HSV1-TK基因重组腺相关病毒载体的构建及表达

目的:构建含单纯疱疹病毒Ⅰ型胸苷激酶(HSV1-TK)基因的重组腺相关病毒载体质粒pSNAV2.0-TK,制备重组腺相关病毒rAAV2/HSV1-TK,并检测HSV1-TK基因在转染晶状体上皮细胞中的整合和表达,为后囊膜混浊的基因治疗奠定基础.方法:用基因重组技术构建含HSV1-TK基因的重组腺相关病毒载体质粒pSNAV2.0-TK,并通过PCR和酶切鉴定;将该质粒转染BHK-21细胞,经G418筛选出携带该质粒的载体细胞株BHK-21/TK,在辅助病毒的参与下包装成重组病毒rAAV2/HSV1-TK;用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)法和高效液相色谱(HPLC)法检测重组病毒rAAV2/HSV1-TK的纯度,用斑点杂交法检测重组病毒的滴度;重组病毒rAAV2/HSV1-TK转染兔晶状体上皮细胞N/N1003A,用PCR和RT-PCR检测HSV1-TK基因的整合和表达.结果:经PCR和酶切鉴定重组质粒pSNAV2.0-TK构建成功;成功制备了重组病毒rAAV2/HSV1-TK,病毒滴度达1×1012v.g./mL;重组病毒转染N/N1003A细胞后,PCR和RT-PCR检测显示HSV1-TK基因在细胞中整合并且有效表达.结论:成功构建了含HSV1-TK基因的重组腺相关病毒载体质粒,制备了高滴度重组病毒rAAV2/HSV1-TK,HSV1-TK基因在转染该病毒的晶状体上皮细胞中可有效表达.     

HSV1-TK逆转录病毒载体构建及表达

目的　构建含ＴＫ基因逆转录病毒载体并检测其在转染细胞中的表达,为肺癌基因治疗积累实验资料。方法从 ＰＨＳＶ１０６质粒中切下约２．４ｋｂ ＴＫ基因片段,插入逆转录病毒载体ＰＬＸＳＮ多克隆位点,酶切筛选正、反向连接质粒。正 向连接子电穿孔法转化肺癌细胞Ａ５４９,用ＰＣＲ、细胞原位杂交法分别检测ＴＫ基因整合和表达。结果　经酶切鉴定得到 正向连接子,电穿孔法转导Ａ５４９细胞,经Ｇ４１８筛选出了转基因细胞,ＴＫ基因已整合在转染细胞中并阳性表达。结论 成功构建了含ＴＫ基因逆转录病毒载体,转导该载体的肺癌细胞可表达ＴＫ基因。     

SIRT1在骨性关节炎滑膜中表达的相关研究

目的：探讨沉默信息调节因子2相关酶1(SIRT1)在骨性关节炎(OA)正常滑膜组织及细胞中表达的差异性。方法膝关节滑膜细胞培养传代,甲苯胺蓝染色观察细胞形态,Western blot 法检测滑膜组织及细胞中 SIRT1的表达情况;免疫组织化学法对滑膜细胞检测 SIRT1表达情况及表达部位。结果甲苯胺蓝实验显示 OA 及正常滑膜细胞无明显形态学差异;免疫细胞化学法显示 SIRT1在滑膜细胞胞质中广泛表达,染色强度 OA 组较正常组明显降低(t =20．208, P <0．01);Western blot 法显示在滑膜细胞中 OA 组 SIRT1表达明显低于正常对照组((t =8．619,P <0．01);在滑膜组织中 OA 组 SIRT1的表达亦明显低于正常对照组(t =7．664,P<0．01)。结论 SIRT1与 OA 导致滑膜炎的发生发展密切相关,为 SIRT1可以作为 OA 治疗的靶点提供一个新的理论依据。     

人IL-17F重组逆转录病毒载体的构建及其在293T细胞中的稳定表达

目的构建hIL-17F重组逆转录病毒载体并研究它在293T细胞中的表达。方法以测序验证的pUCm-T/hIL-17F为模板,采用聚合酶链式反应(PCR)技术扩增目的基因片段(包括20aa信号肽序列,而且hIL-17F基因内EcoR I酶切位点GAA T TC→GAA C TC同义点突变,即AA T→AA C,均为Asn),并正向插入逆转录病毒载体pSIV-1后经PCR、双酶切和测序鉴定。将构建正确的pSIV-1/hIL-17F与辅助病毒载体pHIT456和pHIT60混合后,采用脂质体法共转染293T包装细胞,获得具有感染能力的成熟重组逆转录病毒感染293T细胞,经G418筛选获得阳性细胞株,并应用PCR、RT-PCR和dot-ELISA法检测hIL-17F目的基因在293T细胞中的整合、转录和表达。结果成功构建了hIL-17F基因内EcoRI酶切位点GAA T TC→GAA C TC同义点突变的重组逆转录病毒载体pSIV-1/hIL-17F,并在293T细胞中稳定表达。结论以逆转录病毒为载体感染的稳定表达rhIL-17F的293T转基因细胞株的首次获得,为进一步研究hIL-17F的生物学功能及其机制奠定了良好的基础。     

