冠脉内导入重组β-半乳糖苷酶腺病毒的实验研究

目的 :研究经冠状动脉内导入重组 β-gal腺病毒后心肌的转染效率 ,证明冠脉内导入途径是否为重组基因导入心脏的有效的可行的途径。方法 :用定向克隆的方法构建重组 β -gal腺病毒载体 ,将 1 .53× 1 0 1 2 pfu重组 β-gal腺病毒经冠状动脉造影导管由左冠状动脉分别导入到 7只雄性Yorkshire猪心脏中 ,于术后 1周、2周、4周及 8周处死动物 ,取左右冠状动脉、3～ 5mm厚的不同部位的心肌及各实质脏器标本 ,经 1 .2 5 %戊二醛固定 2 0min ,用PBS洗涤 3次 ,在室温下用X -gal染液染色 1 6～ 2 4h ,脱水、石蜡包埋、切片及HE复染 ,光镜下计算出表达 β -gal的心肌细胞百分数即为转染效率。结果 :经冠状动脉内导入重组基因后 ,于术后 1周即有 β-gal表达 ,2周达高峰 ,心肌细胞的转染效率高达 45 .57% ,全层左冠状动脉壁、心肌间质中均有 β-gal表达 ,4周 β-gal表达下降 ,8周 β -gal恢复至对照组的基线水平。结论 :经冠状动脉内导入重组腺病毒 ,心肌细胞及冠脉壁重组基因表达效率高 ,说明冠状动脉内导入重组目的基因将是冠心病基因治疗中有效的可行的方法     

重组β—半乳糖苷酶腺病毒载体的构建及其在血管闰滑肌细胞中的表达

目的构建表达β-半乳糖苷酶(β-gal)的重组腺病毒,以期为再狭窄的基因治疗研究提供一个对照载 体和为腺病毒介导的基因转移的安全性、可行性、转染效率的研究提供一有用的工具。方法采用基因重组方法构 建穿梭质粒pAd-β-gal,通过同源重组法制备出重组腺病毒Ad-β-gal,转染的293细胞用X-gal染色鉴定Ad-β -gal的正确与否。通过测定260nm的紫外光吸收值估计病毒高度。原代大鼠血管平滑肌细胞采用组织块培养 法。Ad-β-gal以100moi感染VSMCs并行X-gal染色,以观察β-gal在VSMCs中的表达情况。结果成功构建了 pAd-β-gal穿梭质粒和Ad-β-gal重组腺病毒,转染的293细胞和VSMCs经X-gal染为蓝色,病毒浓度为9×l011 pfu/ml,以100moiAd-β-gal转染VSMCs,其转染效率接近l00%。结论表达β-gal的重组腺病毒构建成功,并在 VSMCs中得到有效表达,本研究为将来再狭窄基因治疗研究提供了一对照载体,也为腺病毒介导的基因转移的安 全性、可行性、有效性的研究提供了一有用的工具。     

体外连接法快速高效构建表达β-半乳糖苷酶的重组腺病毒载体

目的:采用体外连接法构建和制备重组腺病毒Adeno-X-LacZ,为构建具有治疗价值的重组腺病毒载体奠定基础。方法:PI-SceⅠ/I-CeuⅠ酶切pShuttle2-LacZ穿梭质粒,回收4.6 kb的LacZ基因表达盒,与经过相同酶切的Adeno-X病毒DNA连接,连接产物用SwaⅠ酶切,最终产物转化DH5α。重组质粒用PCR法和PI-SceⅠ/I-CeuⅠ酶切鉴定。pAdeno-X-LacZ用PacⅠ线性化后,用脂质体介导其转染至AD293细胞内包装扩增出重组腺病毒颗粒,采用CsC l密度梯度离心法纯化重组腺病毒Adeno-X-LacZ。采用X-gal染色观察Adeno-X-LacZ在AD293细胞内包装和HVSMC表达情况。结果:PCR扩增可见312 bp特异性条带,PI-SceⅠ/I-CeuⅠ酶切重组质粒后释放出4.6 kb LacZ基因表达盒。X-gal染色证实了在AD293细胞内成功扩增包装出重组腺病毒Ad-eno-X-LacZ和LacZ基因在HVSMC中得到有效表达。结论:体外连接法是一种快速、简便、高效的构建重组腺病毒质粒的方法,本研究为构建具有治疗价值的重组腺病毒奠定了基础,Adeno-X-LacZ为研究腺病毒介导的基因转移提供了一良好的对照载体。     

