人疱疹病毒8编码的趋化因子vMIP-Ⅱ在大肠杆菌的优化表达

目的：探讨优化vMIP-Ⅱ/MBP融合蛋白表达载体pMal在原核细胞中的表达条件，并对其表达产物进行纯化。方法：通过接菌，诱导表达，实验了解诱导时不同的温度，诱导时间，IPTG浓度对蛋白表达量的影响，并进行SDS-聚丙烯酰氨凝胶（SDS-PAGE）电泳分析。结果：发现该菌在含0.3mmol/L IPTG的TB培养基中，28℃诱导表达4h，可使诱导蛋白表达达量占菌体蛋白总量的10%。结论：vMIP-Ⅱ/MBP的表达受温度条件影响较大，低温诱导时表达水平较高，从而为该工程菌的中试提供了实验基础。     

vMIP-II肽在大肠杆菌中的双辅助子高效表达

目的 :构建病毒趋化因子 (vMIP -II)基因表达载体并在大肠杆菌中以辅助折叠和辅助阻遏方式高效表达vMIP -II重组肽 .方法 :用PCR法获得vMIP -II基因片断 ,将其插入表达载体pQE ,构建重组表达载体pEh -vMIP .表达载体、辅助折叠子和辅助阻遏子载体共转染大肠杆菌DH5α ,用酶切、DNA测序、PCR扩增鉴定阳性克隆 .结果 :阳性重组子在大肠杆菌细胞中经IPTG诱导可高效表达vMIP -II重组肽 ,蛋白电泳分析可观察到一相对分子质量与理论值相符 (约 8× 10 3)的诱导表达条带 ,其表达量约占菌体总蛋白的 2 0 % .分析表明 ,vMIP -II重组肽主要以可溶性形式表达 .结论 :用双辅助技术在大肠杆菌中高效表达较小相对分子质量vMIP -II的成功 ,为进一步研究vMIP -II的功能及应用奠定基础 ,也为同类小分子、易降解的肽类物提供基因工程表达方法     

VMIP—Ⅱ肽在大肠杆菌中的双辅助助子高效表达

目的构建病毒趋化因子(vMIP-II)基因表达载体并在大肠杆菌中以辅助折叠和辅助阻遏方式高效表达vMIP-II重组肽. 方法用PCR法获得vMIP-II基因片断,将其插入表达载体pQE,构建重组表达载体pEh-vMIP. 表达载体、辅助折叠子和辅助阻遏子载体共转染大肠杆菌DH5α,用酶切、DNA测序、PCR扩增鉴定阳性克隆. 结果阳性重组子在大肠杆菌细胞中经IPTG诱导可高效表达vMIP-II重组肽,蛋白电泳分析可观察到一相对分子质量与理论值相符(约8×103)的诱导表达条带, 其表达量约占菌体总蛋白的20%. 分析表明,vMIP-II重组肽主要以可溶性形式表达. 结论用双辅助技术在大肠杆菌中高效表达较小相对分子质量vMIP-II的成功,为进一步研究vMIP-II的功能及应用奠定基础,也为同类小分子、易降解的肽类物提供基因工程表达方法.     

5‘端序列对hGM—CSF在大肠杆菌中表达水平的影响

设计交购构建了三种起始密码子ＡＴＧ上下游不同序列的人ＧＭ－ＣＳＦ原核表达质粒，对其核苷酸序列进行了分析验证后、使它们分别在大肠杆菌中表达了人ＧＭ－ＣＳＦ。结果表明，：ｐＬＧＭ３对ＧＭ－ＣＳＦ的表达量比ｐＬＧＭ１高的６倍，比ｐＬＧＭ伉约３倍。     