白介素-18和前列腺素E2在骨性关节炎滑膜细胞中的表达及相互关系

目的 了解白细胞介素18(IL-18)和前列腺素E2(PGE2)在骨性关节炎(OA)患者滑膜细胞中表达及其相关性.方法 取材OA患者(n=30)关节滑膜组织,分别原代培养滑膜细胞,采用酶联免疫吸附测定法(ELISA)定量检测滑膜细胞培养上清液中IL-18和PGE2蛋白的表达水平.结果 ELISA检测OA患者细胞培养上清液中IL-18的含量为(51.559±27.614)pg/ml,PGE2的含量为(327.036±333.561)pg/ml,统计学分析表明,30例患者膝关节滑膜细胞上清液中IL-18和PGE2存在显著正相关关系(r=0.863,P<0.01).结论 在OA病变过程中,IL-18的增高可能引起PGE2含量的增高,两者相互作用,从而在OA的发病机制中发挥重要作用.     

双亚基共表达人白细胞介素12重组腺病毒载体的构建与应用

目的构建双亚基共表达人白细胞介素１２（ＩＬ－１２）重组腺病毒载体,为其临床研究提供实验基础。方法利用ＲＴ－ＰＣＲ分别克隆出人ＩＬ－１２两个亚基ｐ４０和ｐ３５的全长编码ｃＤＮＡ,经脑心肌炎病毒的内部核糖体结合位点（ＩＲＥＳ）序列连接后置于ＣＭＶ启动子下游,将其插入Ｅ１区替代的腺病毒载体ｐＡｘ１ｃｗ,构建成人ＩＬ－１２的双顺反子共表达重组腺病毒载体;与ＥｃｏＴ２２Ｉ酶切的Ａｄ５腺病毒ＤＮＡ－末端肽复合物共转染２９３细胞,经同源重组制备人ＩＬ－１２的重组腺病毒。结果扩增到的人白介素１２重组腺病毒滴度为２．１×１０９ｐｆｕ／ｍｌ,体外感染２９３细胞、ＨｅｐＧ２细胞和人原代皮肤成纤维细胞后,经ＥＬＩＳＡ检测证实人ＩＬ－１２的表达（３０～５０ｎｇ／１０６细胞／２４小时）,所表达的ＩＬ－１２体外能刺激人淋巴母细胞的增殖和ＩＦＮ－γ的产生。结论所制备的人ＩＬ－１２双亚基共表达重组腺病毒载体能有效表达具有生物学活性的人ＩＬ－１２,可望进一步用于临床研究。     

人白细胞介素-15cDNA真核表达载体的构建及其在肺癌细胞中的表达

目的观察人ＩＬ－１５ｃＤＮＡ在腺癌细胞内的表达。方法将人ＩＬ－１５ｃＤＮＡ于ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ位点正向克隆到逆转录病毒载体ｐＬＸＳＮ,构建ｐＬ－ＩＬ－１５－ＳＮ的重组质粒。以Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ介导将该重组质粒转染到人肺鳞癌细胞（ＰＧ细胞系）和小鼠肺腺癌细胞（ＬＡ７９５细胞系）。经Ｇ４１８条件培养筛选,获得阳性细胞克隆。再经ＣＴＬＬ－２细胞增殖法测阳性细胞ＩＬ－１５的表达活性。结果获得３个ＰＧ细胞和４个ＬＡ７９５细胞阳性克隆,ＩＬ－１５活性测定显示其表达水平在２４ｈ内分别在１４２～２０１或１３８～１７８Ｕ／（ｍｌ·１０６细胞）。结论ＩＬ－１５ｃＤＮＡ转导的人和小鼠肺癌细胞可表达有生物学活性的ＩＬ－１５。     