细菌内同源重组快速构建和制备表达β-半乳糖苷酶的重组腺病毒

目的 :利用细菌内同源重组快速构建重组腺病毒质粒和制备重组腺病毒。方法 :制备感受态BJ5 183,将pAdEasy - 1转化BJ5 183,制备含 pAdEasy - 1的BJ5 183感受态 ,将线性化的 pShuttle -CMV -LacZ转化含 pAdEasy- 1的BJ5 183感受态菌。采用细菌中同源重组法构建重组腺病毒质粒 pAdEasy - 1-LacZ。pAdEasy - 1-LacZ用PacⅠ线性化后 ,再用LipoVec介导其转染至AD2 93细胞内包装扩增出重组腺病毒颗粒 ,采用CsCl密度梯度离心法纯化重组腺病毒AdEasy - 1-LacZ。采用X - gal染色观察LipoVec介导的重组腺病毒质粒的转染效果及病毒包装情况。将纯化的AdEasy - 1-LacZ转染HVSMC ,X -gal染色观察基因转染效率及基因表达情况。 结果 :pShuttle -CMV -LacZ成功地转化了含 pAdEasy - 1的BJ5 183,并在其内发生了同源重组。X - gal染色证实了 pAdEasy - 1-LacZ转染AD2 93后 ,产生了重组腺病毒AdEasy - 1-LacZ。病毒滴度为 3.9× 10 12 pfu/ml。AdEasy - 1-LacZ转染HVSMC后 ,β -gal在HVSMC中得到了有效表达。 结论 :细菌内同源重组法是一种快速构建重组腺病毒质粒的方法 ,AdEasy - 1-LacZ的制备为基因治疗研究提供了一良好对照载体。     

应用AdEasy腺病毒改良载体系统构建携带β-半乳糖苷酶基因重组腺病毒的实验研究

组腺病毒Ad-B-gal,病毒滴度达(2.5～4.0)×1011EFU/ml;感染复数(multiplicity of infection,MOI)为10时对HEK293细胞48 h转染率达70%,并在X-gaJ试剂作用下,细胞旱现蓝色.结论 成功构建了携带β-gal基因的重组腺病毒,能高效感染293细胞.并功能性表达β-半乳糖苷酶.     

反义BTEB2腺病毒载体的构建及其在血管平滑肌细胞中的表达

目的 :构建反义BTEB2重组腺病毒载体 ,以研究BTEB2反义RNA对血管平滑肌细胞 (VSMC)增殖及动脉再狭窄的影响。　方法 :从培养的大鼠VSMC中提取总RNA ,通过RT PCR制备BTEB2cDNA ,将BTEB2cDNA反向连接至腺病毒穿梭质粒pDC31 5中 ,构建重组穿梭质粒pDC31 5ASBTEB2 ,将其与腺病毒基因组质粒pBHGloxΔE1 ,3Cre共转染 2 93细胞获得重组腺病毒 ,采用PCR方法对其进行鉴定 ;用重组腺病毒感染VSMC ,通过RT PCR检测BTEB2反义RNA在VSMC中的表达。　结果 :在病变 2 93细胞的冻融上清中含有反义BTEB2重组腺病毒 ,其滴度为 5×1 0 9ml。VSMC被重组腺病毒感染后 ,可检测到BTEB2反义RNA的表达。　结论 :成功构建了反义BTEB2重组腺病毒载体 ;重组腺病毒可在VSMC中表达BTEB2反义RNA ,为进一步研究BTEB2反义RNA对VSMC增殖及动脉再狭窄的影响奠定了基础     

