腺相关病毒载体介导Zs Green基因在体转染大鼠心肌组织的实验研究

目的 观察腺相关病毒载体9型(AAV9)介导Zs Green基因在体转染心肌组织的效果.方法 采用冠状动脉灌注法将携带报告基因Zs Green的腺相关病毒9型(AAV9-Zs Green)以不同滴度(5×106TU,1×107TU)转导至大鼠心肌组织,分别于转染后1、2和4周在荧光显微镜下观察大鼠心肌组织绿色荧光表达情况.结果 病毒载体转染1周后心肌组织可见绿色荧光表达;2周时可见大量绿色荧光表达,荧光强度较1周时明显增强(P＜0.01);4周时荧光强度较2周有所减弱(P＜0.05),但仍有较强表达;随着病毒转导滴度提高,荧光强度明显增加(P＜0.05).结论 腺相关病毒载体能够有效介导Zs Green转染大鼠心肌组织,并长期稳定表达.     

腺相关病毒载体介导ZsGreen基因通过3种转染途径在心肌组织转染效果的比较

目的：采用腺相关病毒（Adeno-associated virus,ＡＡＶ）-9为载体,比较３种转染方法对ZsGreen基因在大鼠心肌组织表达的影响。方法：30只雄性SD大鼠随机分为尾静脉（Tail vein,TV）注射组、心肌（Intramyocardium,IM）注射组、冠脉（Intra－coronary,IC）灌注组,采用相应方法在体转染携带报告基因ZsGreen的腺相关病毒-9型（Adeno-associated virus 9-ZsGreen,AAV9-ZsGreen）。2周后荧光显微镜下观察绿色荧光在大鼠ＩＭ组织的表达情况。结果：TV组ＩＭ有少量绿色荧光分布;IM组绿色荧光表达主要局限在ＩＭ注射位点,注射点周边有少量分布;IC组大量绿色荧光在ＩＭ广泛均匀表达。IM及IC组荧光强度均显著高于TV组（P＜0.01）,IC组荧光强度高于IM组（P＜0.01）。结论：IC灌注法可使ＡＡＶ介导的外源基因在ＩＭ组织高效、广泛、均匀表达,优于TV注射法及ＩＭ注射法。     

两种基因转染方法对外源基因在心肌组织中表达的影响

 【目的】 比较两种基因转染方法对外源基因在心肌组织中表达的影响。【方法】 20只SD大鼠随机分为尾静脉注射(IV)组和心肌内注射(IM)组各10只,分别于冠状动脉结扎前后在体转染携带绿色荧光蛋白报告基因的腺病毒,荧光显微镜下观察绿色荧光在心肌组织中的表达情况。【结果】 术后存活的6只IV组大鼠心肌组织在腺病毒转染后24 h和14 d均观察不到绿色荧光,但在其肝脏组织中检测到大量绿色荧光表达。术后存活的7只IM组大鼠注射部位心肌在腺病毒转染后24 h和14 d均检测到绿色荧光表达,而肝脏组织内未见绿色荧光。【结论】 心肌内注射法能够使外源基因在心脏组织中特异性地高表达,而静脉注射法却不能。     

两种基因转染方法对外源基因在心肌组织中表达的影响

【目的】比较两种基因转染方法对外源基因在心肌组织中表达的影响。【方法】20只SD大鼠随机分为尾静脉注射（IV）组和心肌内注射（IM）组各10只,分别于冠状动脉结扎前后在体转染携带绿色荧光蛋白报告基因的腺病毒,荧光显微镜下观察绿色荧光在心肌组织中的表达情况。【结果】术后存活的6只IV组大鼠心肌组织在腺病毒转染后24h和14d均观察不到绿色荧光,但在其肝脏组织中检测到大量绿色荧光表达。术后存活的7只IM组大鼠注射部位心肌在腺病毒转染后24h和14d均检测到绿色荧光表达,而肝脏组织内未见绿色荧光。【结论】心肌内注射法能够使外源基因在心脏组织中特异性地高表达,而静脉注射法却不能。     