人白细胞介素12双亚基共表达pVAX1-IRES-hIL12载体的构建与表达

目的构建下游可以共表达人白细胞介素12（hIL12）双亚基的双顺反子真核表达载体pVAX1-IRES-hIL12。方法通过搭桥PCR获得人白细胞介素12P35及P40双亚基的融合基因P35-F2A-P40,插入DNA疫苗载体pVAX1-IRES的下游,瞬时转染293-T细胞,ELISA检测融合基因的表达。结果酶切鉴定和序列分析表明融合基因与设计完全一致,融合基因在体外细胞培养液检测中获得分泌表达。结论该载体的成功构建可以为肿瘤基因疫苗研制提供免疫增效载体。     

分泌型人IL-1β表达载体的构建及在H7402细胞中的表达

目的构建经典途径分泌型人白细胞介素1β(shIL-1β)重组表达载体,检测其在H7402肝癌细胞中的表达。方法采用SOE方法将人红细胞生成素(EPO)信号肽序列和编码人白细胞介素(hIL-1β)成熟蛋白的基因序列拼接形成融合基因,与pIRES2-EGFP质粒重组构建shIL-1β真核表达载体pIRES2-EGFP-shIL-1β,利用jetPEI方法将其稳定转染H7402细胞(H7402／shIL-1β),荧光显微镜及RT-PCR检测融合基因的表达水平,间接ELISA方法测定培养上清hIL-1β分泌水平。结果荧光显微镜下观察可见H7402／shIL-1β细胞发出明亮绿色荧光,RT-PCR检测显示pIRES2-EGFP-shIL-1β能够在H7402细胞中稳定表达融合基因mRNA,同时细胞培养上清中hIL-1β表达水平明显上升。结论成功构建了经典途径分泌的hIL-1β重组表达载体,该载体可在H7402细胞中稳定分泌生物活性的hIL-1β。     

探讨AQP1、AQP3及IL-1β在膝关节炎滑膜中的表达及意义

目的:探讨水通道蛋白l(AQP1)、水通道蛋白3(AQP3)和白介素-1β(IL-1β)在膝关节炎滑膜组织中的表达意义及与膝关节滑膜炎症的关系。方法:选取收治的80例膝关节炎患者作为研究对象,采用免疫组织化学法检测患者关节滑膜阻滞中AQP1、AQP3以及IL-1β的表达水平,并采用双盲法测定累积光密度,分析各因子表达水平之间的相关性以及临床意义。结果:不同病情程度的滑膜炎患者AQP1、AQP3及IL-1β指标比较差异存在统计学意义(P<0.05),并且随着病情的加重,AQP1、AQP3及IL-1β指标均呈上升趋势;相关性分析结果显示AQP1、AQP3及IL-1β与滑膜炎症程度分度呈正相关性(P<0.05),AQP1表达与IL-1β表达呈正相关(P<0.05),AQP3表达与IL-1β表达呈正相关(P<0.05)。结论:AQP1、AQP3及IL-1β在滑膜炎的发生发展过程中具有重要的应用,但其具体的临床病理机制仍需进一步深入研究。     

脑卒中患者血清IL-1β、IL-1Ra、IL-1Ra/IL-1β比值的监测及临床意义

目的:研究白细胞介素1β( IL - 1β)、白细胞介素1受体拮抗剂( IL - 1 Ra)以及IL -1 Ra/IL - 1β比值在脑卒中患者血清中的水平变化以及IL- 1β与IL - 1 Ra水平之间的相关关系。方法:用酶联免疫吸附试验检测了5 5例脑梗死患者、48例脑出血患者和60例对照者血清IL - 1β、IL - 1 Ra和IL- 1 Ra/IL - 1β水平。结果:脑梗死组和脑出血组患者血清IL - 1β水平均显著高于正常对照组( P<0 .0 1 ) ;脑梗死组和脑出血组患者血清IL - 1 Ra以及IL - 1 Ra/IL - 1β水平显著低于正常对照组( P<0 .0 1 ) ;脑梗死组和脑出血组患者血清IL- 1β和IL - 1 Ra水平无明显相关性( P>0 .0 5 )。结论:IL - 1β在脑卒中发病过程中可能起着促进作用,而IL - 1 Ra可能起着抑制作用;两者的免疫失调状态可能与脑卒中密切相关;IL - 1 Ra/IL - 1β比值可作为脑卒中病情监测的指标     