PTEN重组腺病毒载体的构建及其在气道平滑肌细胞的表达

目的 应用pAdxsi载体系统构建携带PTEN基因的腺病毒载体.方法 将PTEN cDNA自载体pcDNA3-PTEN中切出,克隆至穿梭质粒pShuttle-GFP-CMV中,然后与腺病毒质粒pAdxsi在化学感受态细胞DH5α菌株内同源重组,经Pac-Ⅰ线性化后,重组子通过脂质体2000介导转染HEK293细胞,产生有感染能力的腺病毒,并测定其滴度,通过荧光显微镜能观察HEK293细胞内绿色荧光的表达;PCR检测腺病毒载体PTEN mRNA的表达,Western blotting检测PTEN蛋白在气道平滑肌细胞的表达.结果 感染腺病毒载体的HEK293细胞表达GFP随着时间逐渐增强,并且出现明显的细胞病变效应,经过3轮扩增后病毒达到合适的滴度,构建的Ad-PTEN腺病毒滴度为2×1010pfu/ml,PCR扩增后经琼脂糖凝胶电泳证实其表达,Western blotting检测纠腺病毒感染的气道平滑肌细胞内PTEN蛋白表达明显增高.结论 成功构建了携带野生型PTEN腺病毒载体,为进一步研究PTEN基因应用于哮喘治疗提供了实验基础.     

腺病毒载体介导的大鼠DNA多聚酶β重组体的构建及其在PC12细胞中的表达

[目的]为探讨DNA多聚酶β在神经细胞损伤中的作用与机制,构建其重组腺病毒载体,并在PC12细胞中表达.[方法]RT-PCR获取大鼠DNA多聚酶β(POLβ)的编码序列,TA克隆测序,酶切POLβ基因并连入穿梭质粒pAdTrack-CMV,电转至含腺病毒pAdeasy骨架质粒的大肠杆菌BJ5183.重组腺病毒质粒(pAd-polβ)和Lipofectamine2000转染293细胞,用重组腺病毒感染PC12细胞.[结果]10个TA克隆中有3个克隆的序列与GENE BANK中大鼠POLβ cDNA序列完全一致,同源重组检测时30个克隆中有8个含目标条带.DNA序列正确的POLβ重组腺病毒质粒转染293细胞后,感染Ad-polβ的293及PC12细胞荧光显微镜下可见绿色荧光,重组腺病毒Ad-polβPCR鉴定含目标条带,Ad-polβ感染PC12细胞Western Blot检测到POLβ蛋白表达.[结论]成功构建了大鼠DNA多聚酶β的腺病毒重组体并在PC12细胞中表达     

促血管生成素-2过表达重组腺病毒载体的构建

目的 构建小鼠促血管生成素-2(Ang-2)基因过表达重组腺病毒载体.方法 化学合成小鼠Ang-2编码序列,经PCR扩增、鉴定后连接至穿梭质粒.将含目的基因的重组质粒转化DH5α感受态细胞,所得阳性转化子经电泳分析并测序鉴定.将携带目的基因的穿梭质粒与辅助包装质粒共转染人胚肾细胞系HEK293细胞,反复冻融获取重组腺病毒,终点稀释法测定病毒滴度,重组腺病毒转染HEK293细胞并提取蛋白,采用免疫印迹法分析Ang-2蛋白的表达.结果 PCR产物电泳分析可见大小约1.5 kp的特征性条带,基因序列显示测序结果与GenBank提供的Ang-2序列一致,经 HEK293细胞包装后腺病毒滴度为1×108.8 pfu/ml,免疫印迹法分析可见大小57 kD特征性条带,即重组腺病毒可成功表达Ang-2蛋白.结论 Ang-2基因重组腺病毒载体可成功构建.     

