胞中AQP-5蛋白的表达显著下降（P<0.05）。SRB检测显示,AQP-5-siRNA-HT-29细胞的增殖抑制率显著增加\[（9.23±0.51)% vs 0,P<0.05\]。流式细胞术检测显示,AQP-5-siRNA-HT-29细胞的凋亡率显著升高\[（1081±1.32)% vs (0.99±0.18）%, P<0.05\];caspase-3活性显著升高\[（0.19±0.03） vs （009±0.01）, P<0.05\]。Real-time PCR和Western blotting结果显示,AQP-5-siRNA-HT-29细胞中PCNA mRNA和蛋白表达明显下降（P<0.05）,同时,P53 mRNA和蛋白表达明显上升（P<0.05）。AQP-5-siRNA+5-FU组细胞的增殖抑制率显著高于AQP-5-siRNA组和5-FU组\[（44.93±2.28)% vs (9.11±0.32）%、（25.68±1.71）%,均P<0.05\],AQP-5-siRNA+DDP组细胞的增殖抑制率显著高于AQP-5-siRNA组和DDP组\[（39.01±1.76)% vs (9.11±0.32）%、（18.47±1.25）%, P<0.05\],而且,AQP-5-siRNA与5-FU或DDP联用的Q值分别为1.38和1.51,均表现为协同作用。 结论： AQP-5-siRNA能抑制HT-29细胞增殖、促进其凋亡、并提高HT-29细胞对5-FU和DDP的化疗敏感性。     

RNAi沉默整合素连接激酶基因表达对结肠癌细胞HT-29增殖的影响

目的:利用RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术,阻断结肠癌细胞系HT-29中整合素连接激酶(integrin-linked kinase,ILK)基因的表达,研究ILK基因沉默后对HT-29细胞系增殖产生的影响。方法:构建针对ILK基因的真核表达质粒pSUPER-neo-EGFP-ILK(pSNE-ILK),在脂质体介导下稳定转染人结肠癌细胞系HT-29细胞(HT-29/pSNE-ILK组),同时以无关质粒pSUPER-neo-EGFP-C(pSNE-C)转染HT-29细胞(HT-29/pSNE-C组)和未转染细胞(HT-29组)作为对照,分别应用RT-PCR技术及蛋白印迹法检测ILK mRNA及蛋白表达水平,四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测细胞增殖状况。结果:稳定转染后,HT-29/pSNE-ILK组ILK mRNA及蛋白表达水平分别为0.16±0.11和0.24±0.07,HT-29/pSNE-C组分别为0.53±0.10和0.56±0.08,HT-29组分别为0.64±0.11和0.77±0.02,前组ILK mRNA及蛋白表达水平分别与后两组比较,差异均有统计学意义(P<0.05);稳定转染pSNE-ILK质粒后HT-29细胞中ILK mRNA及蛋白表达抑制率分别为69.8%和57.1%。MTT比色法检测显示,HT-29/pSNE-ILK组细胞增殖率明显下降(P<0.05)。结论:RNA干扰技术能有效抑制靶基因ILK的表达,进而可抑制结肠癌细胞系HT-29的增殖。     

RNAi沉默CD133基因表达对结肠癌细胞株HT-29影响的研究

目的:探讨通过RNA干扰沉默CD133基因对结肠癌细胞株HT-29的增殖和侵袭力的影响。方法:将CD133siRNA用脂质体转染入HT-29细胞,以逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测CD133mRNA的变化,蛋白质印迹法检测转染前后蛋白的表达水平,用MTT比色法和Transwell小孔实验分别检测癌细胞的增殖及侵袭力变化。结果:CD133siRNA转染成功,与正常对照组相比,转染组CD133mRNA及蛋白的表达水平均有明显的抑制,并呈现浓度时间依赖性。MTT实验证明转染组细胞随时间延长,增殖逐渐受到抑制,P<0.05。Tran-swell小孔实验中经转染处理的穿膜细胞数明显减少(P<0.05),RNA干扰降低了细胞的侵袭性。结论:CD133在HT-29癌细胞增殖及侵袭过程中起重要作用,RNA干扰可以有效抑制其CD133的表达,并能有效降低癌细胞的增殖及侵袭力。     