突变人GM-CSF基因在大肠杆菌中的表达及纯化

目的构建重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)的高效表达质粒,将其表达产物用于分离纯化的研究。方法用人外周血单核细胞获得总RNA作为模板和修饰的5′端密码子的引物经RT-PCR反应扩增到人GM-CSF基因,插入温控表达载体pDH构建了突变的hGM-CSF表达质粒,并将在E.coli中获得表达的突变rhGM-CSF包含体8 mol/L脲提取液进一步用离子交换色谱柱分离纯化。结果rhGM-CSF在大肠杆菌表达占菌体总蛋白量的22%,用弱阴离子交换色谱对rhGM-CSF的工程菌表达产物8 mol/L脲提取液直接经35 m in分离纯化,所得产物纯度可达95%,质量回收率可达到60%。结论这表明用离子交换色谱可进行rhGM-CSF的复性与同时纯化。     

5＇端序列对hGM－CSF在大肠杆菌中表达水平的影响

设计并构建了三种起始密码子ＡＴＧ上下游不同序列的人ＧＭ－ＣＳＦ原核表达质粒，对其核苷酸序列进行分析验证后，使它们分别在大肠杆菌中表达了人ＧＭ－ＣＳＦ．结果表明：ｐＬＧＭ３对ＧＭ－ＣＳＦ的表达量比ｐＬＧＭ１高约６倍，比ｐＬＧＭ２高约３倍．     

人肠激酶轻链基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

研究目的：克隆表达人肠激酶轻链编码基因,以期应用于融合蛋白的切割与纯化．方法：从人的全基因组中扩增出编码人肠激酶轻链的5个外显子基因片段,经过酶切、连接后得到正确编码的人肠激酶轻链完整基因序列;随后,将目的基因片段插入原核表达载体pBV220中,构建成融合型表达载体pBV—EKL,转化大肠杆菌BL21（DE3）,调节温度至42℃诱导重组蛋白表达;通过镍亲和层析纯化得到重组蛋白．结果：所表达的重组蛋白经SDS—PAGE分析,相对表观分子质量约为31kDa,表达量占菌体总可溶蛋白量的46％;通过镍亲和层析纯化得到的重组蛋白经复性后显示出具有催化切割活性．结论：成功构建了能大量表达重组人肠激酶轻链的菌株,为进一步进行重组人肠激酶活性的研究及其在生产和医学方面的应用研究奠定了基础．     

人PSF蛋白结合长非编码RNA的筛选及鉴定

通过RNA亲和层析（RNA affinity chromatograph）,4种可能与人PSF（human polypyrimidine tractbinding proteinassociated splicing factor,hPSF）蛋白结合的长非编码RNA（long noncoding RNA,lncRNA）片段在人黑色素瘤细胞yusac细胞核RNA文库中被筛选得到. 它们分别定位于人内源性逆转座子L1PA16、MER11C、非编码基因MALAT1以及一个未知基因(unknown g     

人组织型纤溶酶原激活剂（t—PA）在大肠杆菌中的表达、复性及分离纯化

人组织型纤溶酶原激活剂（ｔ—ＰＡ）。ＤＮＡ重组在表达质粒ｐＤＲ７２０中，在Ｅ．ｃｏｌｉＣ６００中获得了表达，表达水平为２％．以醋酸钟显色ＰＡＧＥ凝胶回收ｔ—ＰＡ表达条带，进行复性处理．Ｒ性产物经Ｂｅｎｚａｍｉｄｉｎｅ—Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ，Ｌｙｓｉｎｅ—Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ亲和层析，纯化得到ＳＤＳ—ＰＡＧＥ银染一条带纯度，比活为为４，０００ｍｏｌ／ｓ·ｇ的人ｔ—ＰＡ．     

重组人成纤维细胞生长因子-8a在大肠杆菌中的可溶性表达

通过低温诱导,成功实现了重组人成纤维细胞生长因子-8a蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达.进一步研究了温度、IPTC浓度、诱导时长、诱导时期(OD600)、培养基类型这5个因素对重组人成纤维细胞生长因子-8a蛋白可溶性表达的影响,确定了可溶性表达最优化条件.优化表达条件后实现可溶性表达率大干30%.     