大鼠SOCS3基因重组腺病毒载体的构建及转染血管平滑肌细胞后的表达

目的 构建携带大鼠SOCS3基因的重组腺病毒载体并转染大鼠血管平滑肌细胞,评价其转染效果,为血管增殖性疾病转基因治疗的实验研究奠定基础.方法 用BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ将目的基因pUC57-Simple-rSOCS3及腺病毒穿梭载体pYr-adshuttle- 4(带GFP标记)行双酶切.回收酶切质粒的目的片段进行连接,产物转化至DH5α感受态.提取质粒酶切鉴定正确后测序.通过LR体外同源重组将rSOCS3表达框构建至pAd/PL-DEST腺病毒表达载体上.将腺病毒线性化后转染HEK293细胞包装腺病毒,PCR鉴定此腺病毒中是否含有rSOCS3基因.放大培养并收集病毒,TCD法测定病毒滴度.将此病毒感染大鼠血管平滑肌细胞,荧光显微镜观察感染效率,real-time PCR及免疫印迹检测SOCS3 mRNA及蛋白表达.结果 rSOCS3腺病毒穿梭质粒酶切鉴定正确,测序与rSOCS3基因库中的序列完全相符.PCR鉴定pAd/PL-DEST腺病毒表达载体成功携带目的基因rSOCS3.TCD法测定的最终滴度为2×1010pfu/mL.荧光显微镜观察此病毒感染血管平滑肌细胞的效率在80％以上,real-time PCR及免疫印迹检测结果显示血管平滑肌细胞中SOCS3 mRNA及蛋白表达明显上调.结论 成功构建携带大鼠SOCS3基因的腺病毒载体,并在血管平滑肌细胞中高表达,为血管增殖性疾病转基因治疗的实验研究奠定了基础,具有一定的应用价值.     

小鼠PPA1重组腺病毒的构建及在胰岛β细胞中的表达

目的:构建小鼠PPA1重组腺病毒,观察重组腺病毒在小鼠胰岛和β－TC6细胞中的表达,以及对脂肪酸引起的胰岛β细胞凋亡的影响?方法:将目的基因PPA1插入到腺病毒穿梭质粒pAdtrack－CMV中,质粒经PCR鉴定正确后用PmeⅠ酶切线性化,转到含有腺病毒骨架pAdeasy－1的 BJ5183细菌中进行同源重组,重组成功的质粒经PacⅠ酶切线性化后转染QBI－293A细胞,经包装得到Ad－PPA1腺病毒?根据绿色荧光蛋白(GFP)检测病毒滴度和感染效率?用病毒感染小鼠胰岛和β－TC6细胞,以Western blot法检测PPA1蛋白表达水平?Hoechst染色法检测PPA1对细胞凋亡的影响?结果:重组腺病毒载体pAdeasy－PPA1经酶切鉴定确认构建成功,将pAdeasy－PPA1转染QBI－293A细胞,观察细胞病变效应提示病毒成功包装?重组腺病毒能够有效感染小鼠胰岛和β－TC6细胞并成功过表达 PPA1蛋白?Hoechst染色结果表明过表达PPA1可保护脂肪酸引起的胰岛β细胞凋亡?结论:成功构建携带小鼠PPA1基因的重组腺病毒,并证实过表达PPA1具有抗凋亡的作用,为进一步研究PPA1在胰岛β细胞中的功能奠定了基础?     