将含有报告基因LacZ的重组腺病毒载体从大鼠鼻腔转移至脑的实验研究

目的 探讨将携带有报告基因的腺病毒载体由鼻腔转移至脑途径的可行性.方法 将携带半乳糖苷酶报告基因(LacZ)的5型重组腺病毒载体(Ad5 CMV LacZ)注入SD大鼠鼻腔黏膜,分别在注射3 d、7 d、14 d、21 d及28 d切取大鼠鼻腔黏膜以及与嗅觉信息传导途径相关的脑组织,进行冰冻切片和β-半乳糖苷酶(β-gal)免疫组织化学反应显色,判断该载体是否转染和表达蛋白质产物.结果 β-gal免疫组化染色反应显示,该病毒载体从第3天起即可在鼻腔黏膜与嗅球内的细胞转染和表达,在第7天至第21天病毒载体逐渐向颅内深部的室管膜下区、杏仁核及齿状回细胞转移和表达,持续性表达蛋白质产物达28 d之久.结论 经鼻腔黏膜注入腺病毒载体不仅可将外源性基因转移到脑实质内,还可确保外源性基因转染和表达成功.     

将含有报告基因LacZ的重组腺病毒载体从大鼠鼻腔转移至脑的实验研究

目的探讨将携带有报告基因的腺病毒载体由鼻腔转移至脑途径的可行性。方法将携带半乳糖苷酶报告基因（LacZ）的5型重组腺病毒载体（Ad5 CMV LacZ）注入SD大鼠鼻腔黏膜,分别在注射3d、7d、14d、21d及28d切取大鼠鼻腔黏膜以及与嗅觉信息传导途径相关的脑组织,进行冰冻切片和β-半乳糖苷酶（β-gal）免疫组织化学反应显色,判断该载体是否转染和表达蛋白质产物。结果β-gal免疫组化染色反应显示,该病毒载体从第3天起即可在鼻腔黏膜与嗅球内的细胞转染和表达,在第7天至第21天病毒载体逐渐向颅内深部的室管膜下区、杏仁核及齿状回细胞转移和表达,持续性表达蛋白质产物达28d之久。结论经鼻腔黏膜注入腺病毒载体不仅可将外源性基因转移到脑实质内,还可确保外源性基因转染和表达成功。     

p38丝裂原激活蛋白激酶基因重组慢病毒载体的构建及其在建立人前列腺癌稳定细胞株中的应用

目的构建p38丝裂原激活蛋白激酶基因(MAPK)重组慢病毒载体并建立表达外源性p38基因的人前列腺癌稳定细胞株。方法采用限制性内切酶酶切、T4 DNA连接酶连接等方法,将EGFP/p38融合基因插入慢病毒载体pTYF-EF1α-IRES-EGFP中,构建启动子EF1α调控的EGFP/p38共表达慢病毒载体pTYF-EF1α-EGFP/p38,经酶切鉴定后,利用慢病毒三质粒系统,通过脂质体法转染包装细胞HEK 293T细胞,收集病毒上清后转导人前列腺癌DU145细胞株,经有限稀释法筛选重组EGFP/p38稳定细胞株,用Western blotting检测细胞总p38的表达,用计数法绘制细胞的生长曲线。结果经酶切鉴定,成功构建EGFP/p38重组慢病毒载体,并包装慢病毒,检测病毒悬液的滴度为4.7×106 TU/ml,利用此病毒悬液感染DU145细胞,成功筛选到EGFP/p38稳定表达细胞株,Western blotting显示该细胞株能稳定表达外源性EGFP/p38融合蛋白,这种过表达p38的细胞株的生长速度明显低于对照组。结论成功构建p38 MAPK重组慢病毒载体并建立了表达外源性p38 MAPK基因的稳定细胞株EGFP/p38-DU145,细胞内p38过表达能够抑制DU145细胞的增殖。     