TGFβ1和BMP2在人膝骨关节炎滑膜组织中的表达研究

目的探讨转化生长因子(TGF-β1)和骨形成蛋白(BMP2)在人膝骨关节炎滑膜组织中的作用。方法采用免疫组织化学及原位杂交方法在光镜下观察TGFβ1和BMP2在人膝骨关节炎滑膜组织中的表达,以类风湿关节炎及健康意外截肢患者分别作为疾病对照组及正常对照组。结果早期骨关节炎(OA)患者滑膜组织各层TGFβ1蛋白表达与类风湿关节炎(RA)组及正常对照组差异有统计学意义(P<0.05);TGFβ1mRNA在血管周围及滑膜衬里层与RA组差异有统计学意义(P<0.05)。早期OA滑膜组织各层BMP2蛋白及BMP2mRNA表达与正常对照组差异有统计学意义(P<0.05);与RA组差异无统计学意义。早期OA各层TGFβ1、BMP2蛋白的表达与各炎症指标无相关性;早期RA滑膜衬里层TGFβ1蛋白表达与外周血小板计数呈正相关性,早期RA血管周围TGFβ1蛋白表达与炎症指标CRP呈正相关性。结论TGFβ1mRNA以及蛋白在OA的高表达可能成为OA后期骨化过度、骨性强直的原因之一;BMP2在OA滑膜组织各层的高表达推测有可能为OA软骨骨化强直病理变化中重要的“启动子”。     

IL-13受体在白血病Dami细胞中的表达及IL-13对其表达的影响

目的 研究巨核细胞白血病Dami细胞是否表达IL-13受体α1和IL-4受体α以及IL-13对其表达的影响.方法 无血清培养Dami细胞,提取Dami细胞总RNA,反转录,形成第1条cDNA链,PCR扩增,琼脂糖凝胶电泳检测,Quantity One软件分析电泳条带光密度,数据进行统计学处理.结果 Dami细胞表达IL一13 Rα1mRNA.4h IL-13组Dami细胞IL-13Rα.1mRNA的表达明显低于血清组、混合组和空白对照组(P<0.05).12h IL-13组IL-13Rα1mRNA表达与血清组、混合组和空白对照组IL-13Rα1mRNA表达无明显区别(P>0.05).Dami细胞表达IL-4RαmRNA,且不受IL-13的影响.结论 Dami细胞表达IL-13 Rα1 mRNA,IL-13短暂下调Dami细胞IL-13 Rα1 mRNA表达.     

白细胞介素-9及其受体在非小细胞肺癌组织中的表达及临床意义

目的 探讨白细胞介素-9?(IL-9)?及其受体?(IL-9R)?在非小细胞肺癌组织中的表达及其临床意义.方法 收集2017年1月至2018年12月中国医科大学附属盛京医院胸外科110例手术切除并经病理确诊的非小细胞肺癌癌组织及其癌旁正常石蜡包埋组织标本,并收集其中19例非小细胞肺癌的癌组织及其周围正常的新鲜组织标本....     

人白细胞介素1受体拮抗基因的克隆及其在大肠杆菌中的高效表达

目的 获得一株重组人白细胞介素1受体拮抗蛋白的高效表达菌株,为研究各种急慢性炎症疾病的发病机制以及拮抗IL-1的生物学效应奠定基础。方法 分离人外周血淋巴细胞,提取mRNA,反转录PCR获得人白细胞介素1受体拮抗基因（hIL-1ra),克隆人大肠杆菌表达载体。从而构建高效表达人IL-1ra的重组菌株。结果 成功构建了IKL-1ra的高效表达菌株（pLDH-hIL1ra),序列测定与文献报道一致12%SDS-PAGE分析显示此菌株所表达的目的蛋白产物相对分子质量为23ku,与预期结果相符,光密度扫描重组hIL-1ra蛋白质占细菌总蛋白的30%。结论 大肠杆菌中成功地表达了hIL-1ra基因。     

TLE1在滑膜肉瘤中的表达研究

目的:本研究旨在研究滑膜肉瘤组织中TLE1的表达,探讨其在临床病理诊断中的适用性。方法:运用免疫组织化学以及统计学方法对本院2001年至2011年期间手术切除的81例滑膜肉瘤患者进行研究和统计分析。结果:TLE1在滑膜肉瘤中的阳性率为80.2%,在双相型、单相型、差分化型中的阳性率分别为88.8%、78.9%以及68.7%;TLE1在恶性外周神经鞘膜瘤和孤立性纤维性肿瘤中的阳性率分别为12.5%和8.3%。结论:TLE1对于滑膜肉瘤的敏感性和特异性,有助于在滑膜肉瘤与其他类型肿瘤的鉴别诊断中发挥作用。     