非融合表达β-半乳糖苷酶的重组乳酸乳球菌的构建和性能研究

目的 构建能非融合表达高活性β-半乳糖苷酶的重组乳酸乳球菌,并对其酶活性和分泌性能进行研究.方法 提取能在大肠杆菌中非融合表达德氏乳杆菌保加利亚亚种β-半乳糖苷酶的重组质粒pMG36e-lacZ 1.1480和pMG36e-lacZ wch9901,电转化乳酸乳球菌乳酸亚种MGl363.测定重组菌在不同培养时间和乳糖浓度下的β-半乳糖苷酶活性,及在不同培养条件下的酶分泌率.结果 携带pMG36e-lacZ wch9901的重组乳酸乳球菌(MG1363/pMG36e-lacZ wch9901)具最高酶活性,其β-半乳糖苷酶活性达(16.95±0.09)U/mg pro,为基因初始菌的2.75倍;重组乳酸乳球菌培养24 h产酶达高峰;培养基含乳糖时,重组菌酶活测定结果表现为降低;重组乳酸乳球菌表达的β-半乳糖苷酶可分泌到培养基中,当培养基不含红霉素,而含20 g/L乳糖时,分泌率最高,达(27.09±0.05)%.结论 获得了能非融合表达和分泌高活性β-半乳糖苷酶的重组乳酸乳球菌,可在此基础上进一步研制β-半乳糖苷酶活菌释放体.     

丝裂素活化蛋白激酶在AngⅡ上调培养的血管平滑肌细胞转化生长因子-β受体表达中的作用

目的:探讨丝裂素活化蛋白激酶在血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导血管平滑肌细胞(VSMC)转化生长因子-β受体(TGF-βR1)上调中的作用。方法:培养大鼠主动脉VSMC,以10-7mol/L AngⅡ刺激作为AngⅡ组,AngⅡ刺激前分别应用10-5mol/L氯沙坦(Losartan)、PD98059预处理,以正常的VSMC为对照组,细胞免疫化学法测定培养12h时VSMC TGF-βR1的含量。结果:与对照组相比,AngⅡ刺激培养12h的VSMC TGF-βR1表达上调(P<0.01);AngⅡ受体AT1型拮抗剂Losartan使TGF-βR1表达显著降低(P<0.01),丝裂素活化蛋白激酶抑制剂PD98059能显著降低TGF-βR1表达(P<0.05)。结论:AngⅡ通过AT1上调TGF-βR1的表达,丝裂原活化蛋白激酶参与AngⅡ的胞内信号转导。     

促血管生成素-1腺病毒表达载体构建及鉴定

目的构建表达促血管生成素-1（Ang-1）的腺病毒载体,为研究Ang-1防治慢性缺血性疾病提供前期基础。方法通过PCR从pMD18-Ang-1质粒中扩增Ang-1基因,酶切连接入载体pDC315-GFP并转化大肠杆菌感受态细胞,PCR鉴定测序分析;借助AdMax腺病毒包装系统实现重组,提取质粒DNA并转染HEK293细胞,观察GFP荧光并以Western Blot检测目的蛋白的表达,以终点稀释法测定病毒滴度。结果重组质粒pDC315-GFP-Ang-1经PCR鉴定阳性克隆,测序分析比对正确,重组腺病毒转染HEK293细胞后可观察到GFP-Ang-1融合蛋白,病毒滴度1×1011PFU/ml。结论成功构建了表达Ang-1基因的腺病毒载体。     

腺病毒载体介导的大鼠DNA多聚酶β重组体的构建及其在PC12细胞中的表达

【目的】为探讨DNA多聚酶β在神经细胞损伤中的作用与机制，构建其重组腺病毒载体，并在PC12细胞中表达。【方法】RT—PCR获取大鼠DNA多聚酶β（POLβ）的编码序列，TA克隆测序，酶切POLβ基因并连人穿梭质粒pAdTrack—CMV，电转至含腺病毒pAdeasy骨架质粒的大肠杆菌BJ5183。重组腺病毒质粒（pAd—polp）和Lipofectamine2000转染293细胞，用重组腺病毒感染PC12细胞。【结果】10个TA克隆中有3个克隆的序列与GENE BANK中大鼠POLβ cDNA序列完全一致，同源重组检测时30个克隆中有8个含目标条带。DNA序列正确的POLβ重组腺病毒质粒转染293细胞后，感染Ad—polβ的293及PC12细胞荧光显微镜下可见绿色荧光，重组腺病毒Ad—polβPCR鉴定含目标条带，Ad—polβ感染PC12细胞Western Blot检测到POLβ蛋白表达。【结论】成功构建了大鼠DNA多聚酶β的腺病毒重组体并在PC12细胞中表达     