经冠状动脉转染转化生长因子-β1基因对大鼠移植心脏缺血-再灌注损伤的影响

目的:探讨经冠状动脉转染重组腺病毒介导的转化生长因子-β1(TGF-β1)基因对大鼠移植心脏缺血-再灌注损伤的影响.方法:利用Cuff技术建立颈部异位心脏移植模型.转基因组供心离体灌注含5×109 pfu/gm携带mTGF-β1基因腺病毒颗粒的4℃ Stanford大学停跳液,空白对照组灌注4 ℃ Stanford大学停跳液,空载体组灌注含5×109 pfu/gm空白载体的4℃ Stanford大学停跳液.移植术后8 h切取移植心脏,电镜下观察移植物超微结构.免疫组化染色检测移植物mTGF-β1、细胞间黏附分子-1(ICAM-1)及核因子-κB(NF-κB)的表达.结果:移植后8 h,与其他2组相比,转基因组心肌细胞肿胀减轻,炎性细胞浸润减少,心肌线粒体水肿明显减轻,无明显的肌丝断裂现象.空白对照组与空载体组无外源性mTGF-β1蛋白的表达,转基因组有mTGF-β1的表达.3组间相比,心肌组织ICAM-1与NF-κB的表达差异有统计学意义(F=23.8,P=0.008;F=36.7,P=0.007).转基因组ICAM-1与NF-κB的表达较空白对照组与空载体组降低(P＜0.01).结论:经冠状动脉灌注重组腺病毒介导的TGF-β1基因能减轻移植心脏缺血-再灌注损伤,其机制可能与下调ICAM-1及NF-κB的表达有关.     

IDO基因转染延长同种异基因大鼠移植心脏的存活

目的:了解逆转录基因载体介导的吲哚胺-2,3-加双氧酶(IDO)基因转染能否延长同种异基因大鼠移植心脏的存活时间及机理。方法:把同种异基因大鼠心脏移植模型(Lewis→BN)分成4组,A组为对照组,同种异基因大鼠心脏移植(Lewis→BN);B组:IDO基因转染后的供体心脏移植给受体大鼠;C组:空载体转染供体心脏,再移植给受体大鼠;D组:同种异基因大鼠心脏移植 CsA组(CsA5mg/kg/d×7天)。观察记录移植心脏的存活时间及术后6天组织病理学检查明确排斥反应的诊断和分级,RT-PCR检测术后6天移植心脏TNF-α的mRNA表达,FCM检测外周血活化的T细胞(CD3 CD25 )、有核细胞CD86 表达等方法探讨其机理。结果:A、B、C、D组移植心脏平均存活时间为7.2±0.45、13.2±2.16、7.1±0.62和15.6±3.21天,其中B、D组术后6天CD3 CD25 、有核细胞CD86 表达、供心组织急性排斥反应的强度和TNF-α的mRNA表达较A、C组显著降低(P<0.05),A、C组具有典型重度急性排斥反应特征而B、D组最轻。结论:逆转录基因载体介导的IDO基因转染能够延长移植心脏存活时间的作用,其机理包括抑制反应性T细胞、抑制有核细胞共刺激信号CD86表达、抑制心肌组织表达TNF-α等。     

p38丝裂原激活蛋白激酶基因重组慢病毒载体的构建及其在建立人前列腺癌稳定细胞株中的应用

摘要：目的构建p38 丝裂原激活蛋白激酶基因（MAPK）重组慢病毒载体并建立表达外源性p38 基因的人前列腺癌稳定细胞
株。方法采用限制性内切酶酶切、T4 DNA 连接酶连接等方法,将EGFP/p38 融合基因插入慢病毒载体pTYFEF1α-
IRES-EGFP中,构建启动子EF1α调控的EGFP/p38共表达慢病毒载体pTYF-EF1α-EGFP/p38,经酶切鉴定后,利用慢病毒
三质粒系统,通过脂质体法转染包装细胞HEK 293T细胞,收集病毒上清后转导人前列腺癌DU145细胞株,经有限稀释法筛选
重组EGFP/p38稳定细胞株,用Western blotting检测细胞总p38的表达,用计数法绘制细胞的生长曲线。结果经酶切鉴定,成
功构建EGFP/p38重组慢病毒载体,并包装慢病毒,检测病毒悬液的滴度为4.7×106 TU/ml,利用此病毒悬液感染DU145细胞,成
功筛选到EGFP/p38稳定表达细胞株,Western blotting显示该细胞株能稳定表达外源性EGFP/p38融合蛋白,这种过表达p38的
细胞株的生长速度明显低于对照组。结论成功构建p38 MAPK重组慢病毒载体并建立了表达外源性p38 MAPK基因的稳定
细胞株EGFP/p38-DU145,细胞内p38过表达能够抑制DU145细胞的增殖。
     