livin基因沉默对人恶性黑素瘤A375细胞周期和凋亡的影响

目的:探讨小干扰RNA(small interfening RNA, siRNA)沉默livin基因对人恶性黑素瘤A375细胞周期和凋亡的影响.方法:构建2个针对人源livin基因的siRNA表达质粒,并通过脂质体介导转染人恶性黑素瘤A375细胞株,利用荧光定量PCR检测livin mRNA的表达情况,Annexin Ⅴ-PE FCM法检测A375细胞凋亡情况,PI单染FCM法检测细胞周期情况.结果:成功构建livin siRNA表达质粒,转染siRNA-1和siRNA-2后48 h 的A375细胞中 livin mRNA表达量较空白对照组分别下降17%和42%,72 h分别下降71%和61%.转染siRNA-1和siRNA-2后48 h 的A375细胞凋亡率(29.45%和33.25%)及72 h细胞凋亡率(33.52%和38.18%)均高于空白组(7.95%和9.70%)(P<0.05).siRNA-2可引起G0/G1期升高,S期下降(P<0.05),siRNA-1作用不明显(P>0.05).结论:siRNA-1、2体外均能有效抑制livin mRNA的转录,促进人恶性黑素瘤A375细胞凋亡.siRNA-2表达质粒能使人恶性黑素瘤A375细胞周期出现G0/G1期阻滞,细胞增殖受到抑制.     

siRNA沉默雄激素受体对人结肠癌HCT-8细胞增殖、迁移及侵袭的影响

目的:利用小干扰RNA(siRNA)沉默人结肠癌HCT-8细胞中雄激素受体(androgen receptor,AR)的表达,观察AR敲除对癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响,初步探讨AR在结肠癌中的功能.方法:利用qRT-PCR和Western blot检测HCT-8细胞及正常人肠上皮细胞中AR的表达;siRNA转染HCT-8细胞沉默AR表达,利用qRT-PCR和Western blot检测转染效率;流式细胞术检测沉默AR后对HCT-8细胞周期的影响;CCK-8法检测沉默AR后对HCT-8细胞增殖的影响;Transwell实验检测沉默AR后对HCT-8细胞迁移及侵袭的影响.结果:AR在人结肠癌HCT-8细胞中高表达;siRNA能有效沉默HCT-8细胞中AR的mRNA及蛋白的表达.与对照组相比,沉默AR表达能够明显抑制HCT-8细胞的增殖、迁移和侵袭能力.结论:AR在人结肠癌HCT-8中高表达并能够促进癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力.     

siRNA沉默结肠癌转移相关基因1表达对人类卵巢癌细胞株侵袭转移的影响

目的 检测结肠癌转移相关基因1（MACC1）在卵巢癌细胞株中的表达,并探讨用siRNA技术抑制其表达对卵巢癌细胞生物学行为的影响.方法 应用实时荧光定量PCR （RT-qPCR）及Western blot法检测OVCAR3、ES-2、SKOV3、HO-8910卵巢癌细胞株中MACC1的表达,合成MACC1特异性siRNA并转染OVCAR3细胞,利用RT-qPCR筛选并鉴定MACC 1基因有效沉默后,应用体外黏附实验、Transwell迁移及侵袭实验、体外血管拟态实验检测MACC1基因沉默后OVCAR3细胞的体外黏附、迁移、侵袭及血管生成能力的变化.结果 OVCAR3细胞较其他卵巢癌细胞株高表达MACC1.MACC1基因沉默后,OVCAR3细胞的体外黏附能力受到不同程度的抑制;Transwell迁移实验中,MACC1 siRNA干扰的OVCAR3细胞（干扰组）转入底层膜的细胞数为（245.5±12.8）个,低于阴性对照组和空白对照组[分别为（500.3±16.5）、（496.3±13.1）个,均P＜0.05]; Transwell侵袭实验中,干扰组转入底层膜的细胞数为（185.3±14.1）个,低于阴性对照组和空白对照组[分别为（405.7±9.1）、（416.3±11.5）个,均P＜0.05];体外血管拟态显示干扰组细胞多呈散在分布,连接减少,形成的完整结构少.结论 利用siRNA技术抑制MACC1基因表达可有效抑制卵巢癌OVCAR3细胞的体外转移和侵袭能力,MACC1有望成为卵巢癌治疗的靶基因.     