重组人血管抑素基因K(1-3)腺病毒载体的构建

目的 构建携带血管抑素（angiostatin，AG）基因K（1—3）重组复制缺陷型腺病毒表达载体。方法 将人血管抑素K（1—3）cDNA插入穿梭载体pShuttle产生重组质粒pShttle-AG（K1—3），经双酶切与骨架载体pAdeno—X重组产生pAdeno-X—AG（K1—3），转染293细胞制备重组腺病毒。结果 对pShuttle—AG（K1—3）进行酶切鉴定及测序证实插入片断为AG（K1—3）。PCR鉴定pAdeno—X—AG（K1—3），扩增出318bp特异性片断。线性pAdeno—X—AG（K1—3）转染293细胞，成功包装出重组腺病毒。结论 成功构建了携带人anglostatin（K1—3）重组腺病毒栽体，可在体外表达具有生物学活性的人angiostatin（K1—3），为进一步研究奠定了基础。     

小鼠MIP1-α重组腺病毒载体的构建及其在肝癌细胞中的表达

目的:构建小鼠趋化因子MIP1-α(mMIP1-α)的重组腺病毒载体并在小鼠肝癌细胞中表达,为肝癌基因治疗提供实验基础.方法:PCR扩增含有mMIP1-α的质粒,将腺病毒骨架质粒pAdEasy-1以及线性化的重组穿梭质粒pTrack-CMV- mMIP1-α共转化BJ5183受体菌并在其中发生同源重组,利用重组前后抗性的改变筛选出重组子,重组腺病毒质粒经过293细胞的包装、扩增和纯化后,感染小鼠肝癌细胞株Hepa1-6,一步法提取细胞总RNA,RT-PCR检测mMIP1-α的mRNA.琼脂糖凝胶打孔法体外观察感染上清中mMIP1-α对小鼠脾细胞的趋化活性.结果:得到了携带mMIP1-α的重组腺病毒,纯化后滴度为4×1011 efu/ml,在感染后的Hepa1-6细胞中检测到mMIP1-α的表达,上清中mMIP1-α的趋化指数为6.3.结论:成功地构建了携带mMIP1-α的重组腺病毒载体,为下一步应用于肝癌的基因治疗提供了基础.     

转化生长因子-β3基因重组腺病毒载体的构建及表达

目的：构建含有转化生长因子-β3（Transforming growth factor-β3,TGF-β3）和增强型绿色荧光蛋白（Enhanced green fluorescent protein,EGFP）的腺病毒载体,使其转染兔骨髓间充质干细胞（Mesenchymal stem cells,MSCs）,并在细胞内得到表达。方法：将含有TGF-β3基因克隆至含有EGFP的穿梭质粒,通过在感受态菌DH5α内同源重组,构建 pAdxsi-EGFP-TGF-β3。PacⅠ酶切线性化pAdxsi-EGFP-TGF-β3转染HEK293细胞,多轮“乒乓感染法”扩增收集 pAdxsi-EGFP-TGF-β3 病毒液,氯化铯梯度离心纯化,PCR和荧光显微镜观察EGFP的表达并检测重组腺病毒液的滴度。测定重组腺病毒液转染 MSCs 细胞转染效率,Western blot检测 TGF-β3 蛋白表达。结果：成功构建携带 TGF-β3和EGFP 的重组腺病毒载体pAdxsi-EGFP-TGF-β3,PCR和绿色荧光证实病毒包装成功,并具有感染力,病毒滴度为 2×1010 pfu/ml。Western blot 检测表明Adxsi-EGFP-TGF-β3感染的 兔骨髓MSCs 细胞有效表达 TGF-β3。结论：含有 TGF-β3 和EGFP的腺病毒载体pAdxsi-EGFP-TGF-β3构建成功和TGF-β3蛋白在兔骨髓MSCs中有效表达,为进一步研究转染TGF-β3 基因的兔骨髓MSCs 减轻创面愈合后瘢痕组织增生提供实验基础。     