冠脉内导入重组β-半乳糖苷酶腺病毒的实验研究

目的 :研究经冠状动脉内导入重组 β-gal腺病毒后心肌的转染效率 ,证明冠脉内导入途径是否为重组基因导入心脏的有效的可行的途径。方法 :用定向克隆的方法构建重组 β -gal腺病毒载体 ,将 1 .53× 1 0 1 2 pfu重组 β-gal腺病毒经冠状动脉造影导管由左冠状动脉分别导入到 7只雄性Yorkshire猪心脏中 ,于术后 1周、2周、4周及 8周处死动物 ,取左右冠状动脉、3～ 5mm厚的不同部位的心肌及各实质脏器标本 ,经 1 .2 5 %戊二醛固定 2 0min ,用PBS洗涤 3次 ,在室温下用X -gal染液染色 1 6～ 2 4h ,脱水、石蜡包埋、切片及HE复染 ,光镜下计算出表达 β -gal的心肌细胞百分数即为转染效率。结果 :经冠状动脉内导入重组基因后 ,于术后 1周即有 β-gal表达 ,2周达高峰 ,心肌细胞的转染效率高达 45 .57% ,全层左冠状动脉壁、心肌间质中均有 β-gal表达 ,4周 β-gal表达下降 ,8周 β -gal恢复至对照组的基线水平。结论 :经冠状动脉内导入重组腺病毒 ,心肌细胞及冠脉壁重组基因表达效率高 ,说明冠状动脉内导入重组目的基因将是冠心病基因治疗中有效的可行的方法     

MISE AU POINT D'UNE TECHNIQUE D'ADMINISTRATION IN VIVO DES VECTEURS GENETIQUES DANS LEMUSCLE CARDIAQUE

Objective In order to improve the in vivo gene transfer into the heart muscle, we have designed a ECG-synchronized microinjection system that allows sequential gene delivery to the myocardium.Methods A cannula was introduced into the right carotid artery of the Wistar rat under general anesthesia.With the ECG-synchronized injection during diastole, the genetic vector (Ad CMV lacZ ) infusion was performed with various concentrations( l07 ～ l010pfu ) and different frequency ( the ratio of heart beats per injection from 1: 1 to 4: 1 ). The hearts of the rats were removed after 7 days for histological examination. Results Best results were obtained with a total vector amount of l09 pfu and a good ratio 3: 1 between heart frequency and injection frequency. The transfection efficiency was increased by use of vasodilators and by an increase of vascular permeability. No signs of myocardial ischemia or ventricular arrythmia were observed. Conclusion We have established a novel and safe method for in vivo gene transfer into the heart. Transgene expression suggests that this method may be useful technique to study cardiac function of treat cardiac diseases by means of gene theratpy.     

经冠脉自体骨髓单个核细胞移植对扩张型心肌病兔心功能的影响

目的 建立扩张型心肌病(DCM)新西兰兔经冠脉自体骨髓单个核细胞(BMNNCs)移植模型,旨在评价BMMNCs移植对阿霉素心肌病兔心功能的影响.方法 经耳缘静脉注射盐酸阿霉素建立新西兰兔DCM模型,HE染色和天狼猩红染色观察心肌组织形态学特点,透射电镜观察心肌组织超微结构的改变,明确造模成功.将存活兔随机分为经冠脉移植组(n=10)和对照组(n=10),用密度梯度离心法分离自体BMMNCs,经塑形的4F造影导管,模拟临床冠脉内输注BMMNCs悬液,建立新西兰兔经冠脉自体BMMNCs移植方法.移植4周后,血流动力学指标测定和兔血清脑钠素(BNP)检测评价DCM兔心功能的改变.结果 模型组新西兰兔心肌组织形态学和超微结构的改变符合DCM的特征,BMMNCs移植4周后,经冠脉移植组与对照组比较,血流动力学指标和血清BNP的改变均具有统计学意义.结论 自体BMMNCs移植能够显著改善阿霉素心肌病新西兰兔的心功能.     

