通过农杆菌介导法将兔防御素NP-1基因导入毛白杨(P.tomentosa)

采用叶盘法将兔防御素NP－1基因导入毛白杨后,经PCR分析、Southern杂交检测与筛选获得了转基因植株。并经体外抑菌实验表明,转NP－1基因毛白杨植株组织提取物对某些微生物的生长具有明显的抑制作用。     

利用椭圆小球藻硝酸还原酶缺失突变体为生物反应器表达兔防御素NP-1蛋白

利用转基因小球藻为生物反应器生产兔防御素NP-1蛋白具有重要的应用价值。本研究利用椭圆小球藻(Chlorella ellipsoidea)硝酸还原酶(nitrate reductase)缺失突变体为受体, 构建了包含NPTII基因和硝酸还原酶基因两个筛选标记的兔防御素蛋白表达载体, 采用电激法将目的基因转入椭圆小球藻硝酸还原酶缺失突变体nrm-4, 获得了正确表达防御素蛋白的转基因藻, 从而表明通过硝酸还原酶作为筛选标记基因并结合硝酸还原酶缺失突变体可作为较好的小球藻生物反应器生产模式。     

小麦中外源基因瞬间表达调控研究及兔防御素（NP—1）基因的转化

将不同５上游调控序列驱动下的ＧＵＳ基因用基因枪法导入小麦幼胚和胚性愈伤组织,通过组织化学分析法和荧光分析法对ＧＵＳ基因的表达进行定量检测,比较了几种烟草花叶病毒（ＴＭＶ）Ω增强子序列对小麦中外源基因瞬间表达的调控作用;然后将其中效率最高的玉米Ｕｂｉｌ启动子与兔防御素（ＮＰ－１）连接起来,并加上Ｎｏｓ终止子,构民ＮＰ－１基因小麦表达载体,并转化小麦幼胚,经ＰＣＲ－Ｓｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ分析,初步确     

转兔防御素基因小球藻异养培养的培养基优化研究

在氮源种类筛选的基础上,采用Plackett-Burman实验设计并结合单因素实验对转兔防御素基因小球藻异养培养的培养基进行了优化。实验结果表明,采用优化后的Knop异养培养基在250mL摇瓶中进行异养培养,藻细胞密度从优化前的1.5g/L提高到优化后的5.11g/L;摇瓶和5L生物反应器异养培养表明,Knop异养培养基中藻细胞浓度分别为优化前培养基的3.39倍和3.17倍,而兔防御素(NP-1)表达能力基本不变。     

HAL1基因转化番茄及耐盐转基因番茄的鉴定

采用PCR方法 ,从啤酒酵母中扩增得到可调节植物细胞离子均衡的HAL1基因 ,克隆后序列分析表明 :其开放读码框全长 879bp ,编码一个 294个氨基酸的多肽 (分子量32kD)。构建含HAL1和NptⅡ嵌合基因的植物表达框架pRH ,三亲杂交后经农杆菌介导的叶圆盘法转化番茄 (中蔬 5号 ) ,在含卡那霉素的培养基上进行转化体的筛选。转基因番茄的PCR、Southern杂交、RT PCR检测以及鲜重、干重和Na⁺ 、K⁺ 含量的测定表明 :HAL1基因确已整合到一些转基因番茄的基因组中 ;且转基因植株的耐盐性提高。     

SARS S1基因对番茄的遗传转化与转基因番茄植株的获得

利用DNA直接导入法将含有SARS S1基因的植物表达载体pCS1导入农杆菌LBA4404中,并通过农杆菌介导的叶盘转化法得到12株再生小苗。PCR、Southern杂交检测结果证实,有6株为真正的转基因植株。     

口蹄疫病毒VP1基因在番茄中的表达及转基因番茄对豚鼠诱导免疫保护

构建克隆有O型口蹄疫病毒China99株VP1基因的植物双元表达载体pBin438/VP1。通过农杆菌介导法转化番茄子叶,经卡那霉素抗性筛选,获得60株抗性植株。对抗性植株分别做PCR、RT-PCR检测目的基因的整合与转录,ELISA筛选约40%的卡那抗性植株阳性,分别提取两株ELISA和Western blot检测阳性的转基因番茄叶片蛋白与弗氏佐剂乳化,于0、15、30d经肌肉途径免疫豚鼠,第三次免疫后28d用100ID50的同源强毒攻击,根据豚鼠抗体水平的消长动态和免疫豚鼠抗强毒攻击的保护率进行转基因植物疫苗免疫原性的评估。结果表明,双元表达载体pBin438/VP1构建正确,PCR、RT-PCR结果证实口蹄疫病毒VP1基因已整合到番茄基因组并在转录水平表达,ELISA和Western blot检测重组蛋白能够与FMDV阳性血清反应。转基因番茄第三次免疫豚鼠后21d血清效价最高可达1∶64,攻毒后两组免疫豚鼠保护率分别达80%和40%,证明转基因番茄表达的VP1蛋白具有良好的免疫原性。     