pEGFP-N1/hIL-1ra重组真核表达载体的构建及其在人牙龈成纤维细胞中的瞬时表达

目的:构建重组人白细胞介素1受体拮抗剂(rhIL-1ra)基因真核表达载体pEGFP-N1/hIL-1ra,瞬时转染人牙龈成纤维细胞并检测其表达,为牙周炎症的基因治疗提供实验基础。方法:TRIzol法提取人乳腺癌组织总RNA进行RT-PCR,将纯化的扩增产物hIL-1ra与克隆载体pMD18-T连接、转化,测序正确后将重组体pMD18-T/hIL-1ra与真核表达质粒pEGFP-N1分别进行双酶切,连接后转化感受态细菌E.coliTOP10。将构建正确的pEGFP-N1/hIL-1ra重组质粒DNA瞬时转染人牙龈成纤维细胞,荧光显微镜观察绿色荧光的表达,RT-PCR方法检测其基因的表达。结果:构建的pEGFP-N1/hIL-1ra真核表达载体经PCR及双酶切鉴定均表明人IL-1ra基因已与pEGFP-N1正确重组。瞬时转染人牙龈成纤维细胞后能观察到绿色荧光,RT-PCR可得到目的片段。结论:成功构建了重组质粒pEGFP-N1/hIL-1ra,瞬时转染人牙龈成纤维细胞后检测到其基因水平的表达,为炎性细胞因子拮抗剂基因用于牙周炎抗炎治疗奠定了实验基础。     

商陆皂苷甲对兔滑膜细胞产生IL-1和TNF的影响

目的：研究商陆皂苷甲（EsA)对脂多糖（LPS）刺激兔滑莫膜细胞产生白介素1（IL－1）和肿瘤坏死因子（TNF）的影响。方法：用胸腺细胞增殖法和甲L929细胞作靶细胞的生物测定法,分别检测与EsA共育的受LPS刺激的兔滑膜细胞培养上清中IL－1和TNF的含量。结果：EsA在5－40μg/ml范围内能明显抑制LPS诱导兔滑膜细胞产生IL－1和TNF,结论：EsA可抑制滑膜细胞产生IL－1和TNF的作用提示其可能有助于消除类风湿性关节炎的关节炎症。     

pBV-IL-6重组质粒构建及其在E.coli中的高效表达

目的构建人ＩＬ－６重组质粒（ｒｈＩＬ－６），并使其在Ｅ．ｃｏｌｉ中高效表达。②方法经计算机分析设计，人工合成３条寡核苷酸引物，通过定点诱变并优化起始区，应用ＰＣＲ扩增及重组ＤＮＡ技术，构建重组质粒ｐＢＶ－ＩＬ－６，并转化至Ｅ．ｃｏｌｉ宿主菌ＤＨ５α中诱导表达，对产物进行纯化和复性，ＭＴＴ法检测生物活性。③结果获得２种ｒｈＩＬ－６高效表达的Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５α／ｐＢＶ－ＩＬ－６工程菌，一种表达２０．８ｋｕＩＬ－６全蛋白；另一种表达１６．８ｋｕ，Ｎ端缺失２５个氨基酸ＩＬ－６蛋白。薄层密度扫描分析表达产率，前者为２８．３％，后者为３３．４％，且均具有生物学活性。④结论ｒｈＩＬ－６构建成功，并获高效表达     

含HSV-TK基因的真核表达载体的构建及其在HepG2细胞中的表达

目的　构建AFP增强子CMV启动子调控下的HSV -TK真核表达质粒用于肝细胞癌的靶向基因治疗。方法　采用PCR方法从HepG2细胞基因组DNA中扩增AFP基因增强子最小的功能片断 ,插入pcDNA3.1-LUC质粒的BglII位点 ,从而构建重组表达质粒 pAFP -LUC。HSV -TKcDNA全长序列替换pAFP -LUC质粒中EcoRI位点的LuciferasecDNA全序列构建重组表达质粒 pAFP -TK。质粒 pAFP -LUC采用脂质体法转染AFP阳性的肝癌细胞系HepG2及AFP阴性的非肝癌细胞系HeLa ,用Luciferase分析试剂盒分析Luciferase的表达情况。结果　PCR扩增所得AFP增强子片段的长度和序列通过琼脂糖凝胶电泳、DNA测序得到证实。采用限制性内切酶酶切及PCR方法证实质粒pAFP -LUC中插入的AFP增强子大小、位置及方向均正确。酶切后凝胶电泳分析证实HSV -TK已成功地定向克隆入真核表达载体中。Luciferase报道基因的表达受AFP增强子的调控 ,在AFP阳性肝癌细胞HepG2中高效表达 ,而在AFP阴性的HeLa细胞中表达很低 ,这种差异具有显著性 ,P <0 .0 5。结论　AFP增强子CMV启动子调控的HSV -TK真核表达质粒的构建及其在HepG2细胞中的特异性表达为肝细胞癌的靶向基因治疗提供了实验基础。