经冠状动脉移植同种异体脐带间充质干细胞治疗猪心肌梗死的实验研究

目的：探讨经冠状动脉移植同种异体脐带间充质干细胞治疗急性心肌梗死（AMI）的可行性及疗效。方法采用经皮球囊封堵法制备 AMI 模型,AMI 后2周将 GFP 标记的脐带间充质干细胞经冠状动脉移植入小型猪心肌梗死区域（移植组）,对照组注射等量生理盐水。分别于干细胞移植前、移植后6周行心脏超声和核素门控心肌灌注显像检查,观察心肌灌注的改善及心功能的变化情况。取心肌梗死区组织作冰冻切片,vWF 免疫组织化学法染色观察梗死区毛细血管新生情况。结果（1）对照组：心肌梗死后8周和心肌梗死后2周比较,各项指标均无显著改善（P ＞0．05）。移植组：干细胞移植后6周左室射血分数、左室收缩期末内径、左室舒张末期内径、左室短轴缩短率及左室心肌梗死面积均较移植前有明显改善（P ＜0．05）。与对照组比较,移植组各项指标均明显改善（P ＜0．05）。（2）vWF 免疫组织化学法染色显示移植组新生毛细血管密度高于对照组。结论经冠状动脉移植的同种异体脐带间充质干细胞能够在梗死心肌内存活,增加梗死区血管新生,缩小梗死面积,改善心功能。     

CTLA4Ig表达质粒的基因枪转染皮肤及细胞的实验研究

目的 利用基因枪技术提高CTLA4Ig的cDNA的转染效率。方法 设基因枪局部转染组，注射器局部注射组和肌肉注射组，并构建pCTLA4Ig-IRES2-EGFP表达载体，将质粒注射入皮肤，观察三种方法转移CTLA4Ig目的DNA的存留时间。同时，体外培养ECV，293细胞，用基因枪或逆转录病毒载体转染上述质粒，观察质粒的转染及表达情况。结果 基因枪转移基因至细胞，皮肤的效率明显好于其他方法，但对细胞，基因枪的初始压力不能太高，否则，细胞容易死亡。结论 基因枪转染CTLA4Ig质粒效率较高。     

Comparative study of catheter-mediated gene transfer into heart

ObjectiveTo investigate the feasibility and features of 3 catheter-mediated approaches of gene transfer into heart, including direct myocardial injection (DMI), coronary artery perfusion (CAP), and intrapericardial cavity injection (ICI).MethodsFifteen dogs were used, and 03ml (1×10［9］ pfu) of an adenovirus (Adex1SR LacZ) was injected into the heart by 3 methods.The dogs were killed 5 days following injection, and gene expressions in heart and liver were evaluated by histochemical analysis.ResultsThe results showed that ① the CAP method was relatively less damaging and induced sparse LacZ expression in the myocardium, and the gene expression was also foundin both vessels within the myocardium and liver; ② gene transfer by DMI resulted in intense LacZ expression around the injection accompanied by a local inflammatory response; ③ LacZ expression elicited by ICI was detected in either the inner surface of the parietal pericardium or epicardial surface of the heart,and also in the myocardium underlying the visceral pericardium.ConclusionThree catheter-mediated methods of gene transfer into the heart may be used and a reasonable approach should be chosen according to purpose     