通过农杆菌介导法将免防御麦NP—1基因导入毛白杨（P.tomentosa）

采用叶盘法将兔将御素ＮＰ－１基因导入毛白杨后,经ＰＣＲ分析、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交检测与筛获得了转基因植株,并经体外抑菌实验表明,转ＮＰ－１基因毛白杨植株组织提取物对某些微生物的生长具有明显的抑制作用。     

防御素的生物学特性及其抗病基因工程

防御素是一种富含半胱氨酸的小分子多肽,对细菌等微生物具有广谱抗性,且作用机制特殊。迄今为止,国内外在防御素方面进行了大量的研究,已经从各类生物体中分离出不同种类的防御素,并在基因工程和医药领域呈现广泛的应用前景。文章对防御素的分类、生物学特性,包括哺乳动物α-、β-、θ-防御素、昆虫以及植物防御素的分子结构及抗菌活性进行了综述,阐述了防御素的膜作用及与细胞内复合物结合的作用机制。总结和归纳了防御素基因的分离、表达研究进展及动、植物防御素基因在抗病基因工程领域的应用,并对防御素在未来的生物制药和植物抗病基因工程方面的应用前景进行了展望。     

在大肠杆菌中表达人防御素—1

构建了一组ＨＮＰ－１原核表达载体,其中有几个含ＳＤ或Ω序列的载体,在表达产物中检测到了ＨＮＰ－１的存在,说明宿主菌是否在任何情况下都降解外源小分子多肽是一个值得考虑的问题,另外,从表达载体在大肠杆菌ＪＭ１０９和ＪＭ１０９（ＤＥ３）中蛋白表达量的差异也可推测ＨＮＰ－１发生了低水平的表达,ＨＮＰ－１对细菌的作用与ＨＮＰ－１浓度和细菌本身的生理状况密切相关。     

转HS1~(pro1)基因番茄植株的获得

目的:为了减少根结线虫对番茄的危害,研究并获得转抗线虫基因HS1pro1番茄植株。方法:在鉴定表达载体之后,采用CaCl2法制作农杆菌EHA105感受态细胞,然后用冻融法将HS1pro1基因转入农杆菌中。通过农杆菌介导法将HS1pro1基因导入无菌番茄外植体中,获得抗根结线虫转化再生植株。用卡那霉素筛选到再生植株后,提取抗性芽的基因组,利用设计好的引物进行PCR鉴定。结果与结论:目的基因已整合到番茄基因组中,获得了转HS1pro1基因番茄植株。     

转HSl^prol基因番茄植株的获得

目的：为了减少根结线虫对番茄的危害,研究并获得转抗线虫基因HSl^prol。番茄植株。方法：在鉴定表达载体之后,采用CaCl2法制作农杆菌EHAl05感受态细胞,然后用冻融法将HSl^prol基因转入农杆菌中。通过农杆菌介导法将HSl^prol基因导入无菌番茄外植体中,获得抗根结线虫转化再生植株。用卡那霉素筛选到再生植株后,提取抗性芽的基因组,利用设计好的引物进行PCR鉴定。结果与结论：目的基因已整合到番茄基因组中,获得了转HSl^prol基因番茄植株。     

植物防御素PD5基因在毕赤酵母中的分泌表达

将植物防御素PD5基因克隆到载体pPIC9的XholⅠ和EcoRⅠ位点之间,得到重组载体pPIC9／PD5。pPIC9／PD5经Bgt Ⅱ线性化,电转化法转入Pichia pastoris GS115,MD和MM平板筛选表型为His^＋Mut^S的转化子,PCR鉴定阳性转化子。转化子D24用BMGY培养至OD600为6．0时,经BMM诱导,上清液用Tricien—SDS—PAGE可检测到目标条带。同时经平板抑菌试验显示,D24的诱导发酵上清液可很好的抑制香蕉枯萎菌（Fusarium oxysporum f.sp.Cubense）及甘蓝黑腐菌[Xanthomona campestris（Smith）Dovosen]的生长。植物防御素PD5基因在毕赤酵母中得到表达。     