小鼠酪氨酸酶的克隆及在大肠杆菌中的表达

采用逆转录-聚合酶链式反应(RT -PCR)方法,从小鼠黑色素瘤总RNA中扩增得到小鼠酪氨酸酶的cDNA .该基因重组到T7启动子控制下的表达载体pET - 2 2b(+)中,构建表达质粒pET -TYR并转化大肠杆菌Rosetta (DE3) .SDS -PAGE及蛋白质序列测定表明,经0 .8mmol/L异丙基硫代- β-D -半乳糖苷(IPTG)诱导后,可高效表达重组的小鼠酪氨酸酶,表达量约占菌体总蛋白质的2 5 % ,表达产物为包涵体     

大肠杆菌不同表达水平基因之间的关联模式

以密码子适应性指数(CAI)作为描述基因表达水平特征的参数，运用信息论的方法研究了大肠杆菌不同表达水平的双基因间的关联强度；统计分析了各种3基因模式、4基因模式和6基因模式出现的相对使用频率．结果发现：同等表达水平的基因组成的模式不仅关联性很强，而且其相对使用频率也很高，而相反表达水平的基因组成的模式虽然基因问关联性也较强，但其对应的相对使用频率很低．     

中段密码子序列对目的蛋白在大肠杆菌中表达的影响

通过调整表达翻译肽链中段Asp—Pro—Pro三个氨基酸的密码子的序列,观察其对目的蛋白在大肠杆菌中表达的影响。用PCR方法分别在rhBMP4-m基因的5’端加上编码Asp-Pro—Pro酸水解肽的不同简并码序列,克隆入原核融合表达载体pRSET中进行诱导表达,SDS—PAGE分析,观察融合蛋白的表达效果。成功构建9个不同简并码序列的融合表达载体;经诱导表达分析,只有在两个脯氨酸的密码子均为CCG时,融合蛋白才能正常表达,说明改变表达肽链中段氨基酸密码子的碱基序列可以影响融合蛋白的表达效果。     

两种质粒编码的Borrelia burgdorfei寡肽结合蛋白(OppA)的表达和纯化

为了弄清Borrelia burgdorferi中OppA4和OppA5蛋白的生物学功能,oppAIV和oppAV基因分别被克隆并在大肠杆菌中表达．大肠杆菌BL21CodonPlus（DE3）-RIL被用来克服由A＋T丰富引起的密码偏差,十二烷基-β—D-麦芽糖苷和甘油分别用于提高脂蛋白的分离效果和维护蛋白的稳定性．经过金属离子亲和层析,OppA4和OppA5纯蛋白产量可达到1mg／L细胞以上．     

外源基因在大肠杆菌中表达的优化

大肠杆菌已经被广泛地应用于表达各种外源基因,但基因的表达受多种因素的影响,现就各种影响因素综述了外源基因表达的优化策略,这将有助于采取有效方法提高外源基因在大肠杆菌中的表达效率.     

大肠杆菌SD序列与基因表达水平的关系

依据基因表达水平的理论预测方法从１３７３个大肠杆菌基因中选出了７３个甚高表达基因和１００个甚低表达基因,研究了这两类基因编码区起始密码子ＡＴＧ前－１到－２１位点（包含ＳＤ序列）的碱基构成与基因表达水平的关系。结果表明,ＳＤ序列中的富嘌呤区（约在－７到－１２位点）Ｇ和Ｔ的概率分布曲线中心到ＡＴＧ的距离（记为ＬＨ）与基因表达水平有明显的关系。甚高表达基因ＬＨ约为１０,甚低表达基因的ＬＨ约为８,另外在－     

大肠杆菌二硫键异构酶DsbA和脯氨酸异构酶PPIaseA双顺反子表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达

用ＰＣＲ方法获得大肠杆菌二硫键异构酶ＤｓｂＡ的编码基因ｄｓｂＡ和大肠杆菌脯氨酸异构酶ＰＰＩａｓｅＡ的编码基因ｒｏｔ,并将ＤｓｂＡ和ｒｏｔ以双顺反子形式克隆至含有Ｐｔａｃ启动子的表达载体ｐＫＫ２３３－２中。在ＩＰＴＧ的诱导下,ＤｓｂＡ和ＰＰＩａｓｅＡ获得了表达。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和薄层扫描分析表明：ＤｓｂＡ、ＰＰＩａｓｅＡ的表达水平分别为占菌体裂解上清液总蛋白质的４．３２％和４．０６％。