经冠状动脉骨髓单个核细胞移植治疗缺血性心脏病二年随访

目的观察经冠状动脉自体骨髓单个核细胞（BMMC）移植治疗缺血性心脏病的长期效果及安全性。方法76例缺血性心脏病病人。其中BMMC移植者52例,包括急性心肌梗死（AMI）26例,慢性缺血性心力衰竭（CIHF）26例,对照24例（AMI10例,CIHF14例）。对照组：常规治疗（药物及介入治疗）;移植组：在常规治疗基础上加经冠状动脉自体BMMC移植。细胞移植方法：于髂后上嵴抽取骨髓,梯度密度法分离获得BMMC,将细胞悬液调为2×10^6/ml浓度,超选择性经梗死相关冠状动脉气囊充盈下高压注入BMMC,重复注入6—8次,或经冠状动脉选择性移植,气囊未充盈下高压注入移植细胞。随访观察临床及实验室指标,二维超声心动图,正电子发射体层心肌显象。结果52例完成2年随访。AMI病人BMMC移植后1年左室射血分数（LVEF）比术前增加了5．8％（53．9％±2．9％vs59．7％±1．5％,P〈0．05）,2年增加了3．8％（57．7％±1．7％,P〉0．05）,对照组LVEF减低,但差异无统计学意义。左室舒张末容量（LVEDV）、左室收缩末容量（LVESV）无显著改善。移植组2年心肌代谢缺损区与3个月比较无变化;BMMC移植组与术前相比差异有统计学意义（P〈0．05）。CIHF病人BMMC移植后1年、2年LVEF与术前比较分别增加了8．8％、9．2％（P〈0．01）,LVESV下降20．4％、27．8％（均P〈0．05）,2年心肌代谢缺损区与3个月比较无变化;对照组心功能明显恶化。Holter检测未发现新的心律失常。结论BMMC治疗可明显改善CIHF病人的心功能。而对AMI病人并无左室收缩功能改善的长期效果,仅限制了心室重塑。     

绿色荧光蛋白基因在白血病细胞K562中的转导效率

目的：探讨慢病毒载体在白血病细胞中的基因转导效率,为白血病基因治疗提供关键依据。方法：应用1型人类免疫缺陷病毒(HIV-1)改造而成的第3代自身失活(SIN）慢病毒载体（lentiviral vector）系统,与鼠白血病病毒（MLV）SIN载体进行比较,通过荧光显微镜观察细胞内标记基因绿色荧光蛋白（GFP）的表达情况,应用流式细胞术检测基因导入细胞百分比,评价两种载体系统在人白血病细胞系K562中的基因转导效率。结果：通过荧光显微镜可定性观察GFP在K562细胞中的表达情况,在同样的基因转导条件下,HIV载体转导的白血病细胞中被转导的标记基因GFP的表达强度及GFP阳性细胞数明显高于MLV载体转导的细胞。流式细胞仪定量检测HIV载体的转导效率接近100%,而MLV低于40%,两组间转导效率比较差异有显著性（P＜0.05）。结论：基于慢病毒载体基因转导的高效性,该载体系统可作为白血病细胞基因转导的极好工具。     

绿色荧光蛋白腺病毒表达载体在肌源性干细胞移植修复脊髓损伤实验中的应用

目的:观察绿色荧光蛋白腺病毒表达载体在肌源性干细胞移植修复脊髓损伤实验中的应用。方法:40只成年SD大鼠随机分为移植组(n=20)和对照组(n=20),均进行脊髓半切损伤。伤后9d,移植组于伤处移植体外转染GFP基因的大鼠MDSCs,而对照组仅注射等量PBS,于移植后1、2、3、4周用BBB评分方法测大鼠的运动功能,同时进行损伤脊髓取材、快速冰冻切片进行荧光显微镜观察。结果:移植后1周两组动物运动功能恢复无明显差异;移植后2、3、4周与对照组比较,移植组显著提高运动功能;荧光显微镜观察经绿色荧光蛋白基因标记的肌源性干细胞在损伤脊髓组织局部生长良好,并且有沿着脊髓神经束向头尾两侧迁移的趋势。结论:携带绿色荧光蛋白基因的腺病毒表达载体的细胞标记方法是安全可靠、简便有效的生物示踪标记方法,可以用于标记细胞移植实验研究。     

经冠状动脉化学消蚀法心肌病理改变及其发生机理

本实验观察22条犬经冠状动脉注射96％乙醇后心肌病理改变及其发生机理,结果实验犬经冠状动脉注射乙醇后均出现不同程度的心肌坏死及冠状动脉内血栓形成.提示心肌损伤可能由乙醇对心肌组织的直接作用和乙醇使冠状动脉内皮损伤,进而使血栓形成,心肌缺血两方面原因所致,急性期内心肌坏死可能以前者为主,晚期则以后者为主。