猪防御素基因PBD-I在大肠杆菌中的重组和融合表达

用RT-PCR方法获得PBD-I基因,将该基因插入原核表达载体PinPoint^TMXa-3中,重组质粒转化大肠杆菌JM109,经IPTG诱导后以融合蛋白形式表达。SDS-PAGE电泳显示PBD-I基因在目标位置17kDa处获得了表达。PBD-I基因的成功表达为进一步研究其抗菌活性、抗菌机理及应用研究形成基础。     

转HAL1基因番茄的耐盐性

利用农杆菌介导的叶盘法,把HAL1 基因转入番茄,Southern杂交检测得到转基因植株.耐盐实验表明, T1代转基因番茄在150 mmol/L的NaCl胁迫下仍有43%的发芽率,200 mmol/L的NaCl胁迫下发芽率为6%,而对照种子在100和150 mmol/L的NaCl胁迫下发芽率分别为11.0%和0.转基因番茄的电解质相对外渗率小于对照,而根冠比和叶绿素含量大于对照,转HAL1基因显著提高了番茄的耐盐性.盐胁迫下Na 、K 的累积状况表明,转基因番茄根、茎、叶的K /Na 均有所提高,根系的SK/Na增大,茎、叶的RSK/Na和RLK/Na减小,说明根系对K /Na 离子的选择吸收和运输能力加强.不但选择吸收K /Na ,而且表现出整株水平上的有利于耐盐的K /Na 区域化分配.     

番茄rbcS3A启动子控制的GUS融合基因在转基因水稻中的表达

为研究不同启动子用于转基因水稻,克隆了番茄Rubisco小亚基rbcS3A基因的5′上游调控区,构建了由rbcS3A启动子引导的GUS嵌合基因,并经农杆菌介导导入到水稻中。对转基因水稻植株中GUS活性的定性与定量测定结果表明,rbcS3A启动子可驱动GUS报告基因在转基因水稻植株茎和叶组织中高效表达,而在根和种子等器官中不表达或表达活性极弱,表现出一定的组织特异性。在转基因水稻中,番茄rbcS3A启动子驱动外源基因的表达不受光诱导。     

霍乱肠毒素B亚单位在转基因番茄中表达的研究

将霍乱肠毒素B亚单位（CT－B）基因及内质网引导序列（SEKDEL）克隆到质粒pRTL2和pBI121中,分别构建植物双元表达载体pBI-CTB和pBI-CTBK,CT-B基因由Ca35S启动子控制表达。采用叶盘法经根癌农杆菌介导转化番茄（金丰1号,Jinfeng1)各表达载体得到一批转基因植株。经PCR和Southern blot分析表明CT－B基因整合到了番茄基因组中;ELISA和Western blot分析表明pBI-CTB和pBI-CTBK的转基因植株能够有效表达CT－B多肽,分别占番茄叶片可溶性蛋白的0.055%和0.084%。     

Expression of the Full‐length Coat Protein Gene of Tomato leaf curl Taiwan virus is Not Necessary for Recovery Phenotype in Transgenic Tomato

Transgenic tomato plants expressing full‐length (CPV1) and truncated coat protein (CP) gene (CPV2) of Tomato leaf curl Taiwan virus (ToLCTWV) were generated by Agrobacterium‐mediated transformation. Transgene integration and expression was confirmed by PCR and Southern blotting and Northern analysis, respectively. Resistance was evaluated both in plants of T0 and T1 progenies using viruliferous whiteflies under two different inoculum pressures (10–15 and 40–50 whiteflies/plant). Upon inoculation with ToLCTWV using viruliferous whiteflies, various levels of phenotypic reaction were observed. No complete resistance was observed in any of the plants tested. The reaction of the transgenic tomato lines carrying full‐length and truncated CP gene to ToLCTWV phenotype was (i) susceptible as non‐transgenic control, (ii) delayed symptom expression, (iii) complete susceptible (from delayed symptom expression phenotype) and (iv) recovered phenotype (either plants from symptom expression as non‐transgenic plants or delayed symptom expression phenotype). Dot blot quantification of the ToLCTWV using the replicase gene as a probe revealed that the recovered phenotypes accumulated a low level of ToLCTWV, and virus concentration was gradually reduced from 10 to 14 weeks postinoculation. The possible mechanisms of CP‐mediated resistance are discussed.