四环素基因表达调控系统调控β-半乳糖苷酶基因在肝癌细胞中的表达

目的：构建调控β-半乳糖苷酶（β-gal）基因表达的四环素基因表达调控载体,验证其在肝癌细胞内调控β-半乳糖苷酶基因的表达,为进一步利用该调控系统调控治疗基因治疗肝癌奠定实验基础。方法：根据2个四环素调控子结合位点（TetO2）基因与pcDNA3.1载体的基因核苷酸序列,设计引物,以pcDNA3.1载体为模板进行PCR。将具有串联2个四环素调控子结合位点（TetO2）基因的PCR产物连接入pcDNA3.1载体CMV启动子下游,构建成pcDNA3.1-TetO2载体,应用ABI 3130 测序仪利用pcDNA3.1-TetO2载体对TetO2 PCR产物进行测序分析。再将β-gal克隆入pcDNA3.1-TetO2载体,构建成受四环素调控表达的β-半乳糖苷酶基因的表达载体pcDNA3.1-TetO2-β-gal。利用脂质体将携带四环素调控子基因（TR）的pcDNA6/TR载体转染到肝癌细胞HepG2中,利用杀稻瘟菌素进行细胞转染的稳定筛选,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测TR基因在HepG2细胞内的表达。将pcDNA3.1-TetO2-β-gal载体转染到稳定表达pcDNA6/TR的HepG2细胞中,转染3～4 d后,给予强力霉素（4 mg•L^-1）,利用β半乳糖苷酶原位染色试剂盒染色,检测β-半乳糖苷酶基因的表达。结果：构建的pcDNA3.1-TetO2载体测序结果表明,串联2个四环素调控子结合位点（TetO2）基因片段插入到pcDNA3.1载体CMV启动子基因下游。pcDNA3.1-TetO2-β-gal载体酶切鉴定结果表明,β-gal成功地克隆入pcDNA3.1-TetO2载体。RT-PCR结果显示,TR基因在pcDNA6/TR转染的经杀稻瘟菌素筛选的HepG2细胞内得到稳定表达。给予强力霉素后,β-半乳糖苷酶基因在稳定转染TR 基因的HepG2 细胞 内得以表达;而未给予强力霉素,β-半乳糖苷酶基因在稳定转染TR 基因的HepG2 细胞内表达受到抑制。结论：成功地构建了调控β-半乳糖苷酶基因表达的四环素基因表达调控载体,利用该载体成功地调控了β-半乳糖苷酶基因在HepG2细胞内的表达。     

重组VIP腺病毒载体的构建及其在293细胞的表达

目的 构建血管活性肠肽重组腺病毒载体,以期用于体内实验研究.方法 利用RT-PCR扩增小鼠大脑VIP mRNA,亚克隆到穿梭质粒pAdTrack-CMV,在pAdeasy内同源重组,筛选阳性克隆,酶切、测序鉴定正确,线性化后脂质体法转染293 细胞进行包装、扩增,利用报告基因EGFP对病毒滴度进行监测.PCR、免疫荧光鉴定pAdeasy-VIP感染293 细胞后VIP基因的表达,ELISA检测重组病毒转染后293细胞上清中的表达.结果 测序、酶切证实VIP基因重组腺病毒载体构建成功.RT-PCR,免疫荧光检测pAdeasy-VIP病毒感染的293细胞,均有VIP的表达.与对照组相比,重组病毒转染后293细胞上清中VIP多肽的表达明显增高.结论 成功构建了含小鼠VIP基因的重组腺病毒载体,并成功表达VIP多肽.