Livin靶向siRNA诱导大肠癌细胞调亡的作用

Objective:To construct siRNA recombinant expression vector targeting Livin gene and observe the apoptosis induction effecl of it in human colon cancer cells.Methods:SiRNA recombinant expression vector targeting Livin gene was constructed and transfected into human colon cancer cell.The effect of siRNA recombinant expression vector was detected by RT-PCR,Westem blot,MTT reduction assay and flow cytometry.Results:It was confirmed by restriction endonuclease and sequence analysis that siRNA recombinant expression vector targeting Livin gene was constructed successfully.Inhibition ratio of Livin siRNA at mRNA and protein levels were 30.18% and 28.88%.The growth of cancer cells was inhibited significantly and the apoptotic ratio was 13.36±1.45%.Conclusion:The siRNA recombinant expression vector targeting Livin gene has been constructed successfully.It not only can inhibit the expression of Livin gene but also can induce apoptosis in human colon cancer cells remarkably.     

RNAi沉默Cyr61基因对喉癌细胞增殖、凋亡及侵袭能力的影响

目的：观察RNA干扰技术沉默Cyr61基因表达对人喉癌Hep-2细胞生物学行为的影响。方法：针对Cyr61mRNA的序列设计合成小于扰RNA（siRNA）的DNA模板,构建pRNAT—Cyr61重组质粒,转染人喉癌Hep-2细胞;RT—PCR和Westernblot检测其对Hep-2细胞内源性Cyr61表达的影响;四甲基偶氮唑蓝（MTr）法观察Hep-2细胞体外增殖活性变化;Transwell小室法检测Hep-2细胞体外侵袭能力的改变;流式细胞仪检测Hep-2细胞凋亡。结果：pRNAT—Cyr61重组质粒在mRNA及蛋白水平分别显著抑制Cyr61基因表达,抑制率分别最高达到74．62％和78．43％;Hep-2细胞的体外生长抑制率最高达68．22％,侵袭细胞数下降至（44．00±2．35）个;Hep-2细胞凋亡率最高达52．98％。结论：pRNAT—Cyr61可抑制Cyr61在喉癌Hep-2细胞中的表达,并抑制细胞的增殖活性和侵袭能力,促进细胞凋亡。     

慢病毒介导shRNA特异性沉默livin基因促进SPC-A1细胞凋亡

目的：建立慢病毒介导的livin基因沉默系统,探讨其对肺癌细胞凋亡的影响。方法：Livin shRNA慢病毒感染肺腺癌细胞株SPCA1沉默livin基因表达。应用PI染色经荧光镜下观察SPCA1细胞凋亡形态,流式细胞术检测SPCA1细胞凋亡率及亚二倍体峰形成,Realtime PCR及Western blotting方法检测livin和caspase 3表达的改变。结果：livin基因在肺腺癌细胞株SPCA1中持续高表达。经慢病毒介导shRNA使livin基因表达沉默后,镜下可见肺腺癌细胞出现典型凋亡形态特征,流式细胞术检测出现亚二倍体峰,细胞凋亡率较空白对照及阴性病毒对照细胞明显增加（8.21％ vs 0.08％, 0.13％;P<0.05）,RTPCR及Western blotting 检测结果显示,caspase 3 mRNA表达无改变,但cleavedcaspase 3蛋白表达上调。结论：慢病毒载体介导的shRNA能抑制肺腺癌细胞株SPCA1中livin基因的表达,从而促进SPCA1细胞凋亡。     

染料木黄酮对人结肠癌细胞系HT-29细胞增殖的影响

目的:研究染料木黄酮对人结肠癌细胞系HT-29细胞增殖的影响.方法:采用MTT比色法测定染料木黄酮对人结肠癌细胞系HT-29细胞增殖的影响,应用流式细胞术检测染料木黄酮对HT-29细胞周期及凋亡的影响.结果:染料木黄酮能够显著抑制HT-29细胞的增殖,且具有浓度依赖性,其半数抑制浓度(IC50)为23μmol/L;染料木黄酮能够引起HT-29细胞发生G0/G1期阻滞,并能够诱导HT-29细胞发生凋亡;western结果显示染料木黄酮作用后Bax表达增强,而Bcl-2表达减弱.结论:染料木黄酮能够诱导人结肠癌HT-29细胞发生周期阻滞和凋亡,从而导致HT-29细胞增殖能力下降.     

沉默Livin基因表达对结肠癌LoVo细胞生物学特性的影响

目的:运用RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术沉默结肠癌细胞株LoVo中Livin基因的表达,研究Livin对LoVo细胞增殖和凋亡等生物学特性的影响.方法:构建针对Livin基因的干扰质粒pSilencer4.1-L1和pSilencer4.1-L2,转染LoVo细胞,通过RT-PCR